〔原著〕松本歯学8
口腔内Bacteroides sp.の産生するムコ多糖体分解酵素,
特 に ヘ パ リ ナ ー ゼ に つ い て谷口裕朗 藤村節夫 中村武
松本歯科大学 口腔細菌学教室（主任 中村 武教授）
Studies on Mucopolysaccharidases from
Oral Bacteroides sp., especially on Heparinase.
HIROO TANIGUCHI SETSUO FUJIMURA and TAKESHI NAKAMURA Department of Oral Micr・bi・1・gy． MatSum・t・benlal C・llege （Chief： Prof T． Arahamura）
Summary
Mucopolysaccharide lyases in the cell extract from a oral strain of、Elacteroides sp． produced△4，5−unsaturated disaccharides from the’several substrates including， heparan sulfate， chondroitin sulfate A（ChS−A）， chondroitin sulfate C（ChS−C）， hyaluronic acid and chondroitin by the elimination reaction． However this enzyme preparation did not degrade chondroitin sulfate B（ChS−B）． As for production of heparinase， the presence of．heparin in the culture medium was essential． These enzymes were separated into two substrate specific groups upon gel filtration on a Sephadex G200 column． One catalyzed the degradetion of ChS−A， ChS−C， hyaluronic acid and chondroitin． The other catalyzed heparin’≠獅п@heparan sulfate． Heparinase， which was partially purified by’ammonium sulfate precipitation and hydroxylapatite column chromatography， degraded heparan sulfate besides heparin， but ChS−A， ChS−B， ChS−C， hyaluronic acid and chondroitin were皿digestive by this prepa・ ration． 緒 言 近年，歯肉炎および歯周炎の発症・経過に関連 する病原菌として，嫌気性グラム陰性桿菌，特に 本論文の要旨は第12回松本歯科大学学会例会（昭和56年 6月16日）および第13回松本歯科大学学会総会（昭和56年 11月28日）において発表された。（1982年5月7日受理） Bacteroides属が注目されている16） 17｝．これまで 歯周疾患に対する病原的役割を明らかにする目的 から，本菌群の種々の病原的属性が明らかにされ， 特に歯周組織崩壊を基盤とする結合組織の主要成 分であるコラーゲンを中心としたこれら基質を崩 壊する Ilacteroides melanin（）geniCttSの分解活性 ■ が示されている3）20）．しかし，B． melaninogenicus を除く，口腔内・Eincteroides sp．の産生酵素についての研究は殆んどなく不明である． 口腔内lincteroides sp．であるヘパリナーゼ産 生菌は，歯周疾患患者病巣およびモルモットを用 いての歯垢（歯肉溝）による実験感染症病巣局所 で顕著な増加が認められ7｝9｝18｝，且つまた，本菌 はIl2cteroides melaninogenicus， P7⑳わ痂加6’θ・ num acnesとの混合で種々の動物に実験感染症 を成立せしめる事から，混合感染症における病因 ないし進行経過の病原的一端を担っている菌種と して注目される8｝．本菌は，ヘパリンを含めた酸 性ムコ多糖体分解能を有する事から，その酵素学 的歯周組織崩壊機序における役割が示唆されても いる7）8）10）．しかし，本菌の分解酵素の性状につ いては不明である．また，ムコ多糖体分解酵素を 産生する種々の口腔細菌についてはすでに明らか となっているが，ヘパリンを含めたムコ多糖体分 解能を有する菌種の報告は，本lincteroide：s sp．以 外には見当らない． 本研究は，ヘパリン誘導によって産生される口 腔内」Eiacteroides sp．の本酵素による各種酸性ム コ多糖体分解を，主としてべ一パークロマトグラ フィーを用いて検索し，本酵素の分離・精製を行 いその性状について検討した．
