培養肢芽間充織細胞の自律的凝集パターン形成過程
の定量解析
著者
北嶋 慶一
号
18
学位授与機関
Tohoku University
学位授与番号
生博第417号
URL
http://hdl.handle.net/10097/00131545
氏 名 （ 本 籍 地 ）
学 位 の 種 類
学 位 記 番 号
学 位 授 与 年 月 日
学 位 授 与 の 要 件
研 究 科 ， 専 攻
論
文
題
目
博士論文審査委員
き た じ ま け い い ち北 嶋 慶 一
博 士 （ 生 命 科 学 ）
生 博 第 ４ １ ７ 号
令 和 ３ 年 ３ 月 ２ ５ 日
学 位 規 則 第 ４ 条 第 １ 項 該 当
東 北 大 学 大 学 院 生 命 科 学 研 究 科
（ 博 士 課 程 ） 生 命 機 能 科 学 専 攻
培 養 肢 芽 間 充 織 細 胞 の 自 律 的 凝 集 パ タ ー ン 形 成 過 程
の 定 量 解 析
（ 主 査 ） 田 村 宏 治
熊 野 岳
小 金 澤 雅 之
論 文 内 容 の 要 旨
序 論 四 足 動 物 の 骨 格 は 複 雑 な 形 態 を 持 っ て い る 。 多 く の 骨 要 素 が 適 切 な 大 き さ と 位 置 に 形 成 さ れ て は じ め て 、 機 能 的 に 働 く こ と が 可 能 と な る 。 こ の 複 雑 で 機 能 的 な 形 態 は 、 ど の よ う に し て 作 ら れ て く る の だ ろ う か ？ 多 く の 先 行 研 究 で 、 遺 伝 子 機 能 解 析 に よ る 四 肢 骨 格 形 成 へ の 影 響 が 調 べ ら れ て き た 。 し か し 、 遺 伝 子 機 能 を 理 解 す る と い う 視 点 は 、 形 態 形 成 に 対 す る 理 解 の 一 側 面 で し か な い 。 実 際 の 生 物 が 、 ど の よ う に 隣 接 す る 細 胞 の 遺 伝 子 発 現 状 態 を 認 識 し て 、 順 序 よ く 規 則 的 な 形 態 を 形 成 し 、 最 終 的 に 、 全 体 と し て 機 能 す る 形 態 を 再 現 よ く 作 る こ と が で き る の か 。 こ の 複 雑 な プ ロ セ ス を 理 解 す る た め に は 、 遺 伝 子 の み に 着 眼 す る の で は な く 、 実 際 の 体 を 構 成 し て い る 細 胞 そ の も の の 動 態 に 着 眼 し 、 細 胞 が ど の よ う に し て 振 る 舞 い 、 規 則 的 な パ タ ー ン を 作 り 出 せ る の か を 理 解 す る こ と が 不 可 欠 だ 。 そ う し た 細 胞 間 相 互 作 用 に 着 目 し た 四 肢 軟 骨 パ タ ー ン 形 成 研 究 の 例 と し て 、 い く つ か の 数 理 モ デ ル が 提 案 さ れ て い る （Raspopovic et al., 2014, Mochizuki et al., 1998, Glim et al., 2014）。し か し 、現 在 提 唱 さ れ て い る モ デ ル の 多 く は 実 証 研 究 に 乏 し く 、実 際 の 生 物 で い つ ど ん な 細 胞 間 相 互 作 用 が 生 じ て パ タ ー ン 形 成 を 行 っ て い る の か が 未 解 明 で あ り 、 本 当 に こ れ ら の モ デ ル で 説 明 で き る の か は っ き り し な い の が 現 状 だ 。 ど ん な モ デ ル が 正 し い の か を よ り 正 確 に 推 定 す る た め に は 、 ① 実 際 の 生 物 の 細 胞 の 振 る 舞 い を 定 量 化 し て 、 ② そ れ を も と に モ デ ル を 提 案 し 、 ③ パ タ ー ン 制 御 因 子 を 操 作 す る こ と で モ デ ル か ら 予 想 さ れ る パ タ ー ン の 変 更 を 実 際 の 生 物 で も 再 現 で き る の か を 確 か め る 必 要 が あ る 。 本 研 究 で は 個 々 の 細 胞 に 着 目 し 、 細 胞 運 動 の 定 量 解 析 を す る こ と で 、 体 を 構 成 す る 細 胞 集 団 が ど ん な プ ロ セ ス で 相 互 作 用 し て 遺 伝 子 発 現 を 制 御 し 、 秩 序 立 っ た 四 肢 軟 骨 パ タ ー ン を 形 成 す る の か 理 解 す る こ と を 最 終 目 標 と す る 。 