XM と併用し高感度な DSA 検出法として FCXM- した cold 生理食塩水でリンパ球を洗浄後 flow IgG を導入した 全米臓器共有ネットワーク United cytometer FACS Calibur Becton, Dickinson and Network for Organ

技術論文

腎臓移植におけるヒトリンパ球を使用した高感度クロ

スマッチ検査の検討

小林　悠梨

石塚　　敏

安尾美年子

三浦ひとみ

岩藤　和宏

中島　一朗

渕之上昌平

臓器移植では，液性拒絶反応の免疫学的評価としてドナー特異的抗 HLA 抗体（donor-specific HLA antibodies; DSA）を 検出することが重要であると考えられている。本研究では，flow cytometry lymphocyte crossmatch-IgG test（FCXM-IgG）検 査法および解析法の統一化に向けた基礎的検討を行った。東京女子医科大学腎臓外科に外来受診された生体腎臓移植希望 患者 78 症例とドナーリンパ球を使用し，FCXM-IgG と LABScreen single-IgG を測定した。FCXM-IgG MESF と LABScreen single-IgG nMFIの比較では，Linear values と Channel values において Tcell・Bcell-IgG 共に相関係数およそ 0.8 と良好であっ た。本研究の結果から，LABScreen single-IgG で検出される natural antibody などの影響も推測されたが，本研究において 良好な相関性が得られたことによりそれぞれの蛍光強度から近似曲線を作成し定量評価できる可能性が期待される。 キーワード 組織適合性抗原，ドナー特異的抗 HLA 抗体，リンパ球細胞傷害性試験，フローサイトメトリークロスマッチ検査，HLA 特異性抗体検査 はじめに 臓器移植では，液性拒絶反応の免疫学的評価とし てドナー特異的抗 HLA 抗体（donor-specific HLA antibodies; DSA）を検出することが重要であると考 えられている。

DSA検出法1)_{には，ヒトリンパ球を使用した細胞}

傷害性試験（lymphocyte cytotoxicity crossmatch; LCT-XM）2),3)_{や flow cytometry lymphocyte crossmatch-IgG}

test（FCXM-IgG）4)_{などがある。} LCT-XMは，補体結合性のある DSA を検出する方 法であるが，FCXM-IgG は補体結合性の有無に関わ らず DSA を検出できる方法である。しかし，この 2 法では自己抗体などの免疫グロブリンも検出される 可能性がある。 近年では，ヒトリンパ球を使用しない精製 HLA 分子を Class I・II に分けて結合させた合成ビーズ法 bead-based assay5)が開発され，FCXM-IgG と同様の

DSAが検出できる検査法として普及してきている。

し か し ， こ の 方 法 で は ， DSA と 同 時 に natural antibody6)～8)も検出される可能性がある。また，ヒト

リンパ球から抽出した HLA 抗原を Class I・II に分け て合成ビーズに結合した cell-based assay と bead-based assayとを組み合わせた immunocomplex capture fluorescence analysis（ICFA）法9)が新たに開発され， この方法も FCXM-IgG と同様の DSA が検出できる 検査法である。しかし，白血球上の HLA 抗原は locus によって発現量が異なるためビーズに対して HLA 抗原が capture されない可能性がある10)。 2014年 4 月より日本臓器移植ネットワークでは， 膵臓・腎臓におけるレシピエント選定基準に LCT-（平成 27 年 2 月 2 日受付・平成 27 年 11 月 25 日受理）

XMと併用し高感度な DSA 検出法として

FCXM-IgGを導入した。全米臓器共有ネットワーク（United

Network for Organ Sharing; UNOS）11)においても従来

法に加え，より高感度な検査法を併用することを推 奨している。 しかし，FCXM-IgG は，国内でも未だ検査法が統 一化されておらず導入している施設も少ないのが現 状である。 そこで今回筆者らは，FCXM-IgG 検査法および解 析法の統一化に向けた基礎的検討を行ったので報告 する。 I_{対象および方法} 対象は，東京女子医科大学腎臓外科に外来受診さ れた生体腎臓移植希望患者のうち，同意を得た 78 名 （慢性腎不全患者，男性 34 名，女性 44 名・平均年齢 49.5 ± 標準偏差 13.1）の患者血清とドナー候補リン パ球および血清を使用した。 方法は，ドナー候補血液から DNA を抽出し， LABType HD（One Lambda, Canoga Park, CA）の HLA-A，B，C，DRB1，DQB1 Locus キットを使用し HLA 対立遺伝子を測定した。また，FCXM-IgG の基礎的 検討には，比較対照として LABScreen Single Antigen IgG Test（LABScreen single-IgG, One Lambda, Canoga Park, CA）を用いた。