研究方法
供試菌と培養 健康な成人歯垢（歯肉溝）をモルモットの大腿 鼠径部皮下に接種した実験混合感染症局所の膿汁 より分離されたllacteroides sp． No． 26株を使用 した8）．本菌は，menadione加血液平板（Heart infusion broth（Difco）3．0％， hemin s mg／e， menadione O．5 mg／4，馬脱線維血液10％，寒天 1．5％）で，2∼3週間毎に，継代培養（Anaerobic glove box内，37℃）されたものである． 集菌用基礎培地としてTrypticase broth（Try− ptlcase peptone （BBL） 1．7％， yeast extract O．3％，NaCl O．5％， K2HPO、0．2％， glucose O．25％，sodium thioglycolate O．05％， hemin 5．Omg／ e， menadione O．5 mg／のを用いた．培養 は，Anaerobic glove box内で行った． 粗酵素の抽出と調整法 ・Eincteroides sp． No．26株をヘパリン（0．69／ 2）加Trypticase brothで2日間培養した後，さ らに同量のヘパリンを添加し，24時間培養した． この培養液を遠心（10，000×9，4℃，20分）によっ て集菌した．菌体を0．05Mリン酸緩衝液（pH 7．0） で3回洗浄した．洗浄菌体を，3容の0．05Mリン 酸緩衝液（pH 7．0）に懸濁して， Kubota Insonator Model 200Mで，180W，30分超音波処理した．こ の処理液を遠心（3，000×9，4℃，20分）によって未 破砕の菌体を除去した後，上清をさらに超遠心 （105，000×g，4℃，60分）し，本上精を粗酵素液と した．なお，この粗酵素液の1皿⑫当りタンパク量 は10mgであった． ムコ多糖体分解活性の測定法 分解活性の測定は，各ムコ多糖体から分解に よって形成される4，5位不飽和二糖を Linker の方法5）に基づく吸光度232㎜の測定によって 行った． 粗酵素反応系は，酵素液0．lmeに対し，基質とし て，ヘパリン（50mg／mの，コンドロイチン硫酸A （ChS−A），コンドロイチン硫酸B（ChS−B），コ ンドロイチン硫酸C（ChS−C）〔各20 mg／me〕，ピ アルロン酸，コンドロイチン，ヘパラン硫酸〔各 5mg／me〕の各々0．02me（O．05Mリン酸緩衝液， pH 7．0に溶解）を加えち37℃，30分間反応させた後， 3％過塩素酸（2．9mのを加え，反応を停止した． この反応液を遠心して，その上清の232㎜にお ける吸収を測定した．また，精製酵素についても， これに準じて行った． なお，ムコ多糖体分解酵素活性の1単位は，上 述の条件下での，反応液1．Om￠当りの吸光度の増加 1．0を以って定義した． ペーパークロマトグラフィー 粗酵素液によるムコ多糖体からの分解糖は，反 応混液の遠心上清試料を東洋濾紙No．50A（長さ 60cm）にスポットして，イソ酪酸：ユMアンモニ ア水（5：3v／v）1｝を溶媒とした下降法により 展開した．なおスポットは上述の反応混液を4∼8時間incubate後100℃1分間加温によって
反応を停止させ，その遠心上清を使用した．糖の 検出は，トルイジンブルー試薬1），アルカリ性硝 酸銀試薬による呈色，および短波長紫外光（2537 A）の照射によって行った．松本歯学 8（1）1982 ムコ多糖体分解酵素の精製 a）Sephadex G−200によるゲル濾過 粗酵素液から硫酸プロタミン（0．2mg／mgタン パク量）の添加によって，核酸を除去した後，硫 安を50％飽和とし，沈殿を遠心（10，000×g，4℃， 20分）で除去し，硫安濃度を70％飽和にあげ，生 じた沈殿を集め，0．1Mリン酸緩衝液（pH 7．0）に 溶解し，この試料を同緩衝液に対し，4℃で24時間 透析した（硫安画分）．透析試料を同緩衝液で平衡 化したSephadex G−200カラム（2．6×74 cm）に 添加し，流速IOme／hで溶出し，分画はS me／tube とした． b）ヒドロキシルアパタイトカラムクロマトグラ フイー 前述の硫安画分を0．05Mリン酸緩衝液（pH 6．8） で透析した．この透析試料を同緩衝液で平衡化し たヒドロキシルアパタイトカラム（2．6×13cm， Hypatite C， Clakson Chemical Company）に添 加し，同緩衝液で洗浄後，食塩濃度勾配（0∼0． 7M）によって溶出した．流速20m￠／hとして，分 画は7m2／tubeで行った． タンパクの定量法 タンパク定量は，ウシ血清アルブミンを標準と して，Lowryらの方法6）により行った．
研究成績
