時計遺伝子の機能と疾患研究の最前線

(1)

第

338

回昭和大学学士会例会特別講演

時計遺伝子の機能と疾患研究の最前線

埼玉医科大学医学部生理学

池田　　正明

○代田　それでは早速，特別講演で「時計遺伝子の機能と疾患研究の最前線」と題しまして，埼玉医科大学医学部生理学講座の池田正明教授にご講演をお願いしたいと思います．

　まず，簡単に池田先生のご略歴をご紹介いたしますが，1983 年に岡山大学医学部をご卒業されております．医学部卒業後ただちに大学院に進まれまして，そこでは脳研精神科の方に進まれています．大学院を終了後，またすぐにアリゾナ大学医学部の薬理学に留学されておられます．1989 年からは，国立精神神経センターに研究員として移られまして，

1993 年に埼玉医科大学第一生理学の方に移られました．その後，講師を経られまして，それから助教授と進まれまして，2009 年より埼玉医科大学医学部の生理学教授に就任されて現在に至っておられます．また，先生のご専門は生理学になっておられますが，精神科の医師としても活動をされていると伺っております．

　それでは池田先生，よろしくお願いいたします．

○池田　本日はこのような機会をいただきまして，

代田先生はじめ，昭和大学歯学部の学士会のオーガナイザーのみなさまに大変感謝申し上げます．私は，

今ご紹介いただきましたように，大学院の時から精神科で研究を始めたのですが，現在は体内時計を制御しています時計遺伝子の仕事をしております．

　少し，実際の研究のお話をする前に，なぜこのような研究を始めたかということを，少しご紹介したいと思います．みなさんご存じのように，うつ病は精神科の疾患の中でも非常にメジャーで，今，実際に会社でうつ病の人が職員の方におられると，非常に全体的なアクティビティが会社としても下がってしまうという，ご本人が苦しまれるということばかりでなく，そういったことでも非常に問題になっている訳です．

　私が研究始めた当時というのは，そういううつ病の症状というのはよく分かっていた訳ですが，実際に何が原因で，どうすればいいのかということが，抗うつ剤を飲めばいいと分かっていたとしても，実際に体の中で何が起こっているのかということは，ほとんど分かっていませんでした．当時分かっていたこととすれば，睡眠と覚醒のリズムが少しずれて，

正常な方より位相がズレてしまっているとか，それから体温のリズムがデプレッション（うつ病）の方，

この図では赤ですが，このグラフのようにリズムにメリハリがなくなって，それで 1 日中同じぐらいの体温になっています．正常な人は非常に昼間高くて夜，夜中の 3 時か 4 時に最低ラインになるという，

非常に大きなメリハリのある体温リズムがあるのですが，正常の方に比べて，うつ病の方はフラットに近くなってしまうという特徴があります．

　こういう違いに加えて，コルチゾール（副腎皮質ホルモン）を測定してみますと，やはりこの体温と同じように，正常な方は朝方に非常に強いコルチゾールのピークがあるのですが，うつ病の方は 1 日のリズムのピーク値と底の値の差が少なくなって，

やはりフラットになるような傾向があります．それから，松果体から分泌されますメラトニンにいたっては，メラトニンは，寝ている間の夜中の 3 時とか 4 時ぐらいに分泌のピークがあるのですが，うつ病の方は夜中に本来だったら高く上がるはずのメラトニンが，ほぼフラットになってしまいます．うつ病には，このような生物学的な変化があるということが，当時から知られていました．

　それからもう 1 つは，ほとんどの精神科医が経験することですが，患者さんが気持ちの変動とか体の具合の不調に関して訴えることとして，朝方が非常に辛いと．しかし，夕方になるとちょっと良くなって，これだったら明日会社に出られるかもしれない

(2)

という，そのような体の不調や気分の不調が，朝方悪いけども夕方良くなるというような，気分の日内変動があるというようなことも，精神科の臨床医からすれば，よく知られた事実だったのです．

　当時，私が大学院に入りまして，研究を指導してくださった先生がおられたのですが，盛政忠臣先生という当時講師の先生がおられました．先生は，うつ病の研究をするとしたら，原因を最終的には見つけなければいけないと．だから，もしそういうことを生物学的に研究するのだったら，体内時計の研究をすることが，たぶん一番近道じゃないかとおっしゃった．うつ病の原因を見つけるためには，それが一番近道じゃないかと．そういう提案を受けて，

それで，体内時計の研究を講師の先生とすることになりました．

　その時は，体内時計の仕事と，当時考えられていたそう病の治療薬に使えそうな薬の研究をして，学位は取ったのですが，ただ，その当時の体内時計の研究というのは，ほとんど動物実験が中心で，例えばラットの行動リズムを測定したり，あるいはカテコーラミンとその代謝物を測るというような，非常にオーソドックスな仕事しかできなかったのですね．

　当時は，まだ今みたいに遺伝子の話はほとんど無くて，やっとその数年後の，私が大学院を卒業する頃に，京大の沼正作先生の研究室が，いろいろなレセプターの遺伝子をクローニングし，その成果を

『Nature』や『Science』に発表するという時代になってきていました．

　そこで，やはり，ちゃんとした生物学的な研究をするためには，遺伝子のことをしっかりやらなくてはいけないということで，先ほど代田先生からご紹介がありましたように，87 年にアリゾナ大学で，レセプターの分子生物学的な研究を一緒にさせてもらえるというアメリカ留学の機会をいただきました．

　今日は，最初に私が今やっている，体内時計の遺伝子を見つけることになった，その経緯を少しお話して，2 番目は，元々うつ病の原因の解明をしたいと考え，中枢の研究をしたいと思っておりましたが，視交叉上核というのが体内時計の中枢がありますが，そこでカルシウムのリズムが神経活動と同じようにリズムがあることが知られており，このリズムが体内時計の遺伝子によって制御されているかどうかということを，富山大学の先生と一緒に解明す

