淡水産二枚貝の生理化学的研究Ⅴ : イケチョウガイ精子の呼吸における内在基質について

全文

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淡 水 産二 枚 貝 の生理 化 学 的研 究 一V

イ ケ チ ョ ウ ガ イ 精 子 の 呼 吸 に お け る内 在 基 質 に つ い て

Physiological  Chemistry  of  the  Fresh・Water  Bivalves・ ・V

,

Endogenous  Substrates  of  Respiration  in  the  Spermatozoa  of  Hyriopsis ∬ 〃8981',mother  of  pearl  oyster

Satoru  Higashi 曾   精 子 は 適 当 な 条 件 の も と で 活 濃 な 運 動 を 営 む こ と は よ く知 られ て い る が,そ の 活 動 の エ ネ ル ギ ー 源 を 外 部 か ら得 て い る 場 合 と,内 在 基 質 を 利 用 し て い る 場 合 が あ る 。 体 内 受 精 を す る 哺 乳 動 物 の 精 子 は,清 清 に 炭 水 化 物 が 多 量 に 含 ま れ て い て,無 気 的 に も好 気 的 に も 活 溌 な 運 動 を 行 う こ と が 出 来 る が,こ の 清 清 を と り 除 い て し ま う と,酸 素 が あ る 場 合 に の み 生 存 出 来 る よ う に な る 。 ・こ れ は,精 子 自体 の 細 胞 内 構 成 物 質 を 運 動 の エ ネ ル ギ ー 源 と し て 好 気 的 に 酸 化 す る よ う に な る た あ で あ る 。 貝 類 の よ う な 水 棲 動 物 で は, 産 卵 期 に 水 中 に 放 出 さ れ た 精 子 は 浮 遊 し な が ら 一 定 期 間 活 動 す る こ と が 出 来 る の で あ る が,こ の 間 の エ ネ ル ギ ー 源 は 水 中 か ら得 る こ と は 出 来 な い 。 従 っ て,精 子 自体 の 基 質 が そ の 主 な 呼 吸 の エ ネ ル ギ ー 源 と 考 え る べ き で あ る 。   こ れ ま で の 研 究 に よ れ ば,呼 吸 の 内 在 基 質 と し て 糖 質 を 利 用 す る とす る 説 と,燐 脂 質 を 利 用

す る と す る 説 が あ る 。Barron  and  Goldingerl),

Hayashi2),  Spikes')は ウ ニ 精 子 に つ い て,そ の

RQと 糖 量 を 測 定 し て,消 費 さ れ る も の は 炭 水

化 物 の み で あ る と 考 え た 。 こ れ に 反 し,Lardy

and Philips4)は 牛 精 子 に つ き, Rothschild  and

Cleland5),  Mohri6)は ウ ニ 精 子 に つ き,  Bern・

stein?)は カ エ ル 精 子 に つ き,そ の 酸 素 消 費 量 の

変 化 と 燐 脂 質 の 減 少 と か ら,ウ ニ や カ エ ル 精 子

の 主 な エ ネ ル ギ ー 源 は 燐 脂 質 で あ る と し た 。

Hartree  and  Mann')Lovern  et a19)は 洗 滌 し

た 羊 精 子 で は,燐 脂 質 の 一 種 の   Plasmalogen が 好 気 的 代 謝 の 主 な 基 質 で あ る と報 告 し て い る 。   一 方,吉 田,川 越10),Bornstein  and Steberlu), Norman  et all')は,馬 精 子 の 運 動 に よ る 燐 脂 質 の 増 減 を 測 定 した が 有 意 義 な 変 化 は 認 め られ な か っ た と 云 う。   以 上 の よ う に,哺 乳 動 物 や ウ ニ 精 子 に 関 して は,好 気 的 代 謝 に お け る 呼 吸 の 内 在 基 質 に つ い て 多 く の 研 究 が 報 告 さ れ て い る が,貝 類 に つ い て は 海 産 の カ キ 精 子 以 外 は あ ま り発 表 さ れ て い な い 。   筆 者 は,び わ 湖 特 産 種 で あ り,か つ 淡 水 真 珠 母 貝 と して 重 要 な イ ケ チ ョ ウ ガ イ 精 子 に つ き, 呼 吸 に お け る 内 在 基 質 を 明 らか に す る た あ に 以 下 の 実 験 を 行 っ た 。