菌体の超音波処理によって抽出した粗酵素のム コ多糖体に対する分解能は，Fig．1，2，3に示す如 5 1 三 巨 ξ 2s 匡 ξ VOLUME OF ENZYME《μml） Fig．1 Relationship between concentrations of the crude enzyme and the mucopolysaccharidase act1Vltles． ●，heparin；▲， ChS−A；■， hyaluronic acid． くである．ChS−Bを除くいずれの基質に対しても 吸光度の増加が認められた．また，その増加度は， 粗酵素量および基質量に比例していた（Fig． 1， 2）．この反応混液中の分解糖をペーパークロマト グラフィーで検索すると，ChS−Bを除くいずれの 基質からも，紫外光（2537A）吸収をもつ分解糖 スポットが認められた．また，この分解糖のスポッ トは，反応時間の経過と共にその吸光が強くなっ た．この成績から，粗酵素試料によって，ムコ多 ？ ≧ ； 9 5 ： ξ 望 田 0 5 1e SU8ST日A正CONCENTRATION《mg／ml， Fig．2 Relationship between substrate concentra・ tions and the mucopolysaccharidase activi− tles． ●，heparin；▲ChS−A；■， hyaluronic acid ミ 言 § 酉 き § Q ぐ meATION TzaAE《HOUR〕 Fig．3 The rate of the degradation of various mucopolysaccharides by the crude extracts． ●，heparin；○， heparan sulfate；▲， ChS−A； 口，ChS−B；△， ChS℃；■， hyaluronic acid．糖体が分解されていること，また吸光度232 nmに よるムコ多糖体分解酵素に関する定量法の妥当性 が確認された． 本法によって，粗酵素の各ムコ多糖体分解活性 をみると，ヘパリン，ヘパラン硫酸，ChS−A， ChS−C，ピアルPン酸でぱ，経時的に232 mnの吸 収の増加が認められた．しかし，ChS−Bでは，増 加が認められなかった（Fig．3）． ムコ多糖体からの分解糖 各基質の反応液の分解糖は，既知の4，5位不 飽和二糖である△Di−4S（2−acetamido−2−deoxy −3−O（β一D−gluco−4−enepyranosyluronic acid）− 4−O−sulfo−D−galactose），△Di−6S（2−acetamido− 2−deoxy−4−enepyranosyluronic acid）−Dgalac− tose）および△Di｛）S（2−acetamido−2−deoxy−3− 0−（β一D−gluo−4−enepyranosyluronic acid）−D− galactose）〔生化学工業〕を，標準として，ペー パークロマトグラフィーのRf値から同定した．
1
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㎏・ すなわち，ヘパリンおよびヘパラン硫酸から， △Di−TriS（O−（α一L−ido−4−enepyranosyluronic acid 2−sulfate）一（1→4）−2−sulfoamino−2−deoxy −D−glucose−6−sulfate）（Fig． 4）， ChS−Aからは， △Di−4S と △Di−OS， ChS−C から △M−6S と △Di−OS（Fig．5），ピアルロン酸から△Di−GNAc （β）（2−acetamide−2−deoxy−30−｛β一D−gluco−4− enepyranosyklronic acid）−D−glucose）がそれぞ れ検出された． 粗酵素の至適pHと温度 ムコ多糖分解の至適pHの検討には，0．05Mエ チレンジアミンー酢酸緩衝液を使用した．いずれ のムコ多糖体においても，pH 7，0で最大の分解活 性が認められた（Fig．6）． 至適温度の検討には，“研究方法”で示した粗酵 素反応系を使用して，60分間，各温度で作用させ た・いずれのムコ多糖体も，37℃で最も高い活性 を示した（Fig． 7）． また，本粗酵素は，60．C，5分で失活する易熱 性であった． ’．liw l． 灘≧．ご．ぶ 雀三． ・．c声・． ぷ 癒i1 23
