植物共生微生物の利用に向けた分野融合型研究戦略

2018 年 1 月 31 日受理 連絡責任者：東樹宏和（toju.hirokazu.4c@kyoto-u.ac.jp）

植物共生微生物の利用に向けた分野融合型研究戦略

東樹宏和

京都大学生態学研究センター（〒 520-2113 滋賀県大津市平野 2 丁目 509-3） 要旨：生物多様性の解析技術における近年の革新により，植物をとりまく細菌・真菌類の膨大な多様性が明らかに なってきた．しかし，植物共生微生物叢の構造に関する知見が蓄積されつつあるいっぽう，微生物叢を制御する技 術については，本格的な開発が始まっていない．本稿では，次世代シーケンシングをもとにした微生物叢解析を概 説するともに，微生物叢の制御技術を構築するために欠かせない分野横断型研究の方向性について議論する． キーワード：内生菌，微生物叢，ネットワーク，土壌

1．はじめに

農地において植物は多様な細菌や真菌（きのこ・かび・ 酵母類）に取り囲まれている．陸上に進出したはじめのころ （4 億 5000 万年前）から，水や土壌栄養の獲得において陸 上植物は微生物（特に真菌）に大きく依存している （Brundrett 2002）．菌根菌が共生しないとされてきたアブラナ科植物に も，実際には多様な内生真菌や内生細菌が存在し，宿主植 物の成長や生存に貢献していることが明らかにされつつあ る（Almario et al. 2017）．大量 DNA 配列決定装置（次世代シー ケンサー）が登場して 10 年以上が経つ現在，植物をとりま く微生物の多様性と群集構造に関する知見が飛躍的に増大 してきた（Berendsen et al. 2012; Bai et al. 2015）．

いっぽうで，そうした植物共生微生物叢（plant microbiome） 研究によって，新たな課題が生まれてきている．構成要素 である微生物があまりに多様であるため，微生物叢を制御 するための基礎技術さえもまだうまく立ち上がっていない のである．微生物叢の動態を制御するためには，現象を個々 の物質や遺伝子に落とし込む還元主義的な研究戦略だけで なく，物理学や情報科学で発展してきたシステム全体の制 御を目指す研究戦略が意義を持つであろう．本稿では，微 生物叢解析技術の背景と課題に触れながら，今後求められ る分野融合型研究の方向性について議論したい．

2．植物共生微生物叢の解析

植物に関わる微生物の多様性と群集構造を解明する際， 細菌では 16S rRNA 領域，真菌では ITS 領域を PCR 増幅し たのち，Illumina 社のシーケンサー（MiSeq や HiSeq）で DNA 配列情報を得ることが多い．ここで注意したいのが， 宿主植物由来の DNA の混入である．16S rRNA 解析であれ ば，植物自身の葉緑体 DNA やミトコンドリア DNA が次世 代シーケンシング・データの大半を占めることがしばしば ある（葉緑体やミトコンドリアも細菌から進化したため）． そこで，葉緑体やミトコンドリアの 16S rRNA 領域に結合 して PCR 増幅を抑えるブロッキング・プライマーを用いる 必要性が生じる（Lundberg et al. 2013）．ITS 領域についても， 宿主植物の核 DNA 由来の配列が大量に得られることがあ り，植物 DNA をなるべく増幅しない PCR プライマーを選 択することが重要である（Toju et al. 2012）．しかし，完璧 なプライマーはなく，PCR におけるアニーリング温度など について，慎重な条件探索があらかじめ必要になってくる． 次世代シーケンシングのデータが得られたら，バイオイ ンフォマティクスの工程が待っている．QIIME （Caporaso et al. 2010）や Mothur （Schloss et al. 2009）といった解析パ イプラインがよく利用されるが，日本語の解説マニュアル がウェブ上（https://www.claident.org/）で手に入る Claident （Tanabe and Toju 2013; Tanabe 2016）を使用するという選択

肢もある（東樹宏和 2016）．また，少々専門的な話になるが， 「operational taxonomic units （OTUs）を生成しない」新しい

手法として，DADA2 （Callahan et al. 2016）というプログ ラムを利用した解析パイプラインが広まりつつある．この DADA2 は，細菌の系統（strain）レベルの解析への応用が 期待される反面，真菌の解析においてはゲノム内の ITS 配 列多型まで拾ってしまう恐れがあり，目的に応じた使い分 けが今後必要になるかもしれない．

3．ネットワーク解析

微生物叢に関する膨大なデータが得られたら，宿主植物 内における微生物間の潜在的関係性を推定する解析を行う ことができる（Agler et al. 2016; Toju et al. 2016b）．同じ植物

種であっても，個体間では微生物叢がしばしば異なる．また， 微生物どうしの組み合わせについても，同じ植物個体内で 出現することが多いものと，同じ植物体内では一緒に検出さ れないものがある．こうした傾向を統計的に分析することで， 微生物間の「共出現パターン」をあらわすネットワーク図を 描くことができる．対象とするサンプルは植物体に限らない． 土壌を分析対象とすることで，土壌内における微生物間の 共出現パターンを解明することもできる（Toju et al. 2016a）．

