オオカナダモの葉の葉緑体運動の実験教材化

オオカナダモの葉の葉緑体運動の実験教材化

陣 野 信 孝

長崎大学教育学部 生物学教室 (平成15年3月14日受理)

Exper i ment alt eachi ngmat er i al sonchl or opl as tmovement i nl eavesof Ege r i ade nda

Nobut aka

JINNO

Bi o l o gi c a lLa bor a t or y,Fa c ul t yo fEduc a t i on,Na ga s a kiUni ve r s i t y Bunkyo 一 ma c hi ,Na ga s a ki

,852‑8521

J a pa n( Re c e i vedMa r .

14,2003)

Abs t r a c t

Na t ur a l i z ed

Egeriadensa

i ss ubme r gedpl a n

t

.A s i ti spo pul a r ,o bt a ina bl e,c ul t i va bl e a nda va i l a bl ei na l ls ea s ons , i ti sagoods a mpl ef ors c i e nc ee xpe r i me nt s .

Cl us t e r i nga nddi s pe r s a lo fc hl or opl a s ti n

E.densa

ha vebee nkno wn.Thepr es e nt wor kwa spl a nne df ort e a c hi ngma t e r i a l sonc hl or opl a s tmo ve me nti n

E.densa

f r om e ner gyme t a bol i cvi e wpoi nt s .The n,l ea veswe r ei nc uba t edi nc ol dwa t e ra t

2‑4℃

a nd i n s ol ut i onso fme t a bol i ci nhi bi t or st o c onf i r m t hei nvol vementofener gy me t a bo l i s m.

Me t a bol i ci nhi bi t or s ,DNP a ndNEM wer ea ppl i ed.AsDNPi sdes i gna t eda sa da nge r ousc he mi c a l , i tne e dst obedonewi t ha t t e nt i on.Unde rt hedi r e c t i ono ft e a c he r

,

t hes ec a nbeus eda ts c hools c i e nc ee xpe r i me nt s .

Lo wt e mpe r a t ur ea ndt heme t a bol i ci nhi bi t or si nhi bi tbot hc l us t e r i nga nddi s pe r s a l o fc hl or o pl a s t s .

Fr o m t hes eda t a,t hei nvo l v e me nto fe ne r gyme t a bo l i s m wa ss ugges t e donbo t h c l us t e r i nga nddi s pe r s a lofc hl or opl a s t s .

Thus ,e xpe r i me nt si n

E.densa

ma ybea va i l a bl ea st ea c hi ngma t er i a l sf ort he e ne r gyme t a bol i s mi nbi ol o gi c a ls c i e nc ee xpe r i me nt s .

Ke y wor ds:

Egeria densa

,c hl or opl a s tmo ve ment ,t ea c hi ng ma t er i a l s ,me t a bol i c i nhi bi t or s .

Abbr e vi a t i ons :DNP ,di ni t r ophe no l;NEM,N‑ e t hyl ma l e i mi de.

は じめに

光合成 を営む植物細胞 の中には葉緑体がある｡葉緑体 は細胞 にふ りそそ いでいる光 の方 向､強 さ､色な どを自ら感知 して動いている｡細胞の形や一つの細胞 に含 まれる葉緑体数､

葉緑体 の形な どによ りさまざまな タイ プの運動が知 られて いる (高木 ･西井､1999)0 ウキクサ､フシナシミ ドロ､ ヒザオ リでは弱光下で葉緑体 は光 の入射方向に対 して直角 に 定位 し､強光下では並行に定位することが知 られている (HauptandScheuerlein,1990)0

また､沈水の水草であるオオカナダモ､コカナダモ､クロモでは､葉の葉緑体 は暗所 〜 弱光下で細胞全体 に一様 に分散 し､強光下では細胞 の一ヶ所 に団子状あるいは紐状 に集合 す る ことが知 られている (Witztum andParthasarathy,1985)0

この葉緑体 の運動 には､弱光下での光合成の効果 を上げた り､強光 による光障害を避 け るという生理学的な意義があるとされている (高木 ･西井､1999)0