る機会がありました．そのお仕事を紹介したいと思います．

　それから 3 番目は，歯学部の臨床の先生が今日聴講されているということですが，時計遺伝子と病気，あるいは治療という視点からの研究が非常に進んできておりますので，私たちが現在トライしている，抗がん剤と体内時計の関係について，プレリミナリーなデータを少しご紹介したいと思います．

　体内時計というのは，体の中にリズムがあるといいうことです．元々は地球が 24 時間で自転することによって，24 時間のリズムができている訳です．

生物が生存している地球の上というのは，24 時間の昼夜のリズムとか，気温の変動のリズムとか，さまざまなリズムがある訳です．

　それを体がいちいち，今は陽が昇ったから朝だと感じて，それで朝の環境に適応した体に合わせているという訳ではなく，体内時計が，予め朝の 6 時に太陽が昇るから，それに合わせて体の方もプログラムを作って，朝に合わせて，例えばコルチゾールをたくさん分泌しましょうとか，そのようなタイマーのようなものを体の中に作ったのが，体内時計だと言われています．

　地球上に存在する生物のほとんどは，体内時計を持っています．今のところ例外が無いですね．必ず，どんな，例えばショウジョウバエにしても，哺乳動物にしても，魚にしても，地球上に存在している動物はほとんど全て，体内時計を持っていて，しかも，最近の研究では，全ての生物が体内時計の遺伝子，時計遺伝子と言いますが，時計遺伝子を持っていて，それが，どの細胞にもあって，24 時間のリズムを刻んでいるということが分かってきています．

　つまり，地球上に存在する生物は，地球の歴史の中で，40 何億年の歴史の中で，太陽と地球が作っている 24 時間のリズムを自分の体の中に取り込んだのです．これはほんとうに基本的なシステムということになると思うのですね．とにかく例外が無い，

非常に確固としたシステムであるということです．

　概日リズムの仕組みとしては，この図にありますように 3 つのシステムがあると考えられます．一番大事なのは，この真ん中に示してある，約 24 時間のリズムを発振するオシレーターの部分です．これは体内時計の中枢で，視床下部の視交叉上核という，ちょうど視交叉の直上に視交叉上核という約 1

(3)

万個のニューロンの集まりがあるのですが，これは SCN と略されますけども，そこに体内時計の中枢があると言われています．

　これは，1960 年代に，視交叉上核を壊した時に行動リズムが無くなるということで，この核が同定されています．実際には動物の体内時計の周期は 24 時間ピッタリではなくて，24 時間より長い場合や，人の場合は 24 時間より長いのですが，マウスの場合はちょっと短くて 23. 何時間という，少し 24 時間より短い周期を示します．

　このような 24 時間より少しズレたリズム周期を地球上の 24 時間のリズムに合わせるために，光シグナルを使って，朝に光に当たることによって，微妙な周期のズレ，体内時計の位相のズレを，光によって修正できるという，そういうインプットのシステムがあります．光以外では，食事を朝することによって体内時計を合わせるなど，食事や運動でリズムを合わせるようなこともある程度できます．しかし，リズム位相合わせで一番強いのは光のシグナルだと考えられます．

　それから図の右ですが，これは出力機構を示しています．これはどういうことかというと，肝臓ではさまざまの酵素にリズムがありますが，例えば夜中に高くなるような酵素があるとすると，それをリズムの発振システムが 24 時間で，例えば夜中に発現が高くなるように調整しているというのがアウトプットのシステムです．

　これら，発振，インプット，アウトプットからなる 3 つのシステムが合わさって，初めて体内時計が機能するということになります．

　先ほどお話しましたように，太陽の光が，朝，当たりますと，桿体とか錐体とよばれる，視覚に関係するロドプシンという光受容体のある細胞がありますが，それとは別に，ガングリオン細胞という，網膜にそういった視物質のある網膜細胞とは別の細胞がありまして，その細胞にメラノプシンという全く別の，ロドプシンとは別の，光を受容するレセプターがあります．その細胞は光が当たることによって活性化され，網膜から直接，視交叉上核という，

先ほどご説明いたしました体内時計の中枢に神経を直接送って，それを活性化する，そういうルートがございます．

　このシナプス部分が，最終的にこの視交叉上核の

ニューロンにインプットする場所にあたり，グルタミン酸を放出して，光のシグナルが最終的には神経伝達物質の刺激に変換されて，視交叉上核のニューロンをグルタミン酸のレセプターを介して活性化するという仕組みになっています．

　ですから，ただ単に，みなさんが朝光を浴びているというのは，気分的に，ああ，朝が来た，明るくなったという，そのように気分を盛り上げるという意味合いだけではなくて，実際に，化学物質の変化として，グルタミン酸の放出という化学物質の放出という形で，光刺激が頭の中に直接伝わっているということになります．光刺激は，頭（視交叉上核）

をダイレクトに刺激をするという意味で，非常に直接的なシステムだということになります．

　これは，ちょっと複雑な図で申し訳ないですが，

この黒い箇所が睡眠時間帯を表しています．人の場合は，真っ暗な部屋で過ごし，睡眠をとりますと，

24 時間より周期が長いので，毎日睡眠の記録を付けていきますと，だんだん，1 時間弱ぐらい睡眠開始時刻がズレていきます．

　それで，例えば，朝方，この図の黒い所の右の方に矢印が付いていますが，これは朝方に光刺激を与えたことを示しています．朝方光刺激をするとどうなるかというと，この位相が左側にズレます．つまり，位相が前進します．人は 25 時間近くの周期で睡眠位相がズレていきますが，朝方そのような光刺激を与えると，位相が前にズレることになります．