実験材 料および方法

  昭 和37年3月 び わ 湖 南 部 で 採 集 し た 殻 長10∼ 12cmの 成 熟 し た イ ケ チ ョ ウ ガ イ の 雄 を 用 い た 。 材 料 は 現 場 よ り 持 ち 帰 っ た 後,閉 殻 筋 を メ ス で 切 り 放 っ て,精 巣 を 切 開 し,流 出 し て く る 精 液 を 集 あ,ま ず モ ス リ ン布 で 酒 過 す る 。 次 に10℃ に 冷 し な が ら1,500r.p.m.で10分 間 遠 沈 して 上 液 を 捨 て,沈 澱 部 に 淡 水 二 枚 貝 用 生 理 塩 液 を 加 え て 液 量 が 元 の もの と 等 し く な る よ う に 調 節 し,こ れ を 再 び1,500r.p.m。 で2分 間 遠 沈 し て 沈 澱 部 に 上 層 と 等 量 の 生 理 塩 液 を 加 え て 浮 遊 さ し た もの を 精 子 浮 遊 液 原 液 と した 。 呼 吸 の 測 定 に は,生 理 塩 液 で さ ら に5倍 に 希 釈 し て,こ れ に50単 位/1ml.の ペ ニ シ リ ン を 添 加 し た も

(2)

70

滋 大 紀 要

第    13  号 1963 の を 用 い た 。 精 子 数 はThomaの 血 球 計 を 用 い て 算 定 した 。 酸 素 の 吸 収 の 測 定 に はWarburgの 検 圧 計 を 用 い20℃ で7時 間 保 温 振 と う し た 。 反 応 容 器 に は 小 型 の 全 量 約15m1の も の を 使 用 した 。   燐 酸 化 合 物 はSchneider")の 方 法 に従 っ て 分 画 し,各 面 分 の 燐 はKing's)法 で 測 定 した 。 無 機 燐 酸 とATPはSchneider法 の 酸 溶 性 燐 画 分 か ら一 部 と りBarth  and Jaegerl6)法 に よ り 分 析 し た 。 遊 離 燐 脂 質 の 測 定 に は 冷 エ ー テ ル で 4度 抽 出 して 燐 を 測 定,全 燐 脂 質 は エ タ ノ ー ル で3度,沸 騰 エ タ ノ ー ル ー エ ー テ ル(3:1) で3度 抽 出 して 燐 を 測 定 し た 。 糠 星 の 定 量 に は ア ン ス ロ ン法17)お よ び フ ェ ノ ー ル 硫 酸 法18)を 用 い た 。