1．flow cytometry lymphocyte crossmatch-IgG test

ドナー候補ヘパリン加末梢血液から RosetteSep HLA Human Total Lymphocyte（ StemCell Technol-ogies）や Ficoll 比重遠心法によりリンパ球を分離 した。

ドナー候補血清，市販 AB 型血清（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States），抗 HLA 抗体陽性血清， 患者血清 100 μL にそれぞれドナー候補リンパ球（5.0

× 105個／100 μL）を加え，室温 30 分静置反応した。

cold

生理食塩水でリンパ球を洗浄後，fluorescein-isothiocyanate (FITC)-conjugated anti-human IgG （ Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, Penn, United States），Peridinin chlorophyll protein (Per-CP)-conjugatedanti-CD3 お よ び phycoerythrin (PE)-conjugated anti-CD19（ Becton Dickinson, San Jose, Calif, United States）を加え，4℃遮光 20 分静置反応

した。cold 生理食塩水でリンパ球を洗浄後，flow cytometer FACS Calibur（ Becton, Dickinson and Company）にて測定した。

1）ドナー候補リンパ球の Protease 処理の有無およ

びリンパ球数と血清量の検討

アメリカ組織適合性学会 American Society for Histocompatibility and Immunogeneticsの検査マニュ アル（ASHI Laboratory Manual）12)に準じた Protease，

Type XIV（Sigma Chemical, St. Louis, Mo, United States）未処理リンパ球（5 × 105個／30 μL）と血清 量 30 μL を基準（I）とし，それぞれ血清量 100 μL と Protease 未処理（II）および処理リンパ球（III） （5 × 105個／100 μL）による 3 群について検討を行っ た。 2）FCXM-IgG 解析法の検討

anti-human IgG を Linear (log) values median fluorescence intencity（MFI）および Channel values MFI にて解析を行った。また，可溶性蛍光色素分子等量 Molecules of equivalent soluble fluorochrome（MESF） （Quantum FITC-5 MESF(Premix), Bangs Laboratory,

Fishers, IN）についても解析した13)。

3）最低検出感度の検討

LABScreen-IgG で検出した抗 HLA 抗体 B*07:02 陽 性 血 清 normalized mean fluorescence intencity （nMFI）22070.9 を 16 倍から 1,024 倍まで市販 AB 型 ヒト血清で希釈し，anti human IgG-FITC を Linear valuesおよび Channel values にてそれぞれ n = 20・

mean ± 2.6SD法において重ならないポイントを最低

検出感度とした。

4）FCXM-IgG Cut-off 値の検討

ドナー候補血清および抗 HLA 抗体陰性患者血清 n = 35について，anti-human IgG を Linear values およ び Channel values にて ASHI Laboratory Manual10)に準

じてそれぞれ mean + 3.0SD 法により Cut-off 値を設 定した。

2．LABScreen Single Antigen IgG Test

LABScreen single Class I・Class II Beads にそれぞれ 陰性コントロール血清および患者血清を加え室温 30 分反応させる。3 回洗浄後，anti-human IgG-PE を加 え，遮光室温 30 分反応後，2 回洗浄して LABScan100 （One Lambda, Canoga Park, CA）にて測定した。

1）LABScreen single-IgG と FCXM-IgG の比較検討 患 者 血 清 78 検 体 に つ い て 抗 HLA 抗 体 を LABScreen single-IgGで測定し，それぞれの検体にお ける陽性 DSA nMFI を合計した蛍光強度と