1 章 micromass culture の 基 礎 解 析 最 終 目 標 の 達 成 の た め に は 、 ま ず 、 四 肢 を 形 成 す る 細 胞 集 団 の 挙 動 を 理 解 す る た め の 、 わ か り や す い シ ン プ ル な 実 験 系 を 確 立 す る 必 要 が あ る 。 生 体 よ り も シ ン プ ル だ と 思 わ れ る 培 養 系 の ひ と つ と し て 、 ニ ワ ト リ 肢 芽 間 充 織 を 高 密 度 で 培 養 す る micromass culture と 呼 ば れ る 培 養 法 が 挙 げ ら れ る 。 こ の 培 養 法 を 特 定 の 時 期 の ニ ワ ト リ 胚 肢 芽 間 充 織 の 細 胞 集 団を 用 い て 行 う と 、 軟 骨 に 分 化 す る 細 胞 凝 集 塊 （nodule） が 形 成 さ れ る こ と が 知 ら れ て い る （Hattori and Ide, 1984）。 私 は 、 こ の micromass culture を 行 っ た 際 に 形 成 さ れ る 細 胞 凝 集 塊 が 規 則 的 な パ タ ー ン に な る こ と に 着 目 し て 、 軟 骨 パ タ ー ン 形 成 時 の 細 胞 挙 動 の 調 査 を 、 こ の 培 養 系 か ら は じ め る こ と に し た 。 す な わ ち 、 ニ ワ ト リ 胚 肢 芽 間 充 織 の micromass culture に お い て 形 成 さ れ る 規 則 的 な 軟 骨 凝 集 パ タ ー ン が ど の よ う な 細 胞 動 態 に よ っ て 形 成 さ れ る の か を 説 明 す る こ と を 当 面 の 課 題 と し た 。 こ の 問 題 を 明 ら か に す る た め に 、 本 研 究 で は ま ず 、micromass culture に お い て 、 い つ ど の よ う な パ タ ー ン が で き る の か 、 主 要 な 遺 伝 子 発 現 は い つ ど の よ う に 起 こ る の か と い っ た 基 礎 解 析 を は じ め に 行 っ た 。 2 章 ニ ワ ト リ 細 胞 に お け る 光 刺 激 に よ る 遺 伝 子 発 現 誘 導 シ ス テ ム の 開 発 次 に 、micromass culture 系 に お い て パ タ ー ン を 時 空 間 特 異 的 に 操 作 す る た め の 実 験 ツ ー ル の 開 発 を 行 っ た 。 今 後 、 軟 骨 パ タ ー ン 形 成 モ デ ル を 提 案 し た 場 合 に 、 そ の モ デ ル が 実 際 に 生 物 で 使 わ れ て い る こ と を 実 証 す る 際 に パ タ ー ン の 操 作 実 験 が 必 要 に な る 。具 体 的 に は 、 モ デ ル か ら 予 想 さ れ る パ タ ー ン 制 御 因 子 を 操 作 し 、 モ デ ル に よ る 予 想 と 一 致 す る パ タ ー ン の 変 更 を 実 際 に 引 き 起 こ す こ と が で き る の か ど う か を 調 べ る こ と で 、 提 案 し た モ デ ル が 生 物 で 使 わ れ て い る の か を 確 か め る こ と が で き る 。 し か し 、 ニ ワ ト リ 胚 お よ び ニ ワ ト リ 細 胞 に お い て 、 時 空 間 特 異 的 に 任 意 の 遺 伝 子 発 現 を 操 作 す る ツ ー ル は 現 時 点 で 存 在 し な い 。 そ こ で 今 回 、 光 刺 激 に よ っ て 時 空 間 特 異 的 に 遺 伝 子 発 現 制 御 を 行 う こ と が で き る シ ス テ ム の 開 発 を 行 っ た 。 3 章 micoromass culture パ タ ー ン 形 成 時 の 細 胞 集 団 運 動 の 解 析 最 後 に 、 単 細 胞 レ ベ ル で の 細 胞 運 動 の 定 量 化 を 前 提 と し た 、 長 期 間 ラ イ ブ イ メ ー ジ ン グ を 行 っ た 。 私 は 、 軟 骨 凝 集 パ タ ー ン を 作 り 出 す 細 胞 同 士 の 振 る 舞 い を モ デ ル 化 す る た め に は 、 軟 骨 分 化 に 先 立 っ て 各 細 胞 が ど の よ う に 動 き 回 り 凝 集 し て い る の か を 定 量 化 す る こ と が 必 要 だ と 考 え た 。 細 胞 培 養 を 開 始 し て か ら 、 細 胞 が 凝 集 し 、 規 則 的 な 凝 集 パ タ ー ン が で き る ま で の 全 プ ロ セ ス の ラ イ ブ イ メ ー ジ ン グ を 行 い 、 解 析 に よ っ て 見 え て き た 問 題 点 に つ い て 報 告 す る 。 総 合 議 論
