昭和大学医学部臨床病理診断学講座

免疫性血小板減少性紫斑病（ITP）症例の骨髄組織  における IL-17 発現に関する免疫組織化学的検討

昭和大学医学部臨床病理診断学講座

岡本奈央子^＊  本間まゆみ  南 雲  佑  川口有紀子  蒲澤 宣幸  田澤 咲子  塩沢 英輔  矢持 淑子  楯  玄 秀 

  瀧本 雅文

昭和大学医学部内科学講座（血液内科学部門）

宇 藤  唯  服部 憲路  中 牧  剛

昭和大学藤が丘病院小児科

山本 将平  磯山 恵一

抄録：免疫性血小板減少性紫斑病（Immune thrombocytopenic purpura：ITP）は網内系にお いてマクロファージによる巨核球や血小板の貪食・破壊が亢進することが主因とされている．

近年，骨髄中の血小板産生段階にも異常があることが明らかになってきており，骨髄巨核球の 障害や破壊がヘルパー T 細胞の不均衡やインターロイキン 17（Interleukin-17：IL-17）を産生 する T 細胞によって起こることが報告されている．しかし，骨髄を対象とした報告は少なく，

一定した見解は得られていない．今回，慢性 ITP の骨髄病理組織（クロット）検体を用いて 免疫組織化学（免疫染色）を施行し，治療開始前の骨髄巨核球の形態的変化と IL-17 関連の免 疫学的変化の有無を検討した．昭和大学病院において臨床的に慢性 ITP と診断された患者の 治療前の骨髄病理組織 33 例を用いた．形態的変化は Hematoxylin-Eosin 染色を用いて観察し た．抗 CD3 抗体，抗 CD4 抗体，抗 CD8 抗体，抗 CD20 抗体，抗 CD25 抗体，抗 CD68 抗体，

抗 CD163 抗体，抗 IL-17 抗体を用いて免疫染色を行った．強拡大で免疫染色陽性細胞をカウ ントし，対照の骨髄浸潤のない悪性リンパ腫患者の治療前の骨髄病理組織 11 例と比較した．

各例とも巨核球の形態異常や貪食像はみられず，血小板付着像にも明らかな差異はなかった．

慢性 ITP の骨髄では，IL-17，CD68，CD163 免疫染色陽性細胞の割合が有意に増加し（ ＜ 0.05），IL-17 陽性細胞の多くは，CD68 や CD163 陽性細胞の分布と一致していた．また，三者 は各々正の相関を示した．慢性 ITP の骨髄で単球やマクロファージは増加し，T 細胞以外に IL-17 を産生し分泌する可能性が示唆された．現在 ITP の診断に骨髄検査は必須ではないが，

免疫染色を含む骨髄病理組織診断は慢性 ITP 症例の骨髄におけるリンパ球やマクロファージ・

単球の動態やサイトカインの影響などの病態生理の解明において有用であると考えられた．

キーワード：ITP，IL-17，マクロファージ，単球

緒 言

  免 疫 性 血 小 板 減 少 性 紫 斑 病（Immune throm- bocytopenic purpura：ITP）は網内系で血小板の 破壊が亢進し，血小板減少を来す後天的な自己免疫

性疾患である^1）． （ ）や

B 型・C 型肝炎ウイルス，ヒト免疫不全ウイルスな

どの慢性感染症，リンパ増殖性疾患，全身性エリテ マトーデスや関節リウマチ，抗リン脂質抗体症候群 などの自己免疫性疾患の合併がないものを一次性 ITP という^2，3）．抗血小板自己抗体に感作された血 小板が主に脾臓や肝臓でマクロファージに貪食され ることが血小板減少の主たる機序だが，抗体が巨核 球に直接作用するなど，血小板産生段階にも異常が 原  著

＊

責任著者

あることが明らかになってきた^2，4）．骨髄中で巨核 球が好中球やマクロファージに取り囲まれて貪食さ れる可能性^5）や巨核球の障害や破壊がヘルパー T

（Helper T：Th）細胞の不均衡やインターロイキン 17 （Interleukin-17：IL-17）を産生する T 細胞に よって起こることが報告されている^2，6，7）.