つまり，人の 24 時間より長い周期は，朝方に光が当たることによって，ちゃんと 24 時間ピッタリと戻るということです．ピッタリと位相を合わせられるという，そういうシステムです．

　朝方光を浴びるというのは，実際に体の中で何がおこっているかというと，体内時計の，本来だったら後ろにズレていってしまうような位相を，前にズラすことによって，24 時間ピッタリの周期に合わせているというシステムだということです．このシステムで位相が前進をするということです．

　それに対して，夜中の寝たばかりに光を浴びてしまうと，この図ではこのポイントですが，そうすると，位相が後退してしまいます．この図では，位相が右の方にズレてしまうわけです．これはどういうことかというと，例えば，みなさんが明日の講義資料を作るために夜中の 2 時ぐらいに起きて，パソコ

(4)

ンを開けて，それで急遽資料を作るというようなことをしますと，本来だったら寝たばかりの時間帯ですので，そのような時間帯に光を浴びてしまうと，

位相が後退してしまうということになります．だから，あまりそういう行動をやり過ぎると，リズムが乱れてしまう傾向になる可能性が出てくる訳ですね．

　光によって体内時計の位相というのは，前進したり後退したりします．それも光を浴びる時間帯依存的に，前進するか後退するかということが決まっています．ですから，若い人はあまり夜中に，例えば，

12 時過ぎてからスマホとか見ない方がいいのではないかという，そのようなことを最近言われていますが，背景にはこういう理由があるからなのです．

　特に，PC とかスマホのディスプレイには青い光が含まれていて，先ほどお話したメラノプシンという光の受容体は，特に青い光に一番感受性が高いのです．だいたい 460，70，80 ナノメーターの波長の青い光に非常に強い感受性をもっています．そのため，青い光の多いディスプレイを夜中に見ると，位相の後退を起こしやすいと言われています．

　それから，アウトプットについて少し補足をいたしますと，体内時計の中枢というのは視交叉上核ですが，体内時計の中枢が全身にどういう形で位相シグナルを送っているかという課題が，ずっと研究されてきました．

　1 つ重要な点は，体内時計というのは，最初の頃は視交叉上核が体内時計の中枢として，24 時間のリズムの発振をしていると考えられていました．ところが，今から 20 年ほど前に，肝臓とか骨格筋とか肺とか，各臓器にも体内時計を発振するシステムがちゃんとあって，それが独自のリズムを持っているということが分かってきました．

　それで，このシステムについて見直されて，今考えられているのは，体内時計の中枢である視交叉上核から，交感神経の神経性のネットワークを使って，

あるいは下垂体から出る ACTH，それから副腎皮質からのコルチゾール分泌，これらのホルモン系を使って，視交叉上核からのシグナルが末梢に位相のタイミングの情報を伝えているという，このように書き直されました．システムとして．ですから，例えて言うならば，各臓器である支店も体内時計の 24 時間のリズムを発振する力をちゃんと持っていて，

本店である視交叉上核はそれを管理しているよう

な，そういうシステムだということになります．

　それで，ここから，私がこの 20 年と少し取り組んで参りました，体内時計の遺伝子を見つけようというプロジェクトについて，どういう経緯で時計遺伝子が見つかってきたかということについて，簡単にお話したいと思います．

　時計遺伝子という概念は，わりと早くからありました．1970 年代にベンザーとコノプカが，彼らは Caltech の研究者だったのですが，ショウジョウバエを使ってリズムの研究を始めました．

　彼らが何を考えたかというと，まず，ショウジョウバエに遺伝子変異を起こさせるような薬物を食べさせて，遺伝子変異を起こさせます．そうしましたら，遺伝子変異を起こしたら何か行動異常が起こるのではないかということで，彼らがやったことは，

ショウジョウバエの行動リズムを測定し，変異原物質を食べさせたショウジョウバエで，リズム変異を示すものがあるかどうかを検討してみたんですね．

このスライドで示してあるのは 1971 年の彼らが発表した研究になります．

　正常の場合は，このようなスライド上段のように，

これは3日間の行動リズムの記録を示していますが，

正常の場合は，このように約 24 時間ごとのピークが出ます．ところが，変異原物質を食べさせたショウジョウバエの中には，リズムが全く無くなってしまったり，24 時間より短かったり，あるいは長かったりという，リズム変異を起こすショウジョウバエが，見つかってきました．遺伝子の変異を起こさせたら，行動リズムが変わるという先駆的な仕事です．

　このショウジョウバエを使って，どの遺伝子に変異が入っているのかという研究を，2 つのグループ^＊1 が同時に行い，1984 年にそれぞれのグループより，

それは PER という遺伝子に変異が入っていて，それで行動リズム異常が起こるという報告が出て来ました．

　ただ，この後はこの報告に続くような研究が進まなく，この研究以降は，体内時計の遺伝子の仕事は全くと言っていいほどありませんでした．

　1991 年に私はたまたま，先ほど代田先生にご紹介いただいた国立精神神経センターにある神経研究所の疾病研究三部という，ここは精神疾患を生物学的に研究するという当時，厚労省唯一の研究部門だったのですが，そこに入ることになりました．

(5)

　その当時の部長は，この写真向かって左側の高橋清久先生です．高橋先生は，睡眠リズムの分野では，

大変ご高名な先生で，その分野の研究や臨床の仕事をされている先生でした．実は後からうかがったのですが，私がこの研究部門に入った時，高橋先生は私が大学院の時にリズムの仕事をやっていることを知らなかったということです．この部門には，部長の他に，室長が 2 人おられましたが，一人の室長の研究グループに所属することになっていたため，入所するまで高橋先生はそのことをご存知なかったようです．

　その後私が体内時計の研究を大学院でやっていたということで，高橋部長から，「私の研究グループの若い人に体内時計の参考になるような話をして下さい」，そういう話になったんです．そのお話が，

