シロイヌナズナNudix hydrolaseファミリーの機能解析
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(2) 一38一. デ ー タ ベ ー ス 解 析 の 結 果 、 シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ ゲ ノ ム に はAt醐. 沿X2を 含 む27種. 類 のNudxihydrolase(AtNUDXl-. 27)遺 伝 子 が 存 在 した 。 ま た 、 そ れ ら は 推 定 ア ミ ノ 酸 配 列 か ら細 胞 質(At剛DXI-ll,25)、 (AtNUDX12-18)、. 葉 緑 体(At㎜X19-24,26,27)に. 局 在 す る と 推 測 され た 。そ こで 植 物 に お け るNudixhydrolase. フ ァ ミ リー の 生 理 機 能 を 明 らか に す る た め に 、 細 胞 質 局 在 型 のAt㎜Xl-ll,25の ず 、 大 腸 菌 を 用 い てAt㎜Xの. 性)を. 変 異 原 と な る8-oxo《d)GTPに. 示 した こ とか ら 、 大 腸 菌MutTお. よ び ヒ トMTHIと. 酸 化 損 傷 の 修 復 に 機 能 し て い る こ とが 示 唆 され た 。 ま た 、At㎜Xllお CoAお. よ び シ グ ナ ル 分 子 で あ るAp訊. ADP一 リ ボ ー ス お よびNADHに. アクテ ィベー シ ョンタ ギン グお よび酵 素学 的性質 の解炉の結果 か ら、AtNUDX2、At㎜X7な /NゆHpyrophosphataseは. 分 子 特 性 の解 析 を 試 み た 。 ま. リ コ ン ビナ ン トタ ン パ ク 質 を 作 製 し、 種 々 の ヌ ク レオ シ ド2一リ ン酸 類 縁 体 に 対 す. る 基 質 特 異 性 を 検 討 し た 。 そ の 結 果 、AtNUDXIは (8-oxo-dGTPase活. 曲. ミ トコ ン ド リア. どの 酬Lリ ボー ス. 酸化 ス トレス耐性 と深 く関連 してい る と考 え られ た。 そ こでまず、 それ らの種 々 のス. トレスに対 す る発 現応 答性 を リアル タイムPCRに よ り解析 した。 その結 果 、At㎜X6で の 変動が認 め られな かった 。一 方、AtNUDX2お よび10はPQ処. はス トレス下 での発現 量. 理、塩 、 乾燥ス トレス、AtNUDX7はPQ処. 理 、塩 、. 対 す る加 水 分 解 活 性. 乾燥、強 光ス トレス に よ り顕著 に誘導 され た。次 に、At測DX7を 過剰 発現 させ た形質転 換株 は、At醐DX2過 剰 発. 同 様 に 、 ヌ ク レ オ チ ドプ ー ル の. 現 株 と同様 にPQ耐 性能が 向上 してい た。一 方、AtNUDX7破 壊株 はPQ処 理 に対 す る感 受性が増加 して いた.以 上. よ びAtNUDX25は. それぞれ 、補酵 素 で ある. を加 水 分 解 し た 。 一 方 、pQ耐1生 の 原 因 遺 伝 子 と して 同 定 したAtNUDX2は. 対 す る 加 水 分 解 活 性 を示 した 。 さ ら に 同 様 の 活 性 は 、At㎜X6,7,10に. 、. お い て も認. め られ た 。. よ り、Nudixhydrolaseに. よるADFリ. ボー スお よびN趙H代 謝 は酸化 ス トレス応 答/耐性 と深 く関与 してい るこ と. が示唆 され た。 ⑳P一リボー スは 、タ ンパ ク質 の翻訳 後調節機 構で あるポ リAI)P一 リボ シル化(PAR)反. 応の分解 過程 、も しくは. サイ ク リックADP一 リボ ースや β一NAD壷 か ら生成 され る。 