実験結果お よび考察

  イ ケ チ ョウ ガイ 精 子 の呼 吸 は Ω。2で1.0前 後

で,同

じ水 棲 無 脊 椎 動 物で もウ ニ や カキ の精 子

に く らべ 呼 吸 は は るか に低 い が,極 め て 低 濃 度

の青 酸 に よ って も呼 吸 と運 動 が 同 時 に阻 害 され

る こと よ り,そ の 活澱 な運 動 の エ ネル ギ ー は 好

気 的代 謝 に 大 部 分 が 依 存 して い る と 考 え られ

る19)。イ ケ チ ョウ ガ イ精 子 の 呼 吸 の 内在 基 質 を

知 る 目的 で,運 動 と燐 脂質 お よ び 糖 の 変 化 と の

関 係 を しらべ た。

1)精

子 の運 動 に よ る 燐酸 化 合物 画 分 の 変 化

精 子 原 液 を 約5倍

に 希 釈 した もの2ml.を

Warburgの

反 応 容 器 に入 れ,7時

間20℃ で 保

温振 邊 させ た 後,と

り出 して 燐 酸 化 合 物 画 分 の

変 化 を しらべ た(第1表)。

  この 表 か ら明 らか な よ う に,核 酸 お よ び燐 蛋

白 は大 体 一 定 で あ る。 これ に反 して,燐 脂 質 は

減少 し,酸 溶 性 燐 が 増 加 して い る。 ま た,無 機

燐 酸 は 相 当増 加 す る が,ATPは

減 少 して い る 。

この 事 実 は,精 子 の 運 動 に よ って 燐 脂 質 が分 解

され,グ

リ七 回ホ ス ホ リー ル コ リンや ホ ス ホ リ

ー ル コ リン の よ うな無 機 燐 酸 に な り酸 溶 性 燐 画

分 に あ らは れ て い る こ とを 示 して い る。

2)精

子 の 酸 素 消 費 量 と 燐 脂 質 量 の 変 化 との 関

  精 子 希釈 液 を20℃ で7時 間 保温 振 盪 した間 に,

精 子 が 実 際 に消 費 した 酸 素 量 と燐 脂 質 の減 少 か

ら計 算 した理 論 的 酸 素 消 費 量 を し らべ た。 そ の

1例 を 次 の 第2表

に示 す 。

  第2表   精 子 の燐 脂 質 の代 謝 と呼 吸

  1)精

子5倍 希 釈 液(ペ

ニ シ リ ン50単 位/ml.

   

を 含 む)       

… … …2m1

  2)精

子 数       … … …4.2×109

  3)乾

燥 重 量       … … …24.5mg.

  4)運

動 前 精 子 の燐 脂 質 量 … … …1.313mg.

  5)運

動 後精 子 の 燐 脂 質 量

… … …1.063mg.

  6)  7時 間 に お け る燐 脂質 代 謝 量 …0.250mg.

  7)  燐 脂 質 代 謝 量 か ら計 算 した 理 論 的酸 素 消

   

費 量      

… … ・

一4001.

  8)、 精 子 の消 費 した 酸 素 量     … … …480μ1

,

第1表  精子の運動による燐酸化合物面分の変化

        精 子 濃 度     時 間 実 験 番 号           n/m.1.    (分)

性 燐

全焼    

無機燐  

△7燐

燐脂質燐   燐 蛋 白燐   核酸 燐

1 2 3 4 3.8×109 4.1×109 4.1×109 4.3×109 0 420 0 420 0 420 0 420 98.2 138.6 110.0 152.3 109.0 155.2 113。6 153.2 25.0 56.2 30.1 70.2 28.1 69.5 20.6 58.3 16.7 11。4 16。8 13.1 18.2 12.3 、19.1 12.6 92。1 71.3 104。2 80.6 1062 79.8 109.2. 81.4 44.2 50.1 44.6 432 48.3 46.5 47。2 47.0 651.1 652.0 662.3 658.9 661.5 659.3 665.2 664。1 精 子5倍 希 釈 液2m1。 をWarburg反 応 容 器 に 入れ20℃ で7時 間 保 温 振 盪,後 精 子 を と り出 しSchneider 法に 従 い 燐 酸 化合 物 画 分 に分 画 し,各 成 分 の 燐 を 測 定。 測定 値 はす べ て μg./1010精 子 で示 す 。'

(3)

第3表  精子 の燐脂質代 謝と呼吸量

実験番号

時      燐   脂   質(分)    (μg./101。間     燐 脂 質 燐精 子)    (mg./101。精 子) 酸 素 消 費 量      理 論 的 酸 素 量 (ml./1010精 子)  (MI./101。 精 子)

R(02)

5 6 7 8 0 420』   0 420   0 420   0 420 98.0 73。0 106.4 82.3 107.3 82.2 102.5 78.0 2。450 1。840 2.663 2.058 2.682 2.062 2.562 1.950 1.025 1.102 1.116 1.102 0.976 0.968 0.992 0.979 0。95 0.87 0.90 0.89 ● イケ チ ョ ウ ガイ精 子 希 釈 液2ml.をWarburgの 反応 容 器 に 入れ20℃ で7時 間保 温 振盪 した後,精 子 を と り出 して 燐 脂 質 を 抽 出 し燐 を測 定。 同 時に そ の 間 に お け る精 子 の 酸素 消 費 量 を 測定 した 。R(02)は 減 少 した燐 脂 質 量 に 対 応 す る理 論 的酸 素 量 を 実 際 の精 子 酸 素 消 費 量 で 除 した値 。