体内時計について考えてみようとする機会になりました．

　ちょうどその年の，この部門に入ったのが 4 月ですが，1991 年 6 月に，この図に掲載された論文が出ました．これは，先ほどご説明した 1984 年に見つかったショウジョウバエの PER という遺伝子のタンパクの構造です．これは ARNT という遺伝子と SIM っていう遺伝子ですが，91 年に ARNT という遺伝子が見つかりましたが，SIM もほとんど同じ時期に見つかっていました．この 3 つのタンパクを並べてみると，PAS ドメインというドメイン構造が，どうもあるのではないかということになりました．蛋白の構造を並べてみると，非常に似た構造が，この 3 つの遺伝子産物にあると．確かに，ここの部分が似ています．

　それで，彼らはこの 3 つの遺伝子の頭文字をとって，PAS ドメインと，PER と ARNT と SIM と，その頭文字をとって PAS ドメインという名前を付けました．ちょうど，高橋先生からリズムの仕事をちょっと手伝ってくれと言われていた時に，この論文が出て，これはなにかヒントになるのではないかと，そう思ったのが時計遺伝子の研究を始める最初だったのです．

　その当時分かっていたのは，jun と fos というがん遺伝子です．これらは，プロトオンコジンと呼ばれるがんの遺伝子で，1980 年代の後半に見つかってきていました．FOS と JUN がロイシンジッパーで二量体を作っているのです．転写因子として二量

体を作って，それでターゲットの遺伝子に結合して，転写を調整しているということが，1980 年代の後半に分かってきました．ロイシンジッパーを介して二量体になるということが分かってきていたのです．

　そこで，当時私が考えたのは，FOS と JUN はこのような形で転写因子として 2 つの分子が一緒になって，DNA に結合するとしたら，先ほどご説明したように，PAS ドメインを持った遺伝子が見つかった訳ですが，その遺伝子 SIM と ARNT という 2 つの新しい遺伝子は，FOS，JUN と同じように，

ベーシックループヘリックス構造を持っていて，明らかに DNA に結合できるような構造を持っていました．

　それで，FOS，JUN はロイシンジッパーで結合していますが，ひょっとしたら，先ほどの SIM とか ARNT は PAS ドメインという構造があるから，

この PAS ドメインを介して，2 つの転写因子が二量体を作って，FOS，JUN と同じように転写因子として働いているのではないかというように考えました．その当時，そういったことは全く言われていなかったのですが，このように考えました．

　もう 1 つのヒントになったのは，PER は PAS ドメインを持っていますが，DNA に結合するためのベーシックドメインが PER には無いことです．ですから，もしこの PER が転写因子系に働くとすれば，DNA に結合できないような二量体を作って，おそらく抑制因子として働いているのではないかと考えました．すなわち，この PER が時計遺伝子として働いているとすれば，抑制因子として働いていると考えたわけです．

　しかも，こういう PAS ドメインとベーシックドメインを持ったような転写因子が，ベーシンクドメインのない PER が抑制だったら，ベーシンクドメインのある因子は促進として，だからプラスの因子とマイナスの因子があることによって，促進と抑制が両方あるような，そういうようなコンプレックスを作っているのではないかと考えたのです．

　ですから，このスライド（図 1）に書いていますが，このベーシックヘリックスループヘリック PAS 型の転写因子の中に，時計遺伝子が含まれて，転写促進因子として働いているのではないかと考えたわけです．もし，そういう因子を見つけて，体内時計

(6)

の中枢である視交叉上核に発現していれば，これが体内時計の遺伝子と言えるのではないかと，当時，

91 年の段階で考えました．

　ですから，片端から bHLH-PAS ドメインの持った遺伝子を見つけて，当時まだ 2 つしか見つかっていなかった訳ですが，おそらくたくさんあるだろうと考えました．そういう因子を片端から見つけて，

視交叉上核で発現していて，このようなプラスとマイナスの関係の結合が見つかれば，体内時計の遺伝子を見つけられるのではないかと考えたのです．

　それで片端から ARNT と同じような遺伝子を見つけようということで，いろいろな方法で新しい遺伝子をクローニングする実験を始めました．最初に取れてきたのが，BMAL1 という遺伝子です．なぜ BMAL1 と名付けたかというと，ARNT にまずよく似ているのですね．アミノ酸の配列が ARNT に非常によく似ている．それで，ARNT-Like という名前を

付けました．それだけでは，遺伝子の特徴を表せていないと思って，ノーザンブロットをやりましたら，

脳と，骨格筋，それから心筋に非常に強く発現をしていたんですね．それで，脳と筋肉にある，ARNT に似た遺伝子ということで，Brain and Muscle Arnt- like 1 とし，その頭文字を取って，BMAL1 という名前を付けて，97 年に発表しました．

　ただ，これはとにかく第 1 発目というか，1 つめの遺伝子だったので，これが時計遺伝子という可能性はすぐには分からなかったので，このような形で発表しました．

　これだけでは時計遺伝子かどうか分からないので，これが体内時計の遺伝子であることを証明しようと考えました．当時，札幌の北海道大学に本間先生ご夫妻がおられ，生理学の教授と准教授として活躍されておられました．本間先生の研究室では，既にペプチドの遺伝子の視交叉上核の発現を非常にた