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Fig．4 Paper chromatograms of digestive pro（1− ucts of heparin and heparan sulfate． 1．hepar三n without enzyme treatment． 2．after incubation for 8 hr， heparin digests． 3、heparan sulfate without enzyme treat− ment． 4．after incubation for 8 hr， heparan suifate digests． The spots were stained with AgNO3 reagent． Hatching indicates△Di−TriS（di− sacc｝〕aride trisulfte）． Fig．5 Paper chromatograms of digestive pro・ ducts of ChS−A and ChS−C． 1．after incubation for 8 hr， ChS−A digests． 2．after incubation for 8 hr， ChS−C digests． 3．authentic unsaturated disacchaエides． A、△Di−6S；B，△Di−4S；C，△Di−OS． The spots were stained with AgNO3 reagent．酵素の分離・精製 粗酵素試料から得た硫安画分にっいて，分解活 性を検討したところ，50∼70％硫安画分に各種ム コ多糖体分解活性が認められた．その回収率は， 70∼90％であり，比活性は，約4倍上昇した．こ の硫安画分をSephadex G−200カラムを用いゲ ル濾過すると溶出パターンは，Fig．8に示す如く ＝ 日 ＼ コ て ヒ ≧2 0 ＜ 凹 ＞ N 之 四 0 −
5678910
pH Fig．6 Effect of pH on mucopo］ysaccharidase activities of the crude extracts． The conditions of the experiment were des− cribed in the text． Incubation was carried out for 30 min． ●，heparin；○， hepara㎡surfate；▲， ChS−A； ■，hyaluronic acid． EAcoi
i… 竃 15 、。‖ 雲 ヨ ・i o 0 20 30 40 50 60 70 80 90 100 用AC㎜㎜ Fig．8 Gel filtration of ammonium sulfate pre− cipitation on a Sephadex G−200 column． ○，heparin；▲， ChS−A；□， hyaluronic acid． ●，absorbance at 280 nm である．280nmの吸収で2つのピークが認めら れ，ムコ多糖体分解活性は後者のピークに認めら れた．各基質に対する分解活性は，2つのピーク として認められた．すなわち，ChS−A， ChS−Cおよびピアルロン酸分解活性は，fraction
No．44∼66の範囲においてピークが認められ，ヘ パリンおよびヘパラン硫酸分解活性は，fraction No．52∼68の範囲においてピークを示した．この 3 ？≧2
： ヒ ≧ 1−o
＜ 四 E 1 ＞N
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山 0 ‘N−−t ソロ 20 30 40 50 TEMPERATURE（OC） Fig．7 Effect of temperature on the mucopolysac− charidase activities of the crude extracts。 Incubation was carried out for 60 min． ●，heparin；○， heparan suifate；▲， ChS−A； ■，hyaluronic acid． 言 …i
髪 FRAcnOW｛ 望 …9
i・・ ep Fig．9 Partial purification of heparinase by chro− matography on hydroxylapatite column． ○，heparin；△， heparan sulfate；口， ChS−A； ■， hyaluronic acid．●， absorbance at 280 nm ； ，NaCI concentration． き § 三成績から本菌の種々のムコ多糖体に対する分解作 用は単一酵素に、よるものでない事が示唆された． しかし，これらの分解酵素をSephadex G−200に よって完全に分離することが出来なかった． そこで，50∼70％硫安画分を用いて，ヒドロキ シルアパタイトカラムによって分離を試みた．そ の溶出パターンは，Fig． 9に示した．食塩の濃度勾 配によるタンパク質の溶出は，明らかなピークと して認められなかった．ヘパリンおよびヘパラン 硫酸分解活性はいずれも，食塩濃度0．1∼0．4Mで 溶出するfraction No．28∼54の範囲で一致した ピークとして認められた．しかし，これらの fraction中には， ChS−A， ChS−Cおよびピアルロ ン酸に対する分解活性が認められなかった．また， ChS−A， ChS℃およびピアルロン酸分解活性は， その他の食塩濃度溶出fraction中にも認められ ず，さらに食塩濃度をあげてもこれらの基質分解 活性の溶出が認められなかった．