  9)新

鮮 精 子 の燐 脂 質 重 量% 

… … …5,4%

ロ 110)運 動 精 子 の 燐 脂 質 重 量%  … … …4 .3%   燐 脂 質1mg.の 酸 化 燃 焼 に は1.6m1の 酸 素 が 必 要 と さ れ て い る か ら20),精 子 燐 脂 質 の 代 謝 量0.25mgに 対 して40011.の 酸 素 が 必 要 で あ る 。 実 測 値 は480μZで あ る か ら,吸 収 さ れ た 酸 素 の 大 部 分 は 燐 脂 質 の 酸 化 燃 焼 に 依 っ て 使 は れ た と す れ ば 一 致 す る 。   第3表 は 同 様 に して 行 っ た 実 験 を ま と あ た も の で あ る 。

3)遊

離 燐 脂 質 の 変 化

  以上 の 実 験 よ り,精 子 は運 動 の エ ネ ルギ ー源

に燐 脂 質 を 利 用 して い る こ とが 推 定 出来 る が,

燐 脂 質 には 蛋 白 と結 合 してlipoproteinと

して

存 在 す る もの と,遊 離 状 態 で 存 在 す る もの が あ

る。 こ の い つ れ の 形 の もの が 利 用 され るか を 明

らか にす る た あ に,遊 離 燐 脂 質 を 抽 出 して 運 動

の 前 後 に お け る変 化 を しらべ た(第4表)。

第4表  全燐脂質 と遊離燐脂質 の変化

実験番 号

全燐脂質

遊離燐脂質

運動前  

運動後  

運動前  

運動後

9 10 98.8     73.0      13.2 106.1    82.2     17.1 6.5 9.3 イ ケ チ ョ ウ ガイ精 子 希 釈 液2m1.をWarburgの 反応 容 器 に入 れ,20℃ で7時 間 保 温振 盪,後 精子 を と り出 して 全燐 脂 質 と遊 離燐 脂 質 を 抽 出 して燐 を定 量 。燐 の値 は μg/1010精 子 で示 す 。   新 鮮 精 子 で は 遊 離 糖 脂 質 は 全 燐 脂 質 の%程 度 し か 存 在 して い な い が,運 動 精 子 で は 減 少 して い る 。 し か し,そ の 量 だ け で は 精 子 の 酸 素 消 費 量 の す べ て を 説 明 す る こ と は 出 来 な い 。 精 子 細 胞 のlipoproteinも 何 等 か の 刺 戟 で 結 合 が 弱 め ら れ て 燐 脂 質 を 遊 離 し,そ れ が 酸 化 さ れ る も の と 考 え ら れ る 。 ウ ニ 精 子 は,受 精 に 際 し,卵 表 層 のlipoproteinよ り 燐 脂 質 を 遊 離 さ 尽 る 作 用 を も っ て い る こ と が 知 ら れ て い る21)か ら,イ ケ チ ョ ウ ガ イ 精 子 も 同 様 の 機 能 を 有 す る も の と 思 わ れ る 。   運 動 に よ る 燐 脂 質 成 分 の 質 的 な 変 化 に つ い て は,毛 利22)は ウ ニ 精 子 で 各 種 の 燐 脂 質 が 一 様 に 変 化 を 受 け る こ と を 見 て い る が,イ ケ チ ョ ウ ガ イ 精 子 で は か な り選 択 性 を 有 して い る 。 即 ち, ケ イ 酸 ク ロ マ トグ ラ フ 法 で し ら べ る と,燐 脂 質 成 分 の 中 で 一 番 変 動 の 著 し い 画 分 は,ク ロ ロ ホ ル ム ー メ タ ノ ー ル(1:1)で 溶 出 さ れ る も の で あ る 。 こ の 西 分 に は セ リ ン,エ タ ノ ー ル ア ミ ン の 外 に リ ジ ン が つ ね に 含 ま れ て い て,ク ロ マ ト法 に よ る 分 離 は 不 可 能 で あ る 。.イケ チ ョ ウ ガ イ 精 子 で は 単 純 な 燐 脂 質 の 状 態 で 個 々 に は 存 在 して い な い の か も しれ な い23)。 い つ れ に せ よ こ の よ う な 特 異 的 な 燐 脂 質 が イ ケ チ ョ ウ ガ イ 精 子 に 存 在 して い る こ と は 興 味 の あ る こ と で あ る 。