これ まで に 、P鰍 は種 々のス トレス によるDNA傷 害 の修 復や 細胞 死の誘 導 をは じめ と した多 くの細胞 内代 謝の制御 に機能 してい る と考え られ ている.し か し、過剰 な PARの 活性化 は β一NAD÷ お よびATPの. シ ロイ ヌ ナ ズ ナ 細 胞 質 型Nudixhydrolaseの. 中 で 唯 一AtNUDXIは8-oxo-dGTPase活. 性 を示. し た 。 生物 に とって、その 遺伝情 報 を担 うゲ ノムDNAを 正確 に子 孫 に伝 え維 持す るこ とは最 も基本 的 な生 物 学 的機能 であ るが、ゲノムDNAや そ の前駆 体で あるヌ ク レオ チ ドは 常にAOSに よって酸化 され る危険 に曝 され て い る 、ヌ クレオチ ドプール は酸化 ス トレス下で のAOSの 主要 な標 的 因子 であ り、ヌ ク レオチ ドはAOSに よ り酸 化 さ れ ると突然 変異の原 因 となる8-oxo-dGTPや2-OH-dATPな る8一 オ キ ソ グ ア ニ ン(8-oxo-G)は. どの酸化 体 とな る。特 に、 グ ア ニ ン の 酸 化 体 で あ. 、 ゲ ノ ム 中 で の 発 生 頻 度 が 高 い こ と か ら 、 自然 突 然 変 異. の 主 要 な 原 因 で あ る と考 え ら れ て い る 。 それ に対 して、大 腸 菌MutTや ヒhmllは. 、細胞質 も しくは ミ. トコン ドリアにお いてヌ ク レオチ ドプ ール 中の酸化 ヌ クレオチ ドの浄 化に機 能 して いる。さらに最 近 で は 、活 性 酸 素 に よ っ て 引 き 起 こ さ れ る 細 胞 死 が8-oxoGの MTH1に. 蓄 積 に よっ て引 き起 こされ る こ と. また. よ り こ の 細 胞 死 が 抑 制 さ れ る こ と も 明 らか に な っ て い る 。 しか し な が ら 、 植 物 に お け. る こ の よ うな 酸 化 的DNA損. 傷 の 修 復 機 構 に っ い て は ほ とん ど 明 ら か に な っ て い な い 。そ こ で 、. 自然 発 生 突 然 変 異 頻 度 が 上 昇 した 大 腸 菌. 佃〃∬ 欠 損 株 に 細 胞 質 お よ び オル ガネ ラ局在 型AtNUDX. を 導 入 す る こ と に よ る 相 補 試 験 を 行 っ た 。そ の 結 果 、基 質 特 異 性 を 反 映 し て 唯 一AtNUDXIの が 鮒 ∬ 欠 損 に よ る 突 然 変 異 を 完 全 に 抑 制 し た 。'ま DNA中. た 、AtNUDX1が. シ ロイ ヌナ ズ ナ. み. ゲノム. の 酸 化 ヌ ク レ オ チ ドの 蓄 積 に 及 ぼ す 影 響 を 検 討 した 結 果 、AtNUDXI破 壊 株にお け るゲ ノム 中. これ らの こ とか ら、シロイヌ ナズナ におい てAtNUDX1は 、細胞質 の ヌ クレオチ ドプー ル か ら酸化 ヌク レオチ ド 傷 の修 復 に機能 してい るこ とが 明 らかに なった。. して働 くと ともに、AOS代 謝 機構 にお いて も主 要な電子 枇 拝依 と して機 能す る。 したが って、細 胞内N旭H:NAD` の レ ドックス比 は同化/異 化 のバ ラ ンスお よび レ ドックス状 態の制御 に重要 な役割 を果た してい る。 そ こで、シ ロイ ヌナ ズナ にお い てPARに 関与す るpoly(ADP寸ibose)polemerase(PARPI、2、putativePARP)、 poly(ADP寸ibose)glycohydrolase(TEJ、putativePARG)の PCRに よ り解 析 した。その 結果 、PARPお よびPARGはPQ処. 種々 のス トレス に対す る発現応 答性 を リアル タイム 理、塩、乾燥 、お よび強 光ス トレスに対 して応答性 を. 示 した。 