Title
Decrease in matrix metalloproteinase-3 activity in systemic
sclerosis fibroblasts causes α2-antiplasmin and extracellular
matrix deposition, and contributes to fibrosis development( 内容
と審査の要旨(Summary) )
Author(s)
丹羽, 宏文
Report No.(Doctoral
Degree)
博士(医学) 甲第1158号
Issue Date
2021-03-25
Type
博士論文
Version
none
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/81567
※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。氏 名 （ 本 籍 ） 丹 羽 宏 文 （岐阜県） 学 位 の 種 類 博 士（医学）
学 位 授 与 番 号 甲第 1158 号 学 位 授 与 日 付 令和 3 年 3 月 25 日
学 位 授 与 要 件 学位規則第４条第１項該当
学 位 論 文 題 目 Decrease in matrix metalloproteinase-3 activity in systemic sclerosis fibroblasts causes α2-antiplasmin and extracellular matrix deposition, and contributes to fibrosis development 審 査 委 員 （主査）教授 前川 洋一 （副査）教授 秋山 治彦 教授 原 明 論 文 内 容 の 要 旨 全身性強皮症は，組織線維化，免疫異常，血管障害を特徴とする全身性疾患である。従来の研究に おいて，alpha2-antiplasmin(α2AP)に注目した全身性強皮症発症の機序解明が進んでおり，強皮症 モデルマウスの血清や組織及び強皮症患者の組織でのα2AP の増加が組織の線維化に関与しているの ではないかと示唆されている。本研究は，強皮症患者の組織でα2AP がどのような機序で増加するの かを明らかにすることを目的として，細胞外基質を分解する酵素でα2AP を不活化させることが知ら れている matrix metalloproteinase(MMP)-3(MMP-3)に焦点を当て，強皮症における線維化進行にお ける MMP-3 とα2AP の関係について解析した。更に，MMP 群の活性を阻害する tissue inhibitors of metalloproteinase-1(TIMP-1)の発現を変化させることがα2AP 量に影響を及ぼすかどうかについて 検証した。
【対象と方法】
岐阜大学医学部附属病院を受診した強皮症患者と健常人コントロールの血清や組織を用い以下の実 験を行った。１）ELISA 法により両血清間でα2AP 及び MMP-3 の発現を比較した。２）強皮症患者と 健常人コントロールの組織を培養し，Western blotting 法(WB 法)を用いてα2AP，MMP-3，TIMP-1 の 発現量を調べ，MMP-3 活性を推定した。３）α2AP と MMP-3 を混合したものを健常人コントロールの 線維芽細胞に添加し，線維化にかかわる因子の発現量の変化を WB 法にて調べた。４）強皮症患者の 線維芽細胞に MMP-3 を添加し 24 時培養後，WB 法で線維化にかかわる因子の発現量を比較検討した。 ５）miR-29a を強皮症患者の線維芽細胞にトランスフェクションし，WB 法を用いてα2AP の変化を調 べた。 【結果】 強皮症患者と健常人コントロールにおける血清中のα2AP と MMP-3 の発現量はともに有意差がなか った。一方，線維芽細胞においては，α2AP の発現が健常人コントロールと比較して強皮症患者で有 意に増加し，MMP-3/TIMP-1 比は有意に低下していた。
次に，α2AP が MMP-3 によって限定分解されることを示し，MMP-3 と混合したα2AP ではαSMA（筋 線維芽細胞マーカー）及び I 型コラーゲンの発現が誘導できないことを明らかにした。また，強皮症 患者の線維芽細胞おいて，MMP-3 の添加がα2AP，αSMA，I 型コラーゲンの発現を有意に低下させる
ことを示した。 更に，TIMP-1 の発現を抑制することが知られている miR-29a を強皮症患者の線維芽細胞にトランス フェクションしたところ，TIMP-1 及びα2AP の発現が有意に低下した。 【考察】 強皮症患者と健常人コントロールの血清ではα2AP と MMP-3 の発現量に両者の有意差は認めなかっ たが，強皮症患者由来の線維芽細胞において，MMP-3 活性を間接的に示す MMP-3/TIMP-1 比の低下及 びα2AP の増加が確認され，強皮症の進行におけるこれらの要因の関与が示唆された。次に，MMP-3 が α2AP を分解及び失活させるのかどうかを検証し，MMP-3 がα2AP を限定分解することで，非分解型 α2AP が示す線維化促進効果が消失することも確認した。また，MMP-3 が強皮症患者由来の線維芽細 胞において増加しているαSMA や I 型コラーゲンの発現を低下させ，線維化を抑制する可能性を示し た。強皮症組織で起こっていると想定される MMP-3/TIMP-1 比の低下は,コラーゲンのような細胞外基 質構成要素の分解抑制だけでなくα2AP の不活化抑制も引き起こし，強皮症の進行に重要な役割を果 たしていると考えられた。更に，TIMP-1 の発現を抑制する miR-29a を強皮症線維芽細胞にトランス フェクションすることでα2AP の発現が低下したことから，強皮症における MMP-3/TIMP-1 比の低下 がα2AP の増加に重症な役割を果たしていることが示唆された。 【結論】 強皮症患者由来線維芽細胞において MMP-3/TIMP-1 比が低下しα2AP の発現が増加することを明らか にした。また，MMP-3 はα2AP を分解・活性低下させ,強皮症における線維化を抑制することが示唆さ れた。更に，TIMP-1 の抑制によってα2AP の増加を抑制できることを明らかにした。 論 文 審 査 の 結 果 の 要 旨 申請者 丹羽宏文 は，全身性強皮症において病態形成に深く関与すると考えられるα2AP の組織内 増加機序の解明に取り組んだ。細胞外タンパク質の分解に関与する MMP-3 とその内因性阻害分子であ る TIMP-1 との関係に着目し，強皮症線維芽細胞での TIMP-1 発現の増加が MMP-3 の相対的機能低下を もたらすことでα2AP の分解が抑制され，残存する活性型α2AP が筋線維芽細胞への分化を誘導して いる可能性を示した。この成果は全身性強皮症の病態の理解に資するものであり，皮膚科学の発展に 少なからず寄与するものである。 ［主論文公表誌］
Hirofumi Niwa, Yosuke Kanno, En Shu and Mariko Seishima
Decrease in matrix metalloproteinase-3 activity in systemic sclerosis fibroblasts causes α2-antiplasmin and extracellular matrix deposition, and contributes to fibrosis
development.