このような ｢光環境への応答｣は植物が生きてい く上で重要な生理的な適応反応 といえ る｡ ところで､高校の生物 の教科書 1Bでは､｢植物の調節｣ という単元で ｢屈光性の しく み｣ と ｢光周性｣という教材があるが､ これ らの教材は実験結果が得 られるまでに時間が 長 くかかることな どか ら実験教材化 は十分 とはいえない｡

そ こで､オオカナダモを用 いて ｢光環境への応答｣の実験教材化 を試みた｡本研究では 葉緑体 の光環境への応答 (集合 と分散) をエネルギー代謝の視点で捉 える ことにした｡

オオカナダモは､身近 に自生 していて入手 しやす い､栽培が容易である､常緑であるた め四季 を通 じて使用が可能である､顕微鏡があれば実験ができる､顕微鏡観察のためのプ レパ ラー ト作製は生徒で も簡単 にできる､他 に大 した実験器具は必要でない等､多 くの利 点がある｡

1 .材料 と方法

1.材 料 (1) 植物

汲 み上 げた地 下水 を用 水 と して い る学 内 の池 に生育 して い るオ オカ ナ ダモ

( Ege r i a d e n s a)

を用 いた｡汲み上 げた地下水が水深約20cmで常時流下 しているところに生育 し ているものを使用 した｡止水の池 に生育す るものに比べていろいろな付着物が少な く実験 材料 としては使 いやす い｡

(2) 代謝阻害剤

2,4‑ジニ トロフェノール (DNP､酸化的 リン酸化 の脱共役剤 の一つ) とN‑エチル マ レイ ミ ド (NEM,SH基試薬 の一つ) を用 いた｡DNPは危険物 に指定 されて いるが､

取 り扱 いに細心の注意 をは らえば学校 の理科実験で も使用が可能ではないだろうか｡以下 の濃度で用 いた｡

①1mMDNP(pH6.53);10mMDNPを蒸留水で10倍 に希釈 して用 いた｡10mMDNPは 0.2Mの水酸化ナ トリウム液 にDNPを入れ加熱 して溶か した後､希塩酸で中性 にした｡

②1mMNEM(pH6.45);10mMNEMを蒸留水で10倍 に希釈 して用 いた｡

2.方 法

1.サ ンプルの前処理

葉緑体 の集合の実験 には､実験前 日にサ ンプル を茎 ごと水の入 った ビーカーに入れで 恒 温器 内 (30℃)内で一晩処理 (暗処理) して用 いた｡冬 の時期 を除いて暗処理 は黒 い布 を掛 けた り､蓋のついた箱の中に入れて もよい｡

葉緑体 の分散実験 には実験 当 日の朝サ ンプル を採取 し､葉 を蒸留水 の入 った擦 り合わせ のガ ラス蓋付 きの ピン (秤量 ビン､3×3cm/cm)に入れた｡ この段階の処理では秤量 ビンの代わ りにビーカー を使用 して もよい｡ これを水の入 った大きめのシャー レに入れて､

つまりウオーターバスにして白熱電球 (レフランプ)(150W,Toshiba)を用い照度30klux､

温度30℃下で約4時間処理 (明処理) した｡光源か らの距離 は約10cmではその熱線で 温度が上昇 してその影響がでて くる｡そ こで大 きめのシャー レを水槽 にセ ッ トして､ハ ン ディークーラー (BD‑12,Yamato)とハ ンディークー ラー用温度調節器 (BF‑21,Yamato) を用 いて シャー レの液温が30℃ になるよ うに温度調節 を行 った｡

白熱電球 の光源か らの距離 を約30セ ンチ に保つ と照度 は約10kluxで温度 の影響 は無 視で きる｡ また､ 白色 あるいは昼 白色蛍光 ランプで処理す る ときは､20Wの蛍光管が2 個取 り付 け られ る器具 を購入 して使用す る とよい｡光源か らの距離 は約10cmに保つ と 照度は10kluxで特 に温度調節は必要でない｡

天侯がよいときはサ ンプル を蒸留水の入 った ビーカー に入れ直射 日光 の下で処理 して も よい｡

この暗処理 によって葉緑体 は細胞内で一様 に分散 し､明処理 によって細胞 内の一ヶ所 に 又は隣の細胞 とクロスす るように紐状 に集 まった｡ こうして前処理 した葉 を以下の実験 に 用 いた｡

