Posted at the Institutional Resources for Unique Collection and Academic Archives at Tokyo Dental College, Available from http://ir.tdc.ac.jp/
Title
№２：Treponema denticola におけるBacteriocin ABC
transporter 様遺伝子の解析
Author(s)
額賀, 智之; 田中, 公子; 菊池, 有一郎; 新谷, 誠康;
村松, 敬; 古澤, 成博; 石原, 和幸
Journal
歯科学報, 113(4): 423-423
URL
http://hdl.handle.net/10130/3134
Right
目的：喫煙は歯周病の重大なリスクファクターであ る。喫煙が歯周組織に及ぼす影響については，主に ニコチンを中心に研究がなされてきた。しかし，タ バコ煙が宿主細胞に及ぼす影響，とくに歯周病原細 菌の存在下における影響については，未だ明らかに されていない。そこで本研究では，タバコ煙抽出液 （CSC）の曝露とPorphyromonas gingivalis 感染がヒ ト歯肉上皮細胞の機能，とくに増殖能および遊走能 に及ぼす影響を検討した。 方法：ヒト歯肉上皮細胞 Ca９‐２２を１０％ FBS 添加 MEM にてコンフルエントに達するまで培養した。 任意の濃度のニコチンまたは CSC を２４h 作用させ た後，細胞の生死をトリパンブルー排除試験，細胞 増殖 能 を WST-１，遊 走 能 を wound healing assay にて評価を行った。細胞形態の変化は，共焦点レー ザー顕微鏡（CSLM）にて解析した。上皮細胞の遊 走に関与しているとされている integrin の発現局 在を CSLM にて観察し，mRNA 量を Real-time RT -PCR を用いて定量化した。以上の実験は，P.
gin-givalis ATCC ３３２７７の 感 染 下（MOI＝１００，２h）で
も行った。さらに，P. gingivalis の上皮細胞への侵
入を CSLM と Antibiotic protection assay にて評価 した。 結果と考察：喫煙者の唾液中濃度に相当するニコチ ン濃度の範囲において，Ca９‐２２の増殖能に変化は 認められなかった。CSC 濃度０．１‐５０μg/ml では遊 走能に濃度依存性の促進が認められ，CSLM では 細胞骨格に変化が観察された。２５０μg/ml（ニコチ ン濃度約６．０μg/ml）以上の CSC 濃度では遊走能 の抑制が認められたことから，CSC は濃度により Ca９‐２２に二相性の影響を及ぼすことが示唆さ れ た。また，遊走能を促進させた CSC 低濃度におい て，CSLM により integrinα３の scratch 側に近接 した細胞における発現強度の亢進が観察され，さら に mRNA 量は，約２倍の増加を示した。 一方，P. gingivalis を感染させると遊走能，integ-rinα３の発現は全体的に抑制され，CSC による促 進傾向は認められなかった。また，CSC 各濃度に おけるP. gingivalis の Ca９‐２２への侵入を観察する と，低濃度の CSC で増加していた。しかし，P. gin-givalis の侵入量に依存した遊走能の抑制は認められ なかった。 以上のことより CSC は，ヒト歯肉上皮細胞の細 胞生死に影響を与えない濃度範囲において，細胞遊 走能に二相性の影響を与え，さらにその影響はP. gingivalis 感染により修飾されることが示唆された。 目的：デンタルプラーク内では，種々の細菌間で共 生と拮抗が認められ，細菌叢組成の歯周病原性菌へ のシフトにも関わっている。菌種間の拮抗に関わる 分子には bacteriocin がある。Bacteriocin は，細菌 の分泌するタンパクで，同種や類縁種に抗菌スペ ク ト ル を も つ。Treponema denticola は，慢 性 歯 周 炎，根尖性歯周炎の病巣より高頻度で分離され，そ の発症と進行に重要な役割を果たしている。本菌は bacteriocin 様遺伝子とその分泌システムと考えら れる遺伝子群を持つが，その機能は明らかになって いない。本研究ではデンタルプラークに，T. denti-cola が定着・増殖し，歯周炎を引き起こすプロセス で，bacteriocin がどのような役割を果たしている かを明らかにする目的で，その分泌に関わるタンパ ク群の機能について解析を加えた。
方法：T. denticola ATCC３５４０５の持つ３種の bacte-riocin 分泌タンパクと類似性を持つ遺伝子群に含ま れ る ABC transporter の orthologue には TepA１， A２，A３の３種がある。これらの機能解析を目的 とし，TepA２の欠損株を作製し，１）OD６６０の吸 光度による増殖率，２）リアルタイム PCR による TepA１，TepA３の発現，３）スペクチノマイシ ン，クロラムフェニコール，リファンピンに対する 抗菌性を検索した。増殖率，抗菌性は菌を培地に接 種し，その OD６６０の測定により行った。TepA１， TepA３の発現は，１６S rRNA を内部標準とし Taq-Man プローブを用いて行った。 結果および考察：TepA２の欠損株の増殖速度は， stationary phase に達するまでほぼ野生株と同程度 であり，欠損による発育への影響は認められなかっ た。TepA１の発現には野生株と欠損株の間で変化 が認められなかったが，TepA３は欠損株での発現 が 野 生 株 に 比 べ５．７倍 の 発 現 が 認 め ら れ た（P＜ ０．０１）。この結果から欠損が何らかの作用を介し TepA３の発現上昇を導いていることが示唆され た。さらに抗菌剤に対する感受性ではエリスロマイ シン，リファンピンに対する感受性に変化が認めら れなかったが，クロラムフェニコールに対する感受 性が有意に低下し，TepA２の欠損が本菌のクロラ ムフェニコールに対する感受性に影響を与えている ことが示唆された。
口
演
№２：
Treponema denticola における Bacteriocin ABC transporter 様遺伝子の解析
額賀智之１），田中公子２），菊池有一郎３），新谷誠康２），村松 敬１），古澤成博１），石原和幸３） （東歯大・保存）１）（東歯大・小児歯）２）（東歯大・微生）３）