しかし，非吸着 溶出画分中には，ヘパリンおよびヘパラン硫酸分 解活性が認められないが，その他の基質分解活性 がわずかながら認められた．以上の成績から本カ ラムによって，先のSephadex G−200カラムのゲ ル濾過で分離された2つの酵素中，少なくとも， ヘパリンおよびヘパラン硫酸を分解するヘパリ ナーゼが認められたものと考えられる．このヒド ロキシルアパタイトカラムによる分離，精製段階 で，粗酵素のヘパリナーゼ活性が，82％回収され， 比活性は，38倍に上昇した（Table）．また，この 料試は，ポリアクリルアミドゲル（7．5％）電気泳 動（pH 8。0）21）により，7本のタンパク質パンドが 認められた． ヘパリナーゼのムコ多糖体分解能 ヒドロキシルアパタイトカラムによって得た活 性fractionを濃縮（ヘパリナーゼ活性5．0単位／ Table． Purification of heparinase from lizcteroides sp・
Toto｜ 5peこifk Purifにotbn Yleld
5tep qcMty qctivity
u u∫mg 一fold （％｝ 1．Crude extroct 944 0．50 1 100 2．Protαmine Sulfote 1，141 0．77 1．5 120 3Ammonium Su【fqte 804 2．08 42 85 4Hydroxytopotit仔colurnn 776 1882 38 82 me）し，種々のムコ多糖体分解能について，再検 討した．その成績は，Fig． 10に示す如く，ヘパリ ンおよびヘパラン硫酸では，いずれも吸光度232 nmの経時的増加を示した．これに対し， ChS−A， ChS−B， ChS−℃，ヒァルロン酸およびコンドロィ チンでは，吸光度の増加が認められなかった．こ の吸光度の増加を示したヘパリンおよびヘパラン 硫酸反応液から，分解糖である△Di−Trisが検出 され，それぞれ粗酵素材料で認められた分解糖と 同様である事が確認された．しかし，吸光度の増 加が見られなかった他の基質反応液からは，全く 分解糖が検出されなかった． 考 察 口腔内Iincteroides sp．の菌体抽出酵素によっ て種々のムコ多糖体が分解され，その分解糖とし て，’4．5位不飽和二糖を検出した．また，この不飽
和二糖を232㎝の吸光度で測定することによ
り，ムコ多糖体分解活性の定量ざ可能であること を確認した．一般に細菌の産生するムコ多糖体分 解酵素は，動物組織由来の加水分解酵素と異なり， リアーゼであるといわれている5）．すでに口腔内 コElacteroides sp．の巾広いムコ多糖分解能は注目さ れていたが，8）その酸素学的分解作用などについ ては不明であった．本研究において菌体から抽出 した粗酸素もまた，いずれの分解基質からも4， 5位不飽和二糖が検出されることから，本菌のム コ多糖体分解酵素もリアーゼと考えられる． 一方，細菌のムコ多糖体分解酵素の基質特異性 は，各菌種によって異なる．PneumococCi， Sta− Phylococci． StrePtococciなどが産生するピアルロ t．o 匡 § ミ §。．5 き § G ““CUBATION TIME《”‘N， Fig．10 The rate of the degradation of various mucopolysaccharides by partially purified heparinase． ○，heparin；●， heparan sulfate；■， ChS−A， ChS−B， ChS−C， hyluronic acid， chondroitin．松本歯学 8（1）1982 ニダーゼは，ピアルロン酸およびコンドロイチン のみに作用し，硫酸基をもつコンドロイチン硫酸 およびヘパリンなどには作用しない5）．これら硫 酸基をもつムコ多糖体に作用するコンドロィチ ナーゼおよびヘパリナーゼを産生する細菌とし て，今日良ぐ知られているP拘勧svulgarisおよ び肋〃o加6磁μ吻触励μ勿がある5）．これら細 菌のコンドロイチナーゼはピアルロン酸およびコ ンドロイチンにも，ある程度作用することが示さ れている19｝．また，」％仇γo鋤S属では，腸管由来 のB．thelaiotaomicron， B． diStasonis， B． ovattdS などのムコ多糖体分解能が示され，特にB．the− taiolaomicroηの菌体抽出酵素は，種々のコンドロ イチン硫酸をも分解する13｝．しかし，ヘパリン， ピアルロン酸などの作用は不明である．口腔細菌 中，特にヘパリンを含めたムコ多糖体分解能を有 するものは，本菌以外に見当たらず，基質特異性 の比較はできない．本菌からの抽出酵素は，ヘパ リン，ヘパラン硫酸を含めたChS−A， ChS℃およ びピアルロン酸を幅広く分解することから，土壌 由来のEhepa「inumに近似しているものと言え る．