2.照射下での葉緑体集合の定量化

この実験 の定量化 は難 しいが シャッタース ピー ドがデジタルで表示 され る顕微鏡撮影装 置があれば可能である｡本実験ではシャッタース ピー ドが百分の1秒 まで表示 される顕微 鏡撮影装置 (H‑Ⅲ ,Nikon)を用 い､同一細胞 内で葉緑体 の集合 の定量化 を試みた｡細 胞 内に一様 に分散 していた葉緑体が集合す ると細胞 を透過す る光 の量が増えて細胞が明る くなって くる｡ この明るさの測定値 を葉緑体の集合の度合 いとして応用す ることができる｡

時間の経過 と共 に葉緑体が集合 L細胞が明るくなってシャッタース ピー ドが短 くなって く るが､右上が りのグラフで読めるよ うにその逆数 を取 った｡その値 を細胞 の明るさ (葉緑 体 の集合の度合) としグラフの縦軸 にとり時間を横軸 にとった｡

総合倍率100倍で一定時間 ごとにプ レパ ラー トを作製 して同一サ ンプル､同 じ面､ほ ぼ同 じ場所のシャッタース ピー ドを測定 して､その経時的変化 をみた｡

また､24

×36

(帆/mm)のカバーガ ラスを用 いて作製 した一時プ レパ ラー トを顕微鏡 に セ ッ トし､その光源 (ハ ロゲ ンランプ 12V‑50W)9.5Vで連続照射 した｡総合倍率400 倍で同一細胞 を30分 ごとに2時間､顕微鏡写真 を撮 った｡葉緑体 の集合が観察できる｡

3.葉緑体 の集合 と分散 に及ぼす低温の影響

葉緑体 の集合実験 には､暗処理 した葉 を蒸留水の入 った秤量 ピンに入れて､ これ を氷の

入 ったシャー レに入れ レフランプで照射 した｡氷 を時々補給 して液温 を 2‑4℃ に保 った｡

葉緑体 の分散実験は､明処理 した葉 を容器 に入れて冷蔵庫内 (約4℃ )で行 った｡

一定時間後 にカ ラープ リン ト用 フイルムで顕微鏡写真 を撮 った｡

4.葉緑体 の集合 と分散 に及ぼす代謝阻害剤の影響

代謝阻害剤 として､1mM DNPと 1mM NEM を用 いた｡対照実験 として､蒸留水 を用 いた｡

葉緑体 の集合の実験 には､暗処理 した葉 を上記の液 に入れて､明処理 を行 い一定時間後 に顕微鏡写真 を撮 った｡

葉緑体 の分散の実験 には､明処理 した葉 を上記の液 に入れて､暗処理 を行 い一定時間後 に顕微鏡写真 を撮 った｡

2.

結 果

1.照射下での葉緑体の集合

暗処理 した葉のプレパ ラー トを作 り､同一サ ンプル､同 じ面､ほぼ同一場所 を総合倍率

1 00

倍でシャッタース ピー ドを測定 した｡その結果､時間の経過 とともに葉緑体が集合 し 視野のシャッタース ピー ドは短 くな り明るくなった (図

1,2)

O

Fig･1Photographsshowingthpdispersal(A)indarknessandclustering(B)in brightlightofchloroplasts.Thescalebarsindicate0.1mm.

208642ll

(oasJt)ssaultJg!Jg

0

30 60 90 120 Time(min)

Fig.2Thechangeinbrightnesswithpassageoftimeunderthelightat10klux.

同一細胞 を総合倍率400倍でそ の表面 にピン トを合わせ､一定時間 ごとに顕微鏡写真 を撮 った｡オオカナダモの葉は表 ･裏 の二つの細胞層か らなってお り､表 ･裏 いずれの細 胞 で も暗処理後 では葉緑体 は葉 の表面 (表皮側) に移動 して一様 に分散 した (図3‑A)0 葉緑体 の周 りには しば しば細 く伸びた糸状の原形質が観察 された｡明処理下､時間の経過 と共 に葉緑体 は原形質流動 をしなが ら移動す るのが観察 された｡2時間後 には葉緑体 は細 胞 内の‑箇所 に密に集 まって団子状 を､あるいは隣 り合 った二つの細胞 にまたが り紐状 を 呈 した (図

3‑B〜D)

｡ これは暗処理下で細胞 の表面 に分散 していた葉緑体が明処理下で は細胞 の中の方 に移動 し核 を中心 に集合 した ともの と思われ る｡

Fig.3 Photographs showing the clustering ofchloroplastsin the light. Dispersing chloroplastsunderdarkness(A)clustered with passageof time;after30min(B),1h(C)and2h(D).Thescalebarsindicatelo〟m.