この こ とか ら、植 物にお いてP姐 が酸化 ス トレス応 答/耐 性に深 く関 与 してい ることが示唆 された。 そ こで、At剛D)①お よび7過 剰 発現株 、AtNUDX7破 壊株にお ける酸化 ス トレス下で のPAR活 性 お よび 代謝産 物 (旭P一リボー ス、NAび、NADH、ATP)量 を測 定 した。 その結 果、PQ処 理 下 でのP駅 活性 の上昇に よるADP一リボー スの 蓄積は、At㎜X2過. 乗1溌現株 では野 生株 と比 較 して顕著 に抑制 され 、NAD← お よびATPの 減 少が抑制 され てい. た。一 方、At剛DX7過 剰発 現お よび破壊 株 にお いては 、野生株 と比較 してADP一 リボー ス量 に顕 著な差 は見 られ な. の8-oxo℃ 量は通 常条件 下にお いて も野生株 よ り多 く、PQ処 理 に よる酸化 ス トレスに よ り顕著 に増加 した。. を 除去す るこ とで、酸化 的[M損. 枯渇 の原 因 とな り、細胞 死を 引き起 こす。 さらに、遊離 のADP一 リボー スは. 非 常に反応性 が高 く、タ ンパ ク質 の非特 異的 なモ ノ佃Fリ ボ シル化 を引 き起 こす た め、細胞傷 害の原 因 とな る。 一 方、高 エネル ギー含 有生 体分子 の一っ であ るNADHは 、エ ネル ギー 生産 に関 わ る様 々な種類 の酵素 の補 酵 素 と. か ったが、正 常条件 下で のN佃H量. はそれぞれ 著 しく減少 お よび増加 してい た.さ らに興味深 い ことに、両株 に. お いて 、正 常条件 下で のPAR活 性 の 上昇お よび低下 が認 め られた。 以上 よ り、AtNUD)@お よび7はfηyfε1℃ にお いて同様の基質 特異性 を示 す に も関 わ らず、 ゴηγルoで は異 な る 役 割を 果た して い るこ とが 明 らか にな った。すな わち、At㎜X2は 酸化 ス トレスに よるPARの 居 性化 に よ り生 じ た遊離 の 就P一リボー スを分 解 し、同物質 の非特異 的反応の抑制 およびMの ← やATPを 供給す る ことで、一方AtNUDX7 はNADH(NADH/M)←. 比)の 代 謝を介 してPARを 活性化 する ことで、それ ぞれ 酸化 ス トレス耐性 に寄与 してい ると. こ とが 示唆 され た。.
(3) 論. 文. 審. 査. 結. 果. の. 要. 旨. 植 物は 、光や 温度、 乾燥、 栄養条件 な ど外 界 の様 々な環 境変 化(環 境ス トレス)に よる影 響 を受 けやす い状 況に ある。 この よ うな環境 ス トレスに よる生育 ・生 存 に対す る悪 影響 か ら身 を守るた め、植物 は多様 な応答/耐 性 機構 を巧み に発揮 して い ることが明 らかに な りつ つ あ る。しか し、これ まで に行 われ てきた遺 伝子 同定 法 では 、 ス トレス暴露 下で誘 導 され る遺伝 子のみ がター ゲ ッ トとな るた め、恒 常的に発 現 して い る、も しくは低 発現 レベ. 頻 度 が 上 昇 した 大 腸 菌 脚 ε7欠 損 株 に 細 胞 質 お よ び オルガ ネ ラ局在 型AtNUDXを 導入 す る とに よ る 相 補 試 験 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、 基 質 特 異 性 を 反 映 して 唯 一AtNUDX1の み が 網`r欠 損 に よ る 突 然 変 異 を 完 全 に 抑 制 し た 。 ま た 、AtNUDXIが シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ ゲ ノ ムDNA中 の 酸 化 ヌ ク レオ チ ドの 蓄 積 に 及 ぼ す 影 響 を 検 討 した 結 果 、AtNUDX1破 壊 株 にお け るゲ ノム中の8-oxo-G量 は通常 条件 下 にお いて も野 生株 よ り多 く、m処. 