図 1　時計遺伝子クローニングを開始した時の仮説

1）bHLH-PAS 型転写因子の中に時計遺伝子があり，転写促進因子として働く．

2）PER は bHLH がないため転写抑制因子として働く．

3）転写の促進と抑制が概日リズムを生み出す．

新規の bHLH-PAS 因子を見つけ，体内時計の中枢である視交叉上核でリズム発現することを確認できれば，それが時計遺伝子である可能性が高いと考えた．

a：FOS:JUN はロイシンジッパーを介してヘテロ二量体を形成して DNA に結合する．

b： bHLH-PAS 因子である AhR，ARNT は，PAS ドメインを介してヘテロ二量体を形成し DNA に結合する．

c： bHLH-PAS 因子に PER が PAS ドメインを介して結合した場合，この二量体には DNA へ結合可能な basic domain が片方しかなく，DNA と結合できないため，PER は転写抑制因子として働く．

(7)

くさん解析された実績があり，一緒に Bmal1 が視交叉上核に発現するかどうかを，共同研究としてやっていただければ，早く時計遺伝子かどうか分かるのではないかということで，ちょうど 97 年の 3 月に生理学会があり，一緒にシンポジウムで発表させていただく機会があったので，この学会がきっかけで，共同研究をしましょうという話になりまして，北海道大学と一緒に研究を始めました．

　最初に Bmal1 のプローブを設計して，視交叉上核で in situ ハイブリダイゼーションをやってみたところ，見事に視交叉上核で発現することが分かりました．他に海馬にも非常に強い発現があるのですが，視交叉上核でちゃんと発現しているということが分かりました．

　次に，12 時間ごとの明暗周期でラットを飼って，

視交叉上核で実際にリズムが Bmal1 にあるのかどうかということを解析してみました．スライド（図2）

では，Bmal1 の発現はこの黒丸で示してあります．

そうしましたら，夜に非常に高くなるというリズム発現のあることが見つかってきました．これだけでは，ただ昼間は光で抑制されていて，夜には抑制が

取れて上がるということになります．実際，このような発現パターンを示す遺伝子はたくさんあります．光の有る無しによってただ調整されているだけとも見えるわけです．

　それで，追加として，真っ暗闇の部屋で飼ったラットの Bmal1 の発現も確認しました．そうしましたら，やはり，夜の時間帯に発現が高くなるのです．光と関係なく，自律的にオシレーションしているということが，この実験で見つかりました．

　これらの結果から，Bmal1 は体内時計の遺伝子であることが確実だということで，ちょうど 1998 年の 5 月に体内時計の国際学会がアメリカ・フロリダであって，体内時計の遺伝子を 1 つ見つけたということで，発表しようということになり，勇んで，本間先生とフロリダに出掛けて行きました．

　学会が始まる前の日，ウエルカムパーティが学会会場のホテルのプールサイドで行われました．そのプールサイドで，ジョセフ・タカハシという Clock という時計遺伝子をその学会の前の年に発表していたノースウエスタン大学の研究者と，84 年にショウジョウバエの Per 遺伝子を見つけたマイケル・ロ

時計遺伝子 Bmal1 の発現は視交叉上核（SCN）で暗期に高い概日リズムを示す．図 2

A： 12 時間毎の明暗周期でラットを飼育し 4 時間毎に SCN の Bmal1 の発現（●）を in situ hybridization により解析．

B：恒暗条件における SCN の Bmal1 の発現（●）．

　 （Honma S, Ikeda M, et al. Biochem Biophys Res Commun. 1998;250:83︲87. より改変）

(8)

シュバッシュ^＊2という研究者と話をする機会がありました．

　そうしましたら，タカハシが，明日午前の最初のシンポジウムで，CLOCK が BMAL1 と結合して，

Per の転写を調整しているという発表をするというのです．さらに，ロシュバッシュはショウジョウバエも全く同じ遺伝子，すなわち BMAL1 のショウジョウバエ版を見つけたので，明日発表するというのです．

　この学会で，今までバラバラだった 3 つの時計遺伝子が共同作業をしてリズムを作っているということが初めて報告されました．つまり，Per 遺伝子という遺伝子があるとすると，そこに BMAL1 と CLOCK が二量体を形成して，まさに最初に予測した通り PAS ドメイン同士が結合して二量体を形成し，Per 遺伝子の転写を活性化するという，私が当初考えた通りのコンプレックスを作って，それが Per という遺伝子の転写促進を行うということが，タカハシのグループから発表されました．

　これからさらに，PER タンパクを作って，これが今度はこちら側の BMAL1，CLOCK の方に戻って来て，今度は，この PER が BMAL1 と CLOCK の転写活性化を抑制するというモデルです．私が最初考えていたように，PER は，BMAL1 の転写促進という bHLH-PAS ドメインを持った転写促進因子の転写活性化を抑制するという，まさに私が予測した通

りの作用をするということも，この学会でタカハシらのグループが発表しました（図 3）．

　私たちは，Bmal1 が視交叉上核でリズムがあるという発表を同じシンポジウムでしたのですが，タカハシのグループは，Bmal1 が視交叉上核でオシレーションするというデータは出してきませんでした．そのため，私たちの報告は補完的なデータになりました．この学会で，時計遺伝子 Bmal1, Clock, Per が作る転写・翻訳のフィードバックループによって，24 時間のリズムが生まれているということが明らかになりました．

　このシンポジウムが終わった後は，参加者のみなさんは，ほとんど学会会場から，お昼なのに全然立ち去ろうとしないで，ずっと会場や廊下にいて，話をしていたのを今でも覚えています．とにかく，このフィードバックループのモデルを，この学会シンポジウムで初めて聞いたという人が，ほとんど全員だった訳です．そういう意味で，普通は論文でこのような新規の研究は聞く訳ですが，概日リズムの発振モデルは，この学会でほぼ全員が初めて聞いたということになりました．

　タカハシは，97 年の 5 月に CLOCK という遺伝子を見つけて発表していたのですが，予測通り，CLOCK は，BMAL1 と同じ bHLH-PAS 型の因子だったということです．タカハシは，これを，ショウジョウバエの遺伝子 Per をベンザーが見つけた時と同じよう