 典型的な ITP 症例では骨髄検査は必須ではなく，

骨髄病理組織所見は巨核球数が増加する場合もある が，特異的な変化は通常みられないとされる^5，8）． そのため，ITP の骨髄病理組織検体を用いた研究報 告は少なく，免疫学的な関与については一定した見 解が得られていない．今回われわれは昭和大学病院 において診断された ITP 症例の骨髄病理組織にお いて，治療開始前の骨髄巨核球の形態的変化と IL-17 関連の免疫学的変化の有無を免疫組織化学

（免疫染色）で検討した．

研 究 方 法

 昭和大学病院において 2005 年から 2016 年に骨髄 検査が施行された慢性 ITP 患者の骨髄病理組織 33 例を対象とし後方視的に解析した．全て一次性かつ 米国血液学会の ITP 治療ガイドラインに基づき臨 床的に診断されたものとした．ただし，

陽性例は含んでいる．対照として，骨髄浸潤のない 悪性リンパ腫患者の治療前の骨髄病理組織 11 例を 用いた．

 病理学的検討には骨髄液凝血塊のホルマリン固定パ ラフィン包埋切片（骨髄クロット標本，骨髄標本）を 用いた．形態的観察は Hematoxylin-Eosin（HE）染 色を用いて行った．免疫染色は抗 CD3 抗体（clone  PS1, Leica Biosystems Newcastle Ltd., Newcastle,  UK（Leica）；100 倍希釈），抗 CD4 抗体（clone 1F6，

Leica；40 倍 希 釈 ），抗 CD8 抗 体（clone C8/144B，

Dako，Glostrup，Denmark（Dako）；50 倍希釈），抗 CD20 抗体（clone L26, Leica；100 倍希釈），抗 CD25 抗体（clone 4C9, Leica；100 倍希釈），抗 CD68 抗体 

（clone KP-1, Dako；100倍希釈），抗CD163抗体（clone   10D6, Leica；100 倍 希 釈），抗IL-17抗体（clone poly,  LifeSpan  BioSciences,  Seattle,  USA；500 倍希釈） 

を用いた．各標本は高倍率（対物 40 倍）で 3 視野の hot spot を観察した．免疫染色陽性細胞数を全有核細 胞数で除して 1 視野当たりの免疫染色陽性細胞数の割 合を計算し，3 視野の平均値を統計学的検討に使用し

た．なお，観察は 3 名の病理医で行った．

  統 計 解 析 は JMP  12  Pro（SAS  Institute  Inc.,  Cary, NC, USA）を使用し，陽性細胞数の割合は Student の t 検定を用いて比較した．また，各免疫 染色陽性細胞数の割合の相関は Spearman の順位相 関係数を用いた．いずれも ＜ 0.05  を有意差あり とした．

 本研究は昭和大学医学部の人を対象とする研究等 に関する倫理委員会で承認されている（承認番号 2205）．

結 果

 慢性 ITP 患者の発症年齢中央値は 61 歳（範囲 19

〜 91 歳），性別は男性 8 例，女性 25 例だった．骨 髄塗抹標本における巨核球数の中央値は 32/µl（範 囲 7 〜 138/µl）だった．骨髄標本における骨髄密 度は低形成性が 19 例，正形成性が 12 例，過形成性 が 2 例だった．各症例とも巨核球の形態異常や貪食 像，巨核球を取り囲む他の血球の分布異常はみられ なかった．また，血小板付着像の多寡も明らかな差 異はなかった．代表的な慢性 ITP の骨髄標本の HE 染色と各免疫染色における陽性細胞の分布を示す

（Fig. 1）．形態的に IL-17 陽性細胞の多くは CD68，

CD163 陽性細胞の分布と一致していた．対照の骨 髄標本と比較し，慢性 ITP の骨髄標本では CD20 

（ ＝0.01），CD68（ ＝0.02），CD163（ ＝0.001）

および IL-17（ ＝0.001）の免疫染色陽性細胞数の 割合が有意に増加していた．CD4（  ＜ 0.0001）と CD25（ ＝0.01）の免疫染色陽性細胞数の割合は 慢性 IT の骨髄標本で有意に低下していた．CD3 

（ ＝0.97）および CD8（ ＝0.43）は両者に有意 差はみられなかった（Table 1）．また，CD68 と CD163  の発現割合には正の相関があり（r＝0.57，