理 に よる酸化 ス トレス によ り顕 著に増 加 した。 これ らの こ とか ら、シ ロイヌ. ルの ス トレス耐 性関連 タンパ ク質 の 同定は非 常に 困難 であ った 。すな わち、これま でに同定 され てい るス トレス. ナ ズナにお いてAtNUDX1は 、細胞 質 のヌ ク レオチ ドプール か ら酸 化ヌ ク レオチ ドを除去す る ことで、酸化的DNA. 応答/耐 性 関連因 子は 、ス トレスに よって誘導 され る、 も しくは定常 状態で さえ高発 現 してい るもの がほ とん ど. 損傷 の修復 に機能 して いる ことが明 らか にな った。. で あった。 そ こで本研 究で は、 まず 非誘導型 また は低発 現 レベル の遺 伝子 も単離 可能な アクテ ィベ∼ シ ョンタ ギン グ法 を用 いて 、新規 の酸化 的ス トレス耐性 関連遺伝 子 の 同定が 試み られ た。 さらに、 同定 したNudix(!坦cleoside 坐phosphatelinkedtosomemoiety⑩hydrolaseの. 盤. 分 子 特性が 網羅 的に解析 され た。. ア クテ ィベー シ ョンタギ ングお よび酵 素学的性 質の解析 の結 果か ら、AtNUDX2、AtNUDX7な. どの 佃P一リボー ス. /N趙1老pyrophosphataseは 酸化 ス トレス耐性 と深 く関連 して いる と考 え られ た,そ こで まず、 それ らの種 々 のス トレスに対す る発 現応答性 を リアル タイ ムPCRに よ り解 析 した。その 結果 、At剛DX6で はス トレス下 での発現 量 作製 し た シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ ア ク テ ィベ ー シ ョ ン タ グ ラ イ ン を 用 い て 酸 化 ス トレ ス の 指 標 と して 葉 緑 体 内 で の 光 依 存 的 なAOS発. 生 剤 で あ るパ ラ コー ト(PQ,3画)に. (10,000ラ. イ ン)か ら2株. のT{刑A近. 傍 に は 、Nudixhydrolaseフ. cDNAを. よ り ス ク リー ニ ン グ を 行 っ た 。 そ の 結 果 、200プ. の パ ラ コー ト而姓 株(ρqr・216236)を. が 存 在 した 。さ らに 、潅Mの κ2. ロ モ ー タ ー 制 御 下 で過 剰 発 現 さ せ た 形 質 転 換 体 は 、PQ処. 理 下 で 導 入 遺 伝 子 の 発 現 量 を 反 映 して 高 い 生 存 率 を 示 した 。 以 上 よ り 、 ρ`7芦216のPQ耐 の 過 剰 発 現 に よ る も の で あ る こ と が 明 ら か に な っ た 。AtNUDX2は8℃xo-dGTP、ADP一. 性 はそれ ぞれ 漉 ㎜. リボ ー ス 、N!のH、CoA、FAD. ァ ミ リ ー の 一 つ で あ る。 現 在 ま で に 、 植 物 に お け るNudixhydrolaseに. な い の が 現 状 で あ っ た 。 そ こで 、 シ ロイ ヌ ナ ズ ナNudixhydrolaseフ. 理 、塩 、乾燥 ス トレス、At剛DX7はPQ処. 理 、塩 、. 現株 と同様 にPQ耐 性能 が向上 していた。 一方 、AtNUDX7弘 蒸 株 はPQ処 理に対 す る感受性 が増加 してい た。佃P一 リポー スは、 タンパ ク質 の翻訳 後調 節機 構で あるポ リ旭P一リボシル化(PAR)反 応 の分 解過程 、 もし くはサ イ ク リックADP一リボー スや β一M)争か ら生成 され るが 、その蓄積 は細 胞傷 害の原 因 とな る。 一 方、高エ ネル ギー含有. 