図 3　哺乳類概日リズムの分子機構モデル（1998 年）

CLOCK と BMAL1 はヘテロ二量体を形成して Per1 遺伝子の転写調節領域にある E-box （CACGTG）に結合，Per1 の転写を活性化させる．Per1 の転写を活性化によって産生された PER1タンパクは，核内に移行して CLOCK:BMAL1 の転写活性化を抑制する．

時計遺伝子の転写と翻訳によって形成されるネガティブフィードバックループが約 24 時間の概日リズムを生み出している．

後に CRY1，CRY2 が発見され，PER1，PER2 と結合して CLOCK:BMAL1 の転写活性化を抑制することが明らかにされた．

(9)

に，遺伝子の変異原をマウスに食べさせて，さらに行動リズムをスクリーニングして，Clock にたどり着いたのです．

　以前，私がタカハシに直接お会いした時に，なぜ，私みたいに bHLH-PAS 型遺伝子が Clock 遺伝子である可能性が高かったのに，そんな面倒臭い実験をやったのかという質問をしたら，何も答えてくれませんでした．しかし，この研究は，非常にオーソドックスな地道な研究で，最終的に Clock にたどり着いたという，非常にしっかりとした研究です．

　Bmal1 のノックアウトマウスは，タカハシらのグループが 2000 年に発表しました．このデータは正常なマウスですが，マウスの行動は，24 時間より短いので，このように斜めになりますが，Bmal1 をノックアウトしてしまうと，この図のように全くリズムが無くなってしまいます．Bmal1 は，壊してしまったらリズムが無くなる，完全にリズムが壊れるという，そういう遺伝子です．

　今まで，時計遺伝子がいろいろ見つかってきていますが，ほとんどの時計遺伝子は，ノックアウトしてもリズムが短くなるか，長くなるか，そういう現象しか起こりませんが，唯一 Bmal1 だけが，リズムが完全になくなるという遺伝子です．ですから，

取って代わることができない遺伝子ということになります．

　あと，この同じ学会で，スイスのウリー・シブラーらのグループが，培養細胞にも，このような普通に培養している細胞でも，24 時間のリズムがあるという，今まで誰も考えてもいなかったデータが発表されました．普通に考えると，細胞周期があるにしても，このようなリズムが細胞にあるなんていうことは，誰も考えていなかったのです．それがきれいに，例えば Per2 という時計遺伝子もきれいに 24 時間リズムが細胞であるということです．

　その後，私たちはBmal1のプロモーターをクローニングして，そこにルシフェレース遺伝子を付けたコンストラクトをトランスジーンとして入れたマウスを作りまして，それでいろいろな臓器でどのように発現するのかということを検討してみました．そうしましたら，解析したすべての臓器で，きれいに 24 時間弱のリズムのあることが見つかりました．どんな臓器でも，Bmal1 の 24 時間のオシレーションがあるということです．例外がありません．

　もう 1 つ，私たちがやったことは，クロックジーンにはいくつかある訳ですが，抑制系の Per1 と Per2 遺伝子は，その産物は抑制系の転写因子ですが，先ほどご説明したように，PAS ドメインはありますが，ベーシックリージョンが無いので，転写の促進因子として DNA に結合して転写を促進できません．つまり，抑制因子として働いているのです．

BMAL1 は逆に，転写を促進できる訳ですね．直接 DNA に結合して，転写を促進できる訳です．

　この 2 つの位相関係はどうなっているのかというと，シーソーみたいに全く反対になっているのですね．Per2 が高い時間帯というのは，Bmal1 は低いのですね．つまり，こっちが高ければこっちが低いという，そういうシーソー関係みたいになっているのですね．

　これをうまく動物で証明できないかということで，

このように 2 つの色が違うルシフェレースをそれぞれの遺伝子プロモーターに繋いで，それぞれのトランスジェニックマウスを作りました．これを掛け合わせて，いろいろな臓器でリズムを測定してみますと，視交叉上核はもちろんですが，肺とか肝臓とかの臓器で，Bmal1 と Per2 がシーソーみたいな感じで，片方が高ければ片方が低いというように，非常にきれいな 180 度の位相関係にあるということを，

マウスのレベルでも証明することができました．これは産総研の中島芳浩先生らとの共同研究です．

　人のどこの臓器にも，リズムがちゃんとあるのかということですが，これは，スイスのグループが人のサンプルで行ったデータを，まとめた図になります．いろいろな臓器で，例えば，骨格筋とか皮膚とかで Bmal1 にリズムがあることが証明されました．

　私たちは，国立精神神経センターの三島和夫先生のグループと共同研究で，人の皮膚をバイオプシーして，それを培養し，時計遺伝子のプロモーターレポーターを入れて，細胞のリズムを測定できるシステムを作りました．夜型，朝型という，朝が苦手な人とか，夜ずっと起きているのが得意な人とか，そういう人が世の中にはいると思いますが，そういう人たちにボランティアでサンプリングをお願いして，リズムがどうなっているか調べてみました．

　そうしましたら，青い方が夜型の人ですが，夜型の人は周期が長く，右の方に行くにしたがって周期が長くなるのですが，夜型の人はより周期が長いと

(10)

いうことが分かりました．ですから，どちらかというと，生活習慣のように見えている夜型とか朝型というのは，実は，細胞のレベルでかなり規定されているのではないかということです．つまり，細胞自身は時計遺伝子によってリズムが刻まれていますが，

時計遺伝子のレベルで，夜型と朝方の人で，周期が違うのではないかというようなことを示唆するデータが出て来ました．こういう実験からでも，人の体の中にリズムがあるということが分かるのですね．