また，本菌からの抽出酵素は，ChS−A，および ChS℃からそれぞれ△Di−4Sと△Di−6Sの他に △Di−（）sが検出されることから， R vulgariSや F．W物μ勿に見られるリアーゼの他に，スル ファターゼも認められる19）のと同様，本菌酵素中 にも△Di∼4Sおよび△Di−6Sの硫酸基を加水分 解するスルファターゼが存在することが示唆され た．また，本菌の酵素をChS−AおよびChS−Cと 長時間（18∼24時間）反応させると，分解糖とし て△Di−OSより高いRf値をもつ糖も検出され た（未発表データ）．この分解糖は，N一アセチル ガラクトサミンに近似するRf値を示すことか ら，△DiOSをさらに分解するβ一グルクロニ ダーゼの存在も示唆される． liacterqides sp．の粗酵素を硫安画分およびヒド ロキシルアパタイトカラムにより分離したヘパリ ナーゼは，ヘパリンおよびヘパラン硫酸のみを分 解した．HovinghとLinker 4）は， F． heparinum の精製ヘパリナーゼをヘパリンおよびヘパラン硫 酸に作用させたとき，その至適pHおよび至適温 度に差がなかったので，単一の酵素によって二つ の異なる基質を分解すると報告している．励C・ teroides sp．のヘパリナーゼにおいても，ヘパリン 21 およびヘパラン硫酸に対する至適pH（7．0）と至 適温度（37℃）の間に差が認められなかったので， F．hOPa「inumの場合と同様，単一酵素による複数 基質の分解の可能性もある．しかしながら，ポリ アクリルアミドゲル電気泳動において，この試料 では，なお数本のタンパク質バンドが認められる ことから，さらに精製された試料での検討が必要 である． 一方，食塩濃度勾配溶出によるヒドロキシルア パタイトカラムクロマトグラフィーでは，ChS−A， ChS−C，コンドロィチンおよびヒァルロン酸分解 活性の収量は，極端に低かった．粗酵素において， ピアルロン酸分解酵素活性は，0．4M以上の食塩の 存在下では低下することが確かめられている（未 発表データ）．このことがヒドロキシルアパタイト カラムクロマトグラフィーでの，ChS−A， ChS−C， コンドロイチンおよびピアルロン酸分解活性の極 端な低回収の原因になっている可能性もある．事 実，Dietrichら2｝も，これと類似した現象を報告 している．しかしながら本研究によって口腔内 盈励θm鋤ssp．のムコ多糖体分解は，少なくとも 二つの基質特異性の異なる酵素群によることが明 らかになった．さらに精製を重ねこれら酵素のム コ多糖体分解の機序を解明したい． 結 論 口腔内Elacteroides sp．の菌体から抽出したム コ多糖体分解酵素は，脱離反応によってヘパリン， ヘパラン硫酸，コンドロイチン硫酸A（ChS−A）， コンドロイチン硫酸C（ChS−C），ピアルロン酸お よびコンドロイチンを分解した．これらいずれの 分解基質からも，4，5位不飽和二糖が検出され た．しかし，この分解酵素は，コンドロイチン硫 酸B（ChS−B）を分解しなかった．また，ヘパリ ン分解活性は，ヘパリンを培地に添加することが 必須であった． 本菌のムコ多糖体分解酵素は， Sephadex G−200 カラムによるゲル濾過で，二つの基質特異性の異 なる群の存在が示された．すなわち，ChS−A， ChS−C，ヒァルロン酸およびコンドロイチンを分 解する酵素群とヘパリンおよびヘパラン硫酸を分 解する酵素群であった． 菌体抽出液を硫安沈殿およびヒドロキシルアパ タイトカラムによって部分精製したヘパリナーゼ
は，ヘパリンの他に，ヘパラン硫酸を分解した． しかし，本ヘパリナーEは，ChS−A， ChS−B， ChS｛⊃，ヒァルロン酸およびコンドロイチンを分 解しなかった． 参考文献 1）Dietrich， C． P．（1968）Novel heparin degrada− tion products． Biochem． J。108：647−654． 2）Dietrich， C． P．， Silva， M． E． and Michelacci， Y． M．（1973）Sequential degradation of heparin in Flavobacteri’um hOpaηinum． J． biol． Chem。248： 6408−6415． 3）Gibbons， R． J． and Macdonald， J． B．（1961） Degradation of collagenous substances by jllacteroides melaninogenictcs．」． Bacterio1．81： 614−621． 4）Hovingh， P． and Linker， A、（1970）The enzy− matic degradation of heparin and heparan sulfate． J． bioL Chem．245：6170∼6175． 5）Linker， A．（1966）Bacterial mucopolysacchari− dases．（Mucopolysaccharide lyases．）