＝0.0005），両者はいずれも IL-17 とも正の相関を 示した（r＝0.60， ＝0.0002 および r＝0.48， ＝ 0.005）（Fig. 2）．

考 察

 IL-17 を分泌する CD4 陽性細胞を Th17 細胞とい い，様々な自己免疫性疾患の病態に関与する^9）．近 年，ITP の病態にも重要であることが明らかになっ

てきた^2，6，7）．末梢血の Flow Cytometry（FCM）を

使用した研究で IL-17 は Th17 の他に CD8 陽性の T

細胞からも分泌され，それらの細胞は慢性 ITP 患 者で増えることが報告されている^10，11）．加えて，

Th1 細胞優位の Th 細胞の不均衡が病態に関わるこ とも言われ^12，13），Th1 細胞や Th17 細胞などを含む，

CD4 陽 性 細 胞 全 般 が 増 加 す る と 報 告 さ れ て い る^{10，14，15）}．一方で CD8 陽性細胞が増加する^10，16）とい うものや，リンパ球数には変化がないとするものも ある^17）．しかし，骨髄病理組織を用いた検討は，

FCM と免疫染色のいずれにおいても CD3 陽性細胞 が増加するという報告のみだった^17）．われわれの 検討では CD4 陽性細胞の割合は減少し，CD3 と CD8 陽性細胞の割合には変化がなかった．また，

IL-17 陽性細胞とリンパ球の分布はほとんどが一致 せず，陽性細胞数の相関もなかった．このことから 慢性 ITP の骨髄における T 細胞の誘導にはさらな る検討の余地があり，T 細胞以外も IL-17 の分泌に 関与する可能性が示唆された．

 マクロファージや単球に関する報告は少なく，

CD68 や CD163 陽性細胞について検討されたもの はない．慢性 ITP 患者の骨髄と正常な骨髄を FCM で比較し，CD14 陽性単球およびマクロファージの 数に有意差はなかったという報告がある^17）．しか

Fig. 1 Hematoxylin and eosin （HE） section and immunohistochemical staining in patients with ITP HE and immunohistochemical staining of a typical case are shown（objective, 40  × ）: （A） HE, （B） 

CD3, （C） CD4, （D） CD8, （E） CD20, （F） CD25, （G） IL-17, （H） CD68, and （I） CD163, and the  percentages of positively stained cells by immunohistochemistry were 10％, 1.8％, 7.8％, 3.1％,  0.2％, 4.5％, 19.5％, and 9.7％, respectively.

A B C

D E F

G H I

Table 1  Comparison of patients with ITP and control  subjects by immunohistochemical analysis

Data ITP 

（N＝33） Control 

（N＝11） -value CD3-positive cells, ％ 4.88 ± 3.36 4.92 ± 1.62  0.97 CD4-positive cells, ％ 0.31 ± 0.73 1.96 ± 1.13 ＜0.0001 CD8-positive cells, ％ 3.99 ± 2.30 3.40 ± 1.50  0.43 CD20-positive cells, ％ 6.00 ± 3.49 3.06 ± 1.90  0.01 CD25-positive cells, ％ 0.09 ± 0.16 0.23 ± 0.10  0.01 IL-17-positive cells, ％ 3.18 ± 1.50 1.49 ± 1.00  0.001 CD68-positive cells, ％ 11.6 ± 11.3 3.14 ± 3.23  0.02 CD163-positive cells, ％ 5.16 ± 2.71 2.13 ± 1.10  0.001

Results are shown as the mean ± SD.

し， わ れ わ れ の 検 討 で は 骨 髄 に お い て CD68 と CD163 陽性のマクロファージや単球が有意に増加 した．さらに，IL-17 陽性細胞の分布は主に CD68 もしくは CD163 陽性のマクロファージや単球の分 布と一致し，統計学的に陽性細胞の割合は各々正の 相関が示された．このことから慢性 ITP の骨髄で は増加した単球やマクロファージが IL-17 の発現に 関与する可能性が示唆された．

 Th17 や Th1 が関与する他の自己免疫性疾患に炎 症性腸疾患や関節リウマチがある^9）．炎症性腸疾患 の患部の蛍光免疫染色による二重染色を用いた検討 では，CD68 陽性のマクロファージや単球が主に IL-17 を発現した．さらに IL-17 の messenger RNA