2.葉緑体の集合 と分散 に及ぼす低温の影響

低温 (2‑ 4℃)下では､葉緑体 の集合 と分散 は抑制 された｡つ ま り､分散 した葉緑体 は明所下 2時間後で も集合せず (図 4‑A)､集合 した ものは暗所下 2時間後､で も分散 し なかった (図 4‑B)0

Fig.4 Photographsshowing inhibition ofdispersaland clustering atlow temperature.Clustered thloroplastsdid notdispersed at4℃ under darkness(A)anddispersedchloroplastsdidnotclusteredat2‑4℃ under lightof10klux(B).Thescalebarsindicate0.1mm.

3.線体の集合 と分散 に及 ぼす代謝阻害剤の影響

DNPおよびNEMで処理す ると､葉緑体 の集合 と分散 は共 に抑制 された｡つ ま り､分 散 した葉緑体 は明所下で も集合せず (図5‑A

,B)

､集合 した ものは暗所下

2

時間後で も分 散 しなかった (図 5‑C,D)0

Fig.5Photographsshowingeffectsofinhibitorsonthechloroplastmovement. DNPinhibitedthedispersalofclusteredchloroplastsunderdarkness(A) andtheclusteringofchloroplastsunderbrightlight(B).NEM didalsothe sameeffect(C,D).Photographafter2htreatmentwereshown.Thescale barsindicate0.1mm.

3. 考 察

低温処理で､葉緑体の運動 (集合 と分散)が抑制 された ことか ら､葉緑体 の運動 にはエ ネルギー代謝が関与 していることが示唆 された｡ この ことは､低温下では物質代謝が低下

しATPの生成が低下 したため と考 え られる｡

DNPは酸化的 リン酸化 の脱共役剤の一つで､ATP生成の準備段階である高エネルギー 状態 を解消す る｡つ ま り､DNPで処理す るとATPの生成が抑制 され る｡ このDNPの処 理で葉緑体 の集合 ･分散が抑 え られたのは､運動 のエネルギー源で あるATPの生成が抑 え られたため と示唆 される.つ ま り､葉緑体 の運動はエネルギーを使 う過程である ことを 示唆 して いる.ウキ クサ

( Le mma)

の葉緑体 の運動 の主なエネルギー源 は酸化的 リン酸 化 によるATPとされている (Haupt,1982)0

SH基試薬の一つであるPCMBは ヒョウタンゴケ

( Fun ar i a)

の葉緑体 の定位運動 を抑 えることが知 られている (Schdnbohm,1972)Oまた､NEMは緑藻類の一種

( Mo u g e o t i a)

の葉緑体 の運動 を阻害 しミクロフィラメン トであるミオシンのはた らきに影響す るとされ

ている (Wanger,KleinandRossbacher,1978)｡また微小繊維の重合 を阻害するサイ トカ ラシンBはそれ を阻害 し､一方微小管形成 を阻害す るコル ヒチ ンはそれ を阻害 しな い ことか ら､葉緑体 の運動 にはミクロフィラメン トが関与 しているとしている (Haupt andScheurlein,1990)｡オオカナダモ (Witztum andParthasaraty,1985)とセキシ

ョウモ (Dong,NagaiandTakagi,1998)の葉緑体 の集合 と分散がサイ トカラシンで阻 害 されるが､コル ヒチ ンでは阻害 されないことが知 られている｡サイ トカラシン