1 章 よ り 、micromass culture 系 に お け る 軟 骨 パ タ ー ン 形 成 過 程 を 定 量 化 し 、詳 細 な 理 解 が 進 ん だ 。 さ ら に 、3 章 で は 、 長 時 間 に 渡 っ て 間 充 織 細 胞 集 団 が パ タ ー ン を 形 成 す る 様 子 を 細 胞 レ ベ ル で 観 察 す る こ と に 成 功 し た 。 今 後 は 、 撮 影 し た ラ イ ブ イ メ ー ジ ン グ デ ー タ を も と に 、 細 胞 の 集 団 運 動 の 定 量 解 析 を 進 め て い く こ と が 重 要 だ と 考 え ら れ る 。 細 胞 集 団 運 動 の 傾 向 や 法 則 性 か ら 、 細 胞 挙 動 の モ デ ル 化 を 目 指 す 。 細 胞 挙 動 を モ デ ル 化 す る こ と が で き た と き 、 そ の モ デ ル が 実 際 の 細 胞 で 使 わ れ て い る の か の 検 証 を す る こ と に な る 。2 章 で 確 立 し た 光 刺 激 遺 伝 子 発 現 制 御 シ ス テ ム は 、 こ の 検 証 実 験 に 最 適 な シ ス テ ム だ と 言 え る 。 こ う し た 方 法 論 で 、 細 胞 挙 動 を も と に 新 た な モ デ ル を 樹 立 し 検 討 す る こ と と 、 既 存 の モ デ ル の 再 検 討 を す る こ と で 、 自 律 的 な 細 胞 同 士 の 相 互 作 用 に よ っ て 、 規 則 的 な 軟 骨 パ タ ー ン が 形 成 さ れ る メ カ ニ ズ ム を 理 解 す る こ と が 可 能 に な る だ ろ う 。 文 献
Glimm, T., Bhat, R., Newman, S. A. (2014). Journal of theoretical biology, 346, 86-108. H a t t o r i , T . a n d I d e , H . ( 1 9 8 4 ) . E x p . C e l l R e s . 1 5 0 , 3 3 8 – 3 4 6 .
Mochizuki, A., Wada, N., Ide, H., Iwasa, Y. (1998). Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists, 211(3), 204-214.
論 文 審 査 結 果 の 要 旨
四 足 動 物 の 骨 格 は 複 雑 な 形 態 を 持 っ て お り 、 多 く の 骨 要 素 が 適 切 な 大 き さ と 位 置 に 形 成 さ れ て は じ め て 機 能 的 に 働 く こ と が 可 能 と な る 。 本 研 究 で は 、 ど の よ う に 隣 接 す る 細 胞 ど う し が 相 互 作 用 し て 順 序 よ く 規 則 的 な パ タ ー ン を 形 成 し 、 最 終 的 に 全 体 と し て 機 能 す る 形 態 を 再 現 よ く 作 る こ と が で き る の か に つ い て ア プ ロ ー チ し て い る 。 細 胞 間 相 互 作 用 に 着 目 し た 四 肢 軟 骨 パ タ ー ン 形 成 研 究 の 例 と し て 、 い く つ か の 数 理 モ デ ル が 提 案 さ れ て い る が 、 提 唱 さ れ て い る モ デ ル の 多 く は 実 証 研 究 に 乏 し い 。 ど の よ う な モ デ ル が 正 し い の か を よ り 正 確 に 推 定 す る た め に は 、 ① 実 際 の 生 物 の 細 胞 の 振 る 舞 い を 定 量 化 し て 、 ② そ れ を も と に モ デ ル を 提 案 し 、 ③ パ タ ー ン 制 御 因 子 を 操 作 す る こ と で モ デ ル か ら 予 想 さ れ る パ タ ー ン の 変 更 を 実 際 の 生 物 で も 再 現 で き る の か を 確 か め る 必 要 が あ る 。 