甥. な ど の 細 胞 毒 性 物 質 や レ ドッ ク ス 制 御 物 質 が 含 ま れ る ヌ ク レオ シ ド2一リ ン 酸 類 縁 体 を 加 水 分 解 す るNudix hydrolaseフ. の変 動が認 め られ なか った。 一方 、AtNUDX2お よび10はm処. 乾燥 、強 光ス トレス によ り顕 著に誘 導 された。 次に 、AtNUDX7を 過剰発 現 させた形質 転換株 は、AtNUDX2過 剰 発. 単 離 した 。こ れ ら 変 異 体 の 解 析 の 結 果 、ρqr-216. ァ ミ リー の 一 つ で あ る 漉 〃ω 彪(瀧5847650》. カ リフ ラ ワー モ ザ イ ク ウイ ル ス(CaMV>35Sプ. ール. っ い て は 全 く研 究 され て い. ァ ミ リー に 注 目 し、 そ れ ら の 分 子 特 性 お よ. び 生理 機 能 に つ い て 解 析 が 行 われ た 。. 生 体分子 の一つ であ るNADHは 、 エネル ギー 生産に関 わ る様 々な種 類の酵 素の補 酵素 と して働 くとと もに 、AOS 代 謝機構 にお いて も主要な電 子供 与体 として機 能す る。 したが って、細 胞内NADHlNAD"の. レ ドック ス比は 同化/. 異化 のバ ラ ンスお よび レ ドック ス状 態 の制御 に重要 な役割 を果た して いる。 そこで 、シ ロイ ヌナ ズナ にお いて PARに 関与す るpoly(ADP-ribose)polemerase(PARPI、2、putativePARP)、poly(ADP-ribose)glycohydrolase (TEJ、putativePARG)の PAI㌍お よびPARGはPQ処. 種 々の ス トレスに対 す る発 現応答性 を リアル タイ ムPCRに よ り解析 した。 その結 果、 理 、塩 、乾燥 、 お よび強 光ス トレスに対 して応答性 を示 した。 この ことか ら、植 物 に. お い てP照 が 酸化 ス トレス応 答/耐 性 に深 く関与 してい るこ とが示 唆 され た。 そ こで 、AtNUDX2お よ び7過 剰発 現 株 、AtNUDX7破 壊 株 にお け る酸化 ス トレス 下でのP駅 活性お よび 代謝産物(!のP一リボー ス、NAD"、NADH、ATP) デ ー タベ ー ス解 析 の 結 果 、 シ ロイ ヌ ナ ズ ナ ゲ ノ ム に はAtNUDX2を. 含 む27種. 類 のNudxihydrolase(AtNUDX1-. 27)遺 伝 子 が 存 在 した 。 ま た 、 そ れ ら は 推 定 ア ミ ノ酸 配 列 か ら細 胞 質(AtNUDX1-11,25)、 (At㎜Xl2-18)、 11,25の. 葉 緑 体(At㎜X19-24,26,27)に. 局 在 す る と推 測 され た 。 そ こ で 細 胞 質 局 在 型 のAtNUDXI-. 破 壊株 におい ては、野 生株 と比 較 して 憩P一リボー ス量 に顕 著 な差 は見 られな か ったが、正常条 件下 でのN曲H量 は それ ぞれ著 しく減少 お よび増加 して いた。 さらに興味深 い こ とに 、両株 にお いて 、正常条件 下で のP献 活性 の. リ コ ン ビ ナ ン トタ ン パ ク 質 を 作 製 し、. 種 々 の ヌ ク レ オ シ ド2一 リン 酸 類 縁 体 に 対 す る基 質 特 異 性 を 検 討 した 。 そ の 結 果 、At㎜Xlは 対 す る加 水 分 解 活 性 を示 した こ と か ら 、 大 腸 菌MutTお. よ び ヒ ト阻Hlと. プ ー ル の 酸 化 損 傷 の 修 復 に機 能 し て い る こ とが 示 唆 さ れ た 。 ま た 、At㎜Xllお 素 で あ るCoAお. よび シ グナ ル 分 子 で あ るAPIIAを. AtNUI))① は 、!9P一 リ ボ ー ス お よ びN旭Hに. 