4)糖

量 の 変 化

  イ ケ チ ョ ウガ イ精 子 の 希 釈 液2mZをWarburg

の 反 応 容 器 に入 れ,20℃ で7時 間 好 気 的 に 保 温

(4)

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滋 大 紀 要

第    13  1963

振 盈 した 後,精

子 を と り 出 し 糖 量 を 測 定 した

(第5表)。

第5表

精子 の糖量 の変化 と酸素 消費量

騨(・1/・

子)。

ω

実測値    理論値

って い るが,運 動 に よ って 減 少 す る量 は 精 子 の

酸 素 消 費 量を 説 明 す る の に不 充 分 で あ る。

  6.  イ ケ チ ョウ ガ イ精 子 の呼 吸 に お け る 内在

基 質 は,燐 脂 質 が主 なも の で あ る と考 え ら れ る 。

Summary 11      0     4.250     420     3.850 12     0     4.180     420     3.831 1,027      0.300      0.29 0.998     0.263     0.26 イ ケ チ ョ ウ ガイ精 子5倍 希 釈 液2皿1.を20℃ で7 時 間 保 温振 撮 した後,精 子 を と り出 し,脂 質 を 除 い た後 加水 分 解 す る こ とな しに フ ェ ノー ル硫 酸 法 で 糖 量 を 測定 した。   イ ケ チ ョ ウ ガ イ の 新 鮮 精 子 に は,糖 が 乾 燥 重 量 の10%近 く含 ま れ て い る 。 ウ ニ5)や カ キ9)の 精 子 で は,糖 量 は1%以 下 で あ る か ら,こ の 含 有 量 は 非 常 に 高 い も の で あ る 。 しか し,第5表 か ら分 か る よ う に,運 動 に よ る 減 少 は わ ず か で あ り,そ の 量 よ り,炭 化 化 物1mgの 酸 化 燃 焼 に は0.75m1の 酸 素 が 消 費 さ れ る と して 計 算 したR (02)は0.3内 外 と な る5)。 こ の 値 で は 精 子 の 酸 素 消 費 量 の す べ て を 説 明 す る こ と は 難 か しい 。   結 局,イ ケ チ ョ ウ ガ イ 精 子 の 呼 吸 に お け る 内 在 基 質 と して は,糖 も 幾 分 は 関 係 して い る だ ろ うが,主 た る も の は 燐 脂 質 で あ ろ う。

  1.  イケ チ ョ ウガ イ精 子 の 呼 吸 にお け る 内在

基 質 につ い て し らべ た。

 2.精

子 の 希 釈 液 を 保 温振 僻 して燐 酸 化 合 物

面 分 に分 画 し,運 動 の前 後 に お け る燐 を定 量 し

た結 果,燐 脂 質 面 分 は 減 少 し,酸 溶 性 燐 と無機

燐 酸 面 分 が 増 加 して い た。

 3.  燐 脂質 の 誠 少 量 か ら理 論 的 に計 算 した 酸

素 の 吸収 量 は,実 際 に精 子 が 吸収 した 酸素 消 費

量 と大 体 一 致 して い た。

 4.精

子 の遊 離 燐 脂 質 は全 燐 脂 質 の20%し

な く,そ の 誠少 量 だ けで は精 子 の 酸素 消 質 量 を

説 明 す る こ とは 出 来 ない 。 遊 離 燐 脂 質 の み な ら

ず,lipoproteinの

燐 脂 質 も 酸 化 され る もの と

思 わ れ る。

 5.糖

は新 鮮 精 子 で は 乾 燥 重 量 の10%も

存 在

し,他 の生 物 に くらべ て 非 常 に高 い 含 有 量 を 持

  1.The  endogenous  substrates  of the  respiration in  the  spermatozoa  of  Hyrio∬ ム56乃legeli,  mother of pearl  oyster,  was  examined.