　あまり時間が無くなりましたので，この後の仕事は簡単にご説明します．

　視交叉上核にはこのように電気活動があって，それは24時間リズムです．これが，例えばBmal1は，

マウスの視交叉上核の個々の細胞でリズムをトレースすると，このようにきれいにリズムになるのです．

電気活動とかカルシウムとか，それから，CRE ですね，CREB が結合する CRE プロモーター，それから Per2，こういったものは全て視交叉上核においてリズムがあって，その位相はかなり近いことが分かっています．

　こういったリズムが，なぜ生まれてくるのか，時計遺伝子がこういったものをちゃんと調整しているのかどうか，というのが分かりませんでした．そこで，私たちは，カルシウムを測定できるイエローカメレオンという，理研の宮脇敦史先生が開発したプローブを視交叉上核に入れて，さらに Bmal1 の RNAi を作って，それも同時に入れまして，このような培養細胞系で Bmal1 のリズムを測定しました．

作成した Bmal1 の RNAi，これを何も入れていない細胞では Bmal1 のリズムがきれいに出るのですが，

RNAi を入れるとリズムが無くなるのです．

　それで，RNAi に効果があることを確認した後，

今度は，視交叉上核の器官培養系に，カメレオンと一緒に，この RNAi を入れてみました．正常だと，

このようにカルシウムのオシレーションが 24 時間見られますが，Bmal1 の RNAi を入れますと，カルシウムのリズムが消失します．つまり，カルシウムのオシレーション自体が，Bmal1 によって，レギュレートされていることが分かりました．つまり時計遺伝子の下流にカルシウムのオシレーションがあるということになるのです．

　次に，BMAL1 のドミナントネガティブ体を使って，同じような実験をやりました．ドミナントネガ

ティブ体の BMAL1 を導入しても，同様にカルシウムのリズムが無くなります．

　最後のテーマになりますが，いろいろな疾患に高発症時間帯があるということが知られています．例えば心臓突然死というのは朝方多いとか，このように，病気には，発症しやすい時間帯，高発症時間帯があると考えられています．

　シフトワークをしている人は，このスライドにあるように，BMIが高くなったり，冠動脈疾患によって死亡する割合が高いというように，体内時計は病気と関係があるということが言われてきています．

　抗がん剤の効き方にも，何時ごろが一番効いて，

何時ごろが一番副作用が高いとか，そういったこともマウスの実験から出てきています．例えば，イリノテカンであれば，マウスの昼間の時間帯，お昼からちょっと過ぎたぐらいの午後の時間帯に一番効果が高いという研究結果が出てきています．

　私たちは，イリノテカンのターゲットであるトポイソメラーゼ I にリズムがあり，体内時計によって制御されているのではないかと考えました．イリノテカンの標的自体が，体内時計によって制御されているのではないかという仮説です．トポイソメラーゼ I のプロモーターをクローニングして，リズムがあるかどうかを調べてみました．そうしましたらきれいなリズムのあることが分かりました．これは，BMAL1 と CLOCK によって，トポイソメラーゼ I，すなわちイリノテカンのターゲット自体が，時計遺伝子によって制御を受けているということになります．

　イリノテカンに関係したいろいろなファクターが，リズム制御を受けていて，最終的には，イリノテカンの一番の効果が出る時間帯というのは，このようないろいろな因子の総和によって決まってくるというように考えられています．

　それからこれは最後のテーマになります．これはプレリミナリーなデータですが，昭和大学の腫瘍内科の佐々木康綱先生，藤田健一先生と共同で始めている研究のまだ初期のデータなのですが，それを少しご紹介したいと思います．

　他のグループも，体内時計の遺伝子とがん，あるいはがんの治療薬との関係があるのではないかということを，データとして少しずつ，報告してきていますが，私たちは，Bmal1 の遺伝子を潰した細胞を作りまして，それを使って，抗がん剤の効果につい

(11)

て検討してみました．

　実際に，Bmal1 のノックダウンをしますと，これがクリスパーキャスで作った細胞ですが，そうしますと，この赤いトレースで示しておりますが，きれいなリズムが正常な細胞であるわけですが，Bmal1 をノックダウンしますと，リズムがほとんど消失します．こういう細胞を使って，いろいろなキナーゼの阻害剤を使って，Bmal1 の遺伝子があるかないかで，抗がん剤の効果に違いがあるかどうかについて見てみました．

　まず 1 つ目は，EGFR のインヒビターであるゲフィチニブ使って，効果に違いがあるかどうかを細胞の生存率を指標に見てみたところ，これは，変化はありませんでした．Bmal1 が無くても効果には関係ありません．それに対して，レゴラフェニブを使って，同じような実験をやりましたところ，Bmal1 をノックダウンした細胞では効果が高くなるという結果です．どうも，抗がん剤によっては，リズムのあるなしによって，効果に違いがあるということです．Bmal1 が無くなった，つまり時計の機能が無いような細胞は，レゴラフェニブに対して非常に感受性が高くなるという結果です．

　それからもう 1 つは，デキサメサゾンという副腎皮質ホルモン作用のある薬物ですが，これを添加すると，細胞は 24 時間のリズムで同調するようになります．普通に培養しておくと，個々の細胞はバラバラのリズムですが，デキサメサゾンを加えますと，細胞のリズムは同調する性質があります．同調させた細胞に対して，あるいはデキサメサゾンを使わないで同調していない細胞に対して，こういった抗がん剤の効果の違いがあるのかについて調べてみました．

　ゲフィチニブを使って，デキサメサゾンで同調させた細胞で検討してみますと，非常にという程ではないのですが，ある程度効果に違いが出て来ました．

この図で，デキサメサゾンプラスというのは，同調した細胞です．左側はリズムがバラバラな細胞の結果になります．右側はリズムの揃った細胞です．これらの細胞にゲフィチニブ（イレッサ^Ⓡ）を入れた所，明らかにデキサメサゾンを入れた細胞で，感受性が高くなるような傾向がありました．すなわち，