39 作物研究 63：39 − 41（2018）

Copyright 近畿作物・育種研究会 （The Society of Crop Science and Breeding in Kinki, Japan）

なお，こうした共出現ネットワーク内において結ばれた 微生物のグループの中には，直接的に相互作用しているの ではなく，単に好む環境が似ているだけのものが含まれて いる可能性がある．また，植物 200 個体以上（できれば 400 個体以上）からのレプリケート・サンプルがないと意 義のある結果が出力されないことが多々あるので，野外調 査を行う前に慎重なサンプリング計画が必要になることを 強調しておきたい（Yamamoto et al. 2014）．

4．微生物資源の効率的探索に向けて

微生物資材の候補となる微生物を探索する際，「幅広い 植物種に適用できるか」および「幅広い地域に適用できる か」という点が重要な選抜基準となるであろう．宿主範囲 と適用地理範囲の広い植物共生微生物を探索する際にも， ネットワーク解析をもとにした手法が利用できる． 特筆すべきことに，内生菌の中には，宿主範囲が極めて 広いものが多い（Toju et al. 2014）．そこで，草原や森林と いった自然生態系から，特に宿主範囲が広く，また，生息 する地理範囲も広いものを特定する戦略が，今後重要性を 増すと期待される．複数地点から多様な植物種をサンプリ ングし，真菌叢や細菌叢を次世代シーケンシングで明らか にすれば，「植物̶微生物ネットワーク」を描くことがで きる（Toju et al. 2017）（図 1）．このネットワークの中核に 位置する微生物は，多様な作物種への適用可能性および幅 広い地域への適合性の両面において，有望である．優先的 に単離・培養すべき内生菌を見出した上で，その機能を接 種実験等で解明していくことが望まれる． 調査地点 1 に出現する真菌と植物 調査地点２に出現する真菌と植物 調査地点３に出現する真菌と植物 複数の調査地点に出現する真菌 図 1  地理範囲と宿主範囲の広い菌の探索．日本国内 の 3 箇所（北海道・京都・鹿児島）の森林から， 数十植物種の根を採取し，「植物̶真菌ネット ワーク」として示した．このネットワーク内で 中央に位置する真菌ほど，幅広い気候帯の幅広 い植物種と関わっている．

5．おわりに

植物に関わる微生物叢は，農業における未探索資源の宝 庫と言える．内生菌が植物にもたらす機能は多岐にわたる． これまでに，窒素やリンを植物に提供するもの，植物体を 病虫害から保護するもの，水分ストレスや乾燥ストレスを 緩和するものなどがこれまでに報告されており（Jumpponen and Trappe 1998; Arnold et al. 2003; Newsham 2011），こうし た内生菌を最大限活用して植物の健全な生育を支える技術 を構築することが望まれる． 機能の異なる多様な微生物を植物内で安定共存させる上 で，本稿で概説したネットワーク解析や関連する情報学分 野の手法が，鍵となる基礎情報をもたらすであろう．筆者 の研究グループでは，機能の異なる多様な微生物をつなぎ とめる役割を果たす微生物を「コア共生微生物」と定義し， 学際的研究戦略を通じてその探索を進めている． 地球温暖化や新たな病原系統の出現が安定的な作物生産 を脅かし，農業における省資源化が求められている現在， 微生物叢の制御に関する技術は大きな可能性を秘めている と言える．いっぽうで，微生物叢の動態を理解すること自 体が科学における大きな挑戦であり，植物学や微生物学だ けでなく，情報学や生態学を巻き込んだ研究チームの構築 が基盤技術開発の鍵となるであろう．

参考文献

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Arnold, AE, LC Mejía, D Kyllo, EI Rojas, Z Maynard, N Robbins, and EA Herre （2003） Fungal endophytes limit pathogen damage in a tropical tree. Proc Natl Acad Sci USA 100: 15649-15654.

Bai, Y, DB Müller, G Srinivas, R Garrido-Oter, E Potthoff, M Rott, N Dombrowski, PC Münch, S Spaepen, and M Remus-Emsermann （2015） Functional overlap of the

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東 樹 宏 和 （2016） DNA 情 報 で 生 態 系 を 読 み 解 く： 環 境 DNA・網羅的群集調査・生態ネットワーク．共立出版， 東京 .

Interdisciplinary sciences for the understanding and application of plant

microbiomes

Hirokazu Toju

Center for Ecological Research, Kyoto University（Hirano 2-509-3, Otsu, Shiga, Japan）

Summary：Summary: Recent advances in biodiversity inventory analyses have helped us uncover hidden diversity of bacteria and fungi associated with plants. However, we are at an early stage of developing methods for manipulating and managing plant-associated microbiomes. In this reveiw, I introduce high-throughput sequencing methods for describing microbiome structures and then discuss future directions of interdisciplinary research for controlling microbiomes in agroecosystems.

Key Words：endophytes, microbiomes, networks, soil

Journal of Crop Research 63: 39-41 （2018） Correspondence: Hirokazu Toju （toju.hirokazu.4c@kyoto-u.ac.jp）

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