ー B

とコ ル ヒチ ンの葉緑体の運動に及ぼす影響 については､著者 も同じ結果 を確認 している｡

オオカナダモにはミオシンの存在 も確認 されている (Ohsukaandlnoue,1979)｡非 筋肉性 と細胞性のミオシンはATP‑ア‑ゼ活性 を示 し､アクチンと結合するとその活性は 増大するとことが知 られている (香川ほか,1980)｡ATPアーゼ活性 をもつ ミオシンによ ってATPが分解 され､その遊離エネルギーで葉緑体がアクチ ン繊維の上 を滑って移動す ると考え られる｡つま り､葉緑体の運動は能動的な過程であることが示唆される｡

このように､オオカナダモの葉緑体 の運動には､アクチ ンーミオシンーATP系の関与が 示唆される｡

オオカナダモの葉の葉緑体が明所下で集合 し暗所下で分散する機構は不明であるが､｢光 環境への適応｣の実験教材 として使用できるのではないだろうか｡本学部の学生の ｢生物 学実験｣で このオオカナダモの葉緑体の運動に関する実験 を実施 した ところ､受講生は興 味関心 を示 し ｢光環境への適応｣の実験教材 として有効であることが分かった｡

代謝阻害剤の使用 については問題があるが､低温処理実験だけで も葉緑体の運動が能動 的な過程であること理解 させるのによい実験教材 といえる｡

4.

摘 要

1.帰化植物の一種であるオオカナダモを材料 として用いた｡

2.

これは､身近､栽培が簡単､四季 を通 じて使用可能であるな ど利点 をもっている｡ま た､顕微鏡観察のためのプ レパ ラー ト作製は児童 ･生徒で も簡単 にできる｡

3.葉の葉緑体 は強光下では集合 し､弱光〜暗所下では分散する性質があ り､つま り葉緑 体は ｢光環境への適応｣ して運動する｡

4.この葉緑体の運動をエネルギー代謝の視点で実験教材化 を試みた｡

5.低温 と代謝阻害剤の処理が葉緑体の運動 に及ぼす影響を調べた｡代謝阻害剤 として酸 化的 リン酸化の脱共役剤である

2,4‑

ジニ トロフェノール とSH基試薬であるN‑エ チルマ レイ ミ ドを用いた｡

6.低温 とこれ ら代謝阻害剤処理で､葉緑体の集合 と分散が共 に阻害された｡

7.オオカナダモの葉緑体の運動は､エネルギーを使 う能動的な過程であることが示唆さ れた｡

8.本学部の ｢生物学実験｣で実践 したところ､｢光環境への適応｣ とそれがエネルギーを 使 う能動的な過程であることを理解する教材 として有用であることが分かった｡

9.1‑ 2時間で実験結果が得 られるので､教育現場における植物の ｢光環境への適応｣の 実験教材 として使用 を期待 したい｡

引 用 文 献

Dong,X‑J"Nagai,R.andTakagi,S.(1998)Microfilamentsanchorchloroplastsalongthe outerpericlinalwallinVallisneriaepidermalcellsthrough cooperation ofPFRand photosynthesis.PlantCellPhysiol.39(12):1299‑1306,

Haupt,W.(1982)Ligh卜mediated movementofchloroplasts.Ann.Rev.Plant.Physiol. 33:205‑233.

Haupt,W andScheuerlein,R.(1990)Chloroplastmovement.PlantCellandEnvironment. 13:595‑614.

香川靖雄､今堀数友､丸 山工作､斎藤信彦 :『生命 とエネルギー』 (培風館､1980)152頁 . 高木慎吾､西井一郎 :『植物の環境応答 (植物細胞工学 シリーズ11)』 (秀潤社､1999)18頁 . Ohsuka,K.andInoueA.(1979)IdentificationofmyosininafloweringplantEgeriadensa.

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Sch6nbohm,E.(1969)Die Hemmung derlichtinduzierten Bewegung desMougeotia‑ Chloroplasten durch p‑Chloromercuribenzoat.ZeithschftfiirPflanchenphysiologie 61:250‑260.

Wanger,G.,Klein,K.and Rossbacher,R.(1978)Strukturelle und physiologishe GrundlagenderlichtorientiertenChloroplastenbewegungbeiderGrdnalgeMougeotia spec.CytObiologie18:198.

Witztum,A.andParthasarathy,M.V.(1985)Roleofactioninchloroplastclusteringand bandinginleavesofEgeria,ElodeaandHydrilla.Eur.J.CellBiol.39,21‑26.