  2.  Phosphorus  analyses  before  and  after  三ncu-bation  of  sperm  suspensions  revealed  the  decrease in  phospholipid  phosphorus  and  the  increase  in  total acid-soluble  phosphorus  and  inorganic  phosphorus.   3.The  free  phospholipid  amounted  to about  20

%of  total  phospholipid.  The  combustion  of  the free  phospholipid,  however,  was  found  to  be  insu. f丘cient  to  account  for  the  actual  oxygen  uptake, suggesting  the  utilization  of the bound  phospholipid.'   4.Assuming  that  the  combution  of  l mg.  phos・

pholipid  requires  1.6ml.  oxygen,  the  ratio  of the theoretical  oxygen  uptake  (associated  with  the observed  disappearance  of  pbospbol量pid)  to・the of)served  oxygen  uptake  was  O.90.

  5.The  carbohydrate  content  of  the  spermatozoa amounted  to  10%of  dry  we玉ght  of  spermatozoa.  A decrease  of  the  carbohydrate  was  also  observed after  incubation,  but  it was  too  small  as  compared to  the  high  rate  of  oxygen  uptake。   This  fact  su・ ggest  that  carbohydrate  is not  the  principal  endo・ genous  substrate  of  the  spermatozoa.in  耳yriopsis

∫訪1解 猷

  6.It  is concluded  that  the  oxidative  breakdown of  phospholipid  is  the  principal  source  of  the energy  required  for  movement.

1)Barron,  E. S.G.  and  Goldinger,  J. M.:Proc.   Soc.  Fxp.  Biol.  Med.,48,570(1941)

2)  Hayashi,  T.:Biol.  Bull.,90,177(ユ946) 3)  Spikes,  J.D.:Amer.  Nat.,83,285(1949)

4)  Lardy,  H.  A.  and  Philips,  P.  H.:Amer.  J.   Physiol.,134,542(1941)

5)Rothschild,  Jord  and  Cleland,  K.W.:J。  Exp.`   Biol.,29,66(1952)

6)Mohri,  H。:Jour.  Fac.  Sci.  Univ.  Tokyo,  IV,   8ジ51  (1957)

(5)

,

7)  Bernstein,  G.S.:Biol.  Bull.,107,305  (1954) 8)Hartree,  F.  F.  and  Mamm,  T.:Biochem.  J.,   71,423  (1959)

9)  Lovern,  J. A.,  Olley,  J.,  Hatree,  E.  F., and   Mann,  T.:Biochem.  J.,67,630(1957)

10)吉 田,川 越:医 学 と 生 物 学,29,128(1953)

11)  Bomstein,  R.A.,  and  Steberl,  F.A.,:Fxp.  Cell   Res.,12,254(1957)

12)  Norman,  C.,  Goldberg,  F., and  Porter丘eld,1.   D.:Anat.  Rec.,137,383(1960)

13)Humphrey,  G.F.=Austral.  J. Fxp.  Biol.  Med.   Sci.,28,1(1950)

14)Schneider,  W.  C.:J.  Biol.  Chem.,164,747   (1946)

15)  King,  F. J。:Biochem.  J.,26,292(1932)

16)  Barth,  L.  G.  and  Jaeger,  L.:Physiol.  Zool.,   20,133  (1947)

17)  Radin,  N.S.,  Lavin,  F.B.,  and  Brown,  J.R.:J.   Biol.  Chem.,217,789(1955)

18)'Dubois,  M.,  Gills,  K.  A.,  Gills,  K. A.,  Hamil・   ton,  J.K.,  Rebers,  P.A.,  and  Smith,  F.  Anal.   Chem.,28,350(1956)

19)河 合 清 三,東 怜:生 化 学,31,97(1959)

20)Maclean,  H.  and  Maclean,1.  S.:Lecithin   and  Allied  Substances.  London  (1927) 21)Maggio,  M  and  Monroy,  A.:Exp.  Cell  Res.,   8,240  (1955)

22)Mohri,  H.:Sci.  Papers  Coll.  Gen  Educ.  Univ.   Tokyo,11,109(1961)

23)板 坂 修,東 怜,堀 太 郎:生 化 学,35,391(1962)

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参照

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