本 研 究 で は 、 個 々 の 細 胞 の 挙 動 に 着 目 し 、 細 胞 運 動 の 定 量 解 析 を す る こ と で 、 器 官 を 構 成 す る 細 胞 集 団 が ど ん な プ ロ セ ス で 相 互 作 用 し て 遺 伝 子 発 現 を 制 御 し 、 秩 序 立 っ た 四 肢 軟 骨 パ タ ー ン を 形 成 す る の か を 明 ら か に し た 。1 章 micromass cult ure の 基 礎 解 析
シ ン プ ル な 実 験 系 と し て 、 ニ ワ ト リ 肢 芽 間 充 織 を 高 密 度 で 単 層 培 養 す る micromass culture と 呼 ば れ る 培 養 法 を 取 り 上 げ 、 こ の micromass cul ture を 行 っ た 際 に 細 胞 凝 集 塊 が 規 則 的 な パ タ ー ン に な る こ と に 着 目 し て 、 軟 骨 パ タ ー ン 形 成 時 の 細 胞 挙 動 の 調 査 を お こ な い 、 い つ ど の よ う な パ タ ー ン が で き る の か 、 主 要 な 遺 伝 子 発 現 は い つ ど の よ う に 起 こ る の か に つ い て 基 礎 デ ー タ を ま と め 、 細 胞 密 度 の 不 均 一 性 が 軟 骨 凝 集 と パ タ ー ン 形 成 に 重 要 で あ る こ と を 示 し た 。 2 章 ニ ワ ト リ 細 胞 に お け る 光 刺 激 に よ る 遺 伝 子 発 現 誘 導 シ ス テ ム の 開 発 軟 骨 パ タ ー ン 形 成 モ デ ル を 提 案 し た 場 合 、 そ の モ デ ル が 実 際 に 生 物 で 使 わ れ て い る こ と を 実 証 す る 際 に 、 パ タ ー ン の 操 作 実 験 （ 摂 動 ） が 必 要 に な る 。 mic romass culture 系 に お い て パ タ ー ン を 時 空 間 特 異 的 に 操 作 す る た め の 、 光 刺 激 に よ っ て 時 空 間 特 異 的 に 遺 伝 子 発 現 制 御 を 行 う こ と が で き る シ ス テ ム を 開 発 し た 。
3 章 micoromass cul ture パ タ ー ン 形 成 時 の 細 胞 集 団 運 動 の 解 析
軟 骨 凝 集 パ タ ー ン を 作 り 出 す 細 胞 同 士 の 振 る 舞 い を モ デ ル 化 す る た め に は 、 軟 骨 分 化 に 先 立 っ て 各 細 胞 が ど の よ う に 動 き 回 り 凝 集 し て い る の か を 定 量 化 す る こ と が 必 要 だ と 考 え ら れ る 。 そ の た め の 、 単 細 胞 レ ベ ル で の 細 胞 運 動 の 定 量 化 を 前 提 と し た 、 長 期 間 ラ イ ブ イ メ ー ジ ン グ 系 の 構 築 に 成 功 し た 。 細 胞 培 養 を 開 始 し て か ら 、 細 胞 が 凝 集 し 、 規 則 的 な 凝 集 パ タ ー ン が で き る ま で の 全 プ ロ セ ス の ラ イ ブ イ メ ー ジ ン グ が で き る よ う に な っ た が 、 解 析 の 上 で の 問 題 点 も 見 つ か っ た 。 こ れ ら の 解 析 デ ー タ を も と に 、 細 胞 挙 動 を も と に 新 た な モ デ ル を 樹 立 し 検 討 す る こ と の 重 要 性 、 既 存 の モ デ ル を ど の よ う に 再 検 討 す る べ き か 、 自 律 的 な 細 胞 同 士 の 相 互 作 用 に よ っ て 規 則 的 な 軟 骨 パ タ ー ン が 形 成 さ れ る メ カ ニ ズ ム 、 に つ い て 考 察 し て い る 。
こ れ ら の 内 容 は 、 本 論 文 の 著 者 が 、 自 立 し て 研 究 活 動 を 行 う に 必 要 な 高 度 の 研 究 能 力 と 学 識 を 有 す る こ と を 示 し て い る 。 し た が っ て 、 北 嶋 慶 一 提 出 の 論 文 は 、 博 士 （ 生 命 科 学 ） の 博 士 論 文 と し て 合 格 と 認 め る 。