Methods in EnzymoL 8：650−654． 6）Lowry， O． H．， Rosenbrough， N． J．， Farr， A． L． and Randall， R． J．（1951）Protein measurement with the Folinっhenol reagent． J． biol． Chem． 193：265−275． 7）中村武（1969）口腔内嫌気性Heparinase産生 菌に関する研究．十全会誌，78：509−530． 8）中村 武，杉中芳幸，小幡直樹，青木宣夫（1975） 混合感染能を有する口腔内嫌気性菌の酸性ムコ多 糖体と脂質分解酵素に関する研究．松本歯学，1： 11−21． 9）中村 武，杉中芳幸，高添一郎，奥田克爾（1976） 口腔内Propionihacteri’um acnesのChondroitin Sulfataseに関する研究．松本歯学，2：140 −145． 10）Nakamura， T．， Suginaka， T． and Takazoe，1． （1976）Heparinase activity in Iesion of perio− dontal disease． Bull． Tokyo dent． Coll．17： 147−155． 11）Rudek， W． and Haque， R．（1976）Extracellular enzymes of the genus lizcteroides． J． clin． MicrobioL 4：458−460． 12）Salyers， A． A．， Vercellotti， J． R， West， S． E． H． and Wilkins， TD．（1977）Fementation of mucin and plant polysaccharides by strains of lincteroides from human colon． AppL environ． Microbiol．33：319−322． 13）Salyers， A． A． and O’Brien， M（1980）Cellular location of enzymes involved in chondroitin sulfate breakdown by 、Eincteroides thelaiotzo− micron．．J． Bacteriol．143：772−780． 14）Schultz−Haudt， S． D． and Scherp， H． W．（1955） Production of hyaluronidase andβ一glucuroni− dase by Viridans Streptococαi from gingivaI crevices． J． dent． Res．34：924−929． 15）Schulz−Haudt， S． D． and Scherp， H． W．（1956） The production of chondrosulfase by micro− organism isolated from human gingival crevic− es． J． dent． Res．35：299−307． 16）Slots， J．（1979）Subgingival microflora and periodontal disease． J． clin． PeriodontoL 6： 351−382． 17）Socransky， S． S．（1977）Microbiology of perio− dontal disease．−Present status and future considerations． J． Periodonto1．48：497−504． 18）Takazoe，1． and Nakamura， T．（1971）Experi− mental mixed infection by human gingivaI crevice material． BulL Tokyo dent． ColL 12： 85−93． 19）Yamagata， T．， Saito， H．， Habuchi，0． and Suzuki， S．（1968）Purification and properties of bacterial chondroitinases and chondrosulfatas− es． J． bioL Chem．243：1523−1535． 20）山本綾子（1973）口腔内Ilacteroides melanino− genicusのco11agenase活性に関する研究．歯科学 報， 73：1155−1171． 21）Williams， D． E．．and Reisfeld R． A．（1964）Disc electrophoresis in polyacrylamide gels：exten− sion to new conditions of pH and buffer． Ann． N．Y． Acad． Sci．121：373∼381