リズムが同調しているほど，ゲフィチニブに対して感受性が高くなる可能性があります．

　それに対して，レゴラフェニブに関しては，デキサメサゾンで同調した細胞でもほとんど差が無いということですね．あるいは，ちょっと逆に効果が薄れているような傾向があるということです．同調しているかどうかということも，抗がん剤の，特にチロシンキナーゼ系のインヒビターのタイプによって，

違いがあるのではないかという結果です．

　ですから，これからがんの治療を考えていく場合に，同調している細胞がより効果がある抗がん剤と，

かえってリズムがバラバラの方が，効果のあると思われるような抗がん剤があるのではないかということです．予めそれを考えた上で，すなわち，どういうがん細胞にリズムがあるのか，そういったことも考慮して，どちらがより感受性が高いのかということを考えて治療に使っていくということが，今後の選択肢になっていくのではないかと考えています．

　これは最後のスライドです．

　私が 30 年以上前ですが，精神科の医局に入って，

研究を始めた時に，「うつ病を生物学的に研究するためには体内時計をちゃんとやらないと分からない」というのが，その時に講師から言われたことでした．

　最近，これは 2013 年にカリフォルニアのグループの出してきたデータです．

　これは，うつ病の人の死後脳の研究データです．

死後脳の場合，何時に亡くなったか，そういう死亡時刻のデータがある訳ですが，いろいろな時間帯に亡くなった方の死後脳のサンプルを集めて，時計遺伝子の発現量を，うつ病の人と対照群で調べています．

　この赤いマスになっているのは，Bmal1 や Per1 などの時計遺伝子に非常に高いピークの，ピークが認められた領域を示しています．うつ病に関係あるような脳領域からサンプリングして，そういった領域の時計遺伝子にリズムが認められた場合は赤で表示されています．つまりリズムがより強い場合が赤です．ところが，黄色とか緑になると，ほとんどリズムが無くフラットというようなことになるわけです．うつ病からのサンプルでは，いろいろなうつ病に関連があると言われる脳部位で，時計遺伝子のリズムがフラットになってしまっているというデータです．

　つまり，脳の中の時計遺伝子のリズムが，健康な人は非常にきれいなリズムがあることに対して．う

(12)

つ病の人はリズムが無くなっているということが，

死後脳の研究から見えてきました．研究を始めた頃，

当時の指導教員であった講師の先生がうつ病を解明するためには体内時計からアプローチしろとおっしゃっていましたが，30 年を経て，うつ病の人は体内時計の不全があるということが，時計遺伝子のレベルで分かってきたということになります．

　私は，精神科のこういう研究には，貢献していませんが，Bmal1 遺伝子を見つけたことが，こういう形でうつ病と関連するデータとして次に出て来たということは，最初に研究をやり始めた取っ掛かりが，間違いではなかったという気持ちにさせてくれます．そういう意味で，時計遺伝子の研究に携わってこれたことを，非常にうれしく思っています．

　今回お話させていただいたデータは，非常に多くの共同研究者と一緒にやってきた仕事からえられたものです．最初の Bmal1 の視交叉上核での発現の解析は，北海道大学の本間先生のラボと一緒に行ったものです．Bmal1 とルシフェレースを使ったレポーターの実験は，産総研の中島先生との共同研究です．カルシウムの仕事は富山大学の池田真行先生と一緒に行ったものです．それから，最後にご紹介させていただいた，抗がん剤の研究は，今，ここにおられますけども，佐々木先生，藤田先生と今共同で始めている実験です．また，多くの大学院生がデータを出すのに貢献してくれています．

　ご清聴ありがとうございました．以上です．

○代田　池田先生，どうもありがとうございました．お時間が迫っておりますが，お 1 人か，もしくは，じゃあ，どうぞ．・・・先生．

○質問　すいません，貴重なご講演ありがとうございました．小児歯科の・・・と申します．小児歯科だと，やはり，生活時間を整えていくことが大切なので，早寝早起きを推奨しているんですけれども，

今お話をお聞きしたら，夜型の人は元々周期が長いのではないかということだったんですけれども，これは，小さい頃からの習慣が体内リズムを狂わせ

て，夜型の人に周期が変わったのか，元々，生まれ持って周期が違っているのか，その辺の所を教えていただけないでしょうか．

○池田　はい．ご質問ありがとうございます．まだ，人のレベルでは子どもさんのこのような実験はできていなくて，実際にお子さんでどのような周期になっているのかは，実際のデータは持ち合わせていません．一般的に，お子さんの方がより夜型といいますか，朝が苦手な人のパーセントが多いのではないかというのが，こういう生物学的なデータではなくて，生活のリズムを検討した場合の報告であります．

　学校もできれば早い始業時間を設定しないで，9 時とか 9 時半と，遅めに授業を始める方がいいのではないかということを，研究者の中で言っている人がいるくらいです．

　どちらかというと，夜型のお子さんの方が多い．

これは将来，お子さんでこのようなサンプリングをさせてもらうことができれば，測定を実際に行って，生物学的なデータをとって証明しないといけないと思います．

○質問　はい．

○代田　どうもありがとうございました．まだご質問のある方もおられると思いますが，池田先生は，

この後しばらく昭和大学の中におられますから，もしご質問があれば，私の部屋の方に来ていただければ，お話しできると思いますので，是非，何かお話しされたい方は，是非いらしてください．池田先生，ありがとうございました．

　演者追記：校正の段階でノーベル賞受賞者が発表されましたので記載しました．

＊ 1（ブランダイス大学のマイケル・ロシュバッシュ博士とロックフェラー大学のマイケル・W・

ヤング博士）

＊ 2（マイケル・ロシュバッシュ博士は 2017 年ノーベル生理学・医学賞を受賞することになった．）