（mRNA）もそれらの細胞内に同定され，局所にお いてマクロファージや単球も IL-17 の分泌源となる ことが報告されている^18）．また，関節リウマチ患者 においては，炎症の主座である関節液で CD14 陽性 単球の増加と単球による Th17 細胞の誘導がみられ たが，末梢血ではそのような変化は確認されなかっ た^19）．以上より，われわれの検討では巨核球や血 小板が産生される骨髄において T 細胞以外に単球 やマクロファージも IL-17 を分泌する可能性が示唆 された．慢性 ITP の骨髄では単球やマクロファー ジが IL-17 を発現もしくは分泌する可能性が示唆さ れ た が， 抗 IL-17 抗 体 と 他 の 抗 体 の 二 重 染 色 や mRNA の同定を行うなど，さらなる検討が必要で あると思われた．

 ITP の診断に骨髄検査は必須ではなく，除外診断 の目的で施行される．今回われわれの検討では，骨 髄標本の HE 染色では特異的な巨核球の形態的変化

や 貪 食 像 は な か っ た が， 免 疫 染 色 で は IL-17，

CD68，CD163 の発現が有意に増加し，慢性 ITP の 病理学的診断の指標になりうると考えた．また，慢 性 ITP の骨髄で血小板産生段階に関わるリンパ球，

マクロファージ・単球やサイトカインの影響などの 病態生理の解明において，免疫染色を含む骨髄病理 組織診断は有用であると思われた．

結 語

 慢性 ITP の骨髄標本において IL-17 の発現は増加 し，CD68 や CD163 陽性のマクロファージや単球 と相関を示した．更なる研究の蓄積が必要であると 考えられた．

利益相反

 本研究に関し開示すべき利益相反はない．

文  献

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Fig. 2 Correlations between IL-17 and CD68，CD163 in patients with ITP The expression of IL-17 was positively correlated with the expressions of （A） 

CD68 and （B） CD163.  , Spearman rank correlation coefficient.

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EVALUATION OF IL-17 EXPRESSION IN CHRONIC ITP USING   IMMUNOHISTOCHEMICAL ANALYSIS

Naoko O

KAMOTO

OMMA

AGUMO

AWAGUCHI

ABASAWA

AZAWA

Eisuke S

HIOZAWA

AMOCHI

ATE

AKIMOTO

Department of Pathology, Showa University School of Medicine

Yui U

TO

ATTORI

AKAMAKI

Division of Hematology, Department of Medicine, Showa University School of Medicine

Shohei Y

AMAMOTO

SOYAMA Department of Pediatrics, Showa University Fujigaoka Hospital

 Abstract    Immune thrombocytopenic purpura （ITP） is characterized by inhibition/destruction of  megakaryocytes in bone marrow （BM） and/or platelets in the spleen and liver.  Interleukin-（IL-）17-medi- ated cells contribute to the imbalance of cellular immunity in the pathogenesis of ITP.  Therefore, we ex- amined samples of BM clots to observe the morphological change of megakaryocytes and to test whether  IL-17-mediated immunological changes occur in the BM of patients with ITP. We enrolled 33 patients  who were diagnosed with chronic ITP.  BM clots were obtained before treatment and stained with hema- toxylin and eosin stains for morphological examination and the following markers: CD3, CD4, CD8, CD20,  CD25, CD68, CD163, and IL-17.  Pathological findings were compared between the ITP patient samples  and 11 control samples from patients with malignant lymphoma without infiltration of lymphoma cells.  

Univariate analysis revealed that patients with ITP had increased numbers of cells expressing CD68,  CD163, and IL-17 compared with the control subjects （  ＜ 0.05）.  There were significant correlations be- tween CD68 and CD163 expression levels, and these markers also showed correlations with IL-17 expres- sion．IL-17 expression showed the same distribution as these cellsʼ expression in immunohistochemical 

（IHC） staining.  Our results indicate that macrophages and monocytes may be involved in deregulated  expression of IL-17 in BM of ITP.  We suggest that BM examination and IHC staining in patients with  ITP may lead to a better understanding of the mechanism of ITP and the pathological diagnosis.

Key words:  ITP, IL-17, Macrophage, Monocyte

〔受付：12 月 20 日，2017，受理：1 月 10 日，2018〕