剰 発現株 で. は野生株 と比 較 して顕 著に抑 制 され、NAD占お よびATPの 減少 が抑制 され てい た。 一方 、AtNUDX7過 剰発 現お よび. 分 子 特 性 の 解 析 が 試 み られ た 。 ま ず 、 大 腸 菌 を 用 ・・ てAt㎜Xの. 8-oxo-(d)GTPに. 量を測 定 した。 その結 果、PQ処 理 下でのPAR活 性 の上昇 に よるADP一 リボース の蓄積 は、At㎜X2過. ミ ト コ ン ド リア. 加 水 分 解 し た 。 一 方 、PQ耐. 変 異原 とな る. 上 昇お よび低 下が認 め られ た。以 上 よ り、At醐)X2お よび7はfη. 同 様 に 、 ヌ ク レオ チ ド. よ びAt㎜X25は. それ ぞれ 、補 酵. 性 の 原 因 遺 伝 子 と して 同 定 し た. 対 す る 加 水 分 解 活 性 を 示 し た 。 さ ら に 同 様 の 活 性 は 、AtNUDX6,7,10. 噴roに おい て同様の 基質特異 性 を示す に も. 関 わ らず、fη γ1γoで は 異な る役 割 を果 た して いる ことが明 らか にな った。 す なわち、AtNUDX2は 酸化 ス トレス に よるP献 の活 性化 に より生 じた 遊離 の 旭P一リボース を分解 し、同物質 の非特 異的反 応の抑 制お よびMの ← やATP を供給す るこ とで、一方AtNUDX7はNADH(N的H/N旭. ← 比♪の代 謝 を介 してPARを 活 性化す る ことで 、それ ぞれ 酸. 化 ス トレス耐性 に寄 与 して い ると ことが示唆 された。. に お い て も認 め られ た 。. 以上 本論文 は、シ ロイ ヌナ ズナNudixhydrolaseの 分子特 性、At剛DX1の 酸化 的DNA損 傷の修 復機 構 への関 与、 ADP-r山ose/NADHピ ロホス フ ァターゼ の酸化 的ス トレス耐性 に及 ぼす影 響お よびそれ らの生理 機能 に っいて 詳細 シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ 細 胞 質 型Nudixhydrolaseの. 中 で 唯 一AtNUDX1は8-oxo-dGTPase活. 性 を示. した 。 ヌ ク レオチ ドプール は酸化 ス トレス下 でのAOSの 主 要 な標 的 因子で あ り、 ヌク レオ チ ドはAOSに. よ り酸. 化 され る と突然 変異 の原因 とな る8-oxo-dGTPや2-OH-dATPな どの酸化 体 となる。特 に、 グ ア ニ ン の 酸 化 体 で あ る8一 オ キ ソ グ ア ニ ン(8-oxo-G)は 、 ゲ ノ ム 中 で の 発 生 頻 度 が 高 い こ とか ら 、 自 然 突 然 変 異 の主 要 な原 因 で あ ると考 え られ て い る。 しか しなが ら、 植物 に お ける この よ うな酸 化 的 DM損 傷 の 修復 機 構 につ い ては ほ とん ど明 らか に な って い ない。 そ で 、 自然 発 生 突 然 変 異. に検討 され てい る。 これ らの成果 は 、Nudixhydrolaseに よるヌ ク レオシ ドニ リン酸類 縁体 の代謝 機構 が酸化 的 ス トレス耐 性に深 く関与 してい る ことを初 めて 明 らか に した。 よって、本 論文 は博士(農 学)の 学位 論文 として価 直ある もの と認め る。 なお 、審査 に あた って は、論 文に 関す る専攻 内審査 お よび公 聴会 な どの所定 の手続 き を経 た うえ、平成19年2月9日. 、農学 研究科 教 授会 におい. て 、論文 の価 値 な らび に博 士 の学拉 を授与 され る学力が 十分 であ ると認 められ た。. 一39一.
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