FCXM-IgG MFIおよび FCXM-IgG MESF の比較検討を行っ

た。

II_{結 果}

1．flow cytometry lymphocyte crossmatch-IgG test

1）ドナー候補リンパ球の Protease 処理の有無およ

びリンパ球数と血清量の検討

FCXM Tcell-IgG の抗 HLA 抗体陽性血清では，

（III）の条件において 250.29 MFI であり，（I）の

101.82 MFIよりも反応性が良好であった。また， FCXM Bcell-IgGの市販 AB 型血清では，（II）に比べ （III）の条件において非特異的な反応が抑えられてい た（Figure 1）。 2）FCXM-IgG 解析法の検討 FCXM Tcell・Bcell-IgG 共に MFI が高値領域にお いて anti-human IgG の Channel values よりも Linear

valuesの MFI が高く，約 500 付近で Linear values と

Channel valuesの MFI 値が逆転現象を認めた。また，

Linear valuesと Channel values を MESF 単位に演算 す る こ と に よ り ， デ ー タ が ほ ぼ 一 致 し て い た （Figure 2）。

3）最低検出感度の検討

抗 HLA 抗体 B*07:02 陽性血清を希釈し n = 20・ mean ± 2.6SD法で解析した結果，FCXM Tcell-IgG で は Linear values と Channel values 共に

LABScreen-IgGにおいて 256 倍希釈（840 nMFI）まで抗体検出

が可能であった。また，FCXM Bcell-IgG においても Linear values と Channel values 共に LABScreen-IgG において 256 倍希釈（840 nMFI）まで抗体検出が可 能であった（Table 1）。

4）FCXM-IgG Cut-off 値の検討

ドナー候補血清および抗 HLA 抗体 DSA 陰性患者 血清 n = 35 をそれぞれ mean + 3.0SD 法で解析した結 果，anti-human IgG の Linear values では Tcell・Bcell-IgG共に Sample-NC でおよそ 10 以下，Ratio 比では Sample/NCでおよそ 2.0 以下であった。また，Channel valuesでは，FCXM Tcell・Bcell-IgG 共に Sample-NC

562.34 Median 14.86 16.85 12.86 Median 43.32 54.25 13.95 Median 395.96 523.30 FCXM Tcell-IgG FCXM Bcell-IgG Count Count Count Count 0 0 0 0 100 ₁₀1 ₁₀2 ₁₀3 ₁₀4 100 ₁₀1 ₁₀2 ₁₀3 ₁₀4 ₁₀0 ₁₀1 ₁₀2 ₁₀3 ₁₀4

FL1-H::Anti-Human IgG FITC

100 ₁₀1 ₁₀2 ₁₀3 ₁₀4

FL1-H::Anti-Human IgG FITC

FL1-H::Anti-Human IgG FITC FL1-H::Anti-Human IgG FITC

市販AB型血清 市販AB型血清 抗HLA抗体 陽性血清 抗HLA抗体陽性血清 (Ⅰ) (Ⅱ) (Ⅲ) Median 101.82 177.83 250.29 ドナー候補リンパ球の Protease 処理の有無およびリンパ球数と血清量の検討

（I）：Protease 未処理リンパ球（5 × 105_{個／30 μL）と血清量 30 μL（ASHI Laboratory Manual）}

（II）：Protease 未処理リンパ球（5 × 105_{個／100 μL）と血清量 100 μL}

（III）：Protease 処理リンパ球（5 × 105_{個／100 μL）と血清量 100 μL}

FCXM-IgG最低検出感度の検討  

Linear values FCXM Tcell-IgG

LABScreen-IgG B*07:02 1,484 840 552 n = 20 × 16 × 32 × 64 × 128 × 256 × 512 × 1,024 平均値 41.1 26.4 18.7 14.2 12 10.9 10.1 SD 1.1 0.7 0.6 0.3 0.2 0.3 0.3 CV（%） 2.8 2.7 3.1 2.1 2.0 2.7 2.6 Max. 43 27.4 19.7 14.6 12.5 11.4 10.6 Mini. 37.7 24.8 16.9 13.3 11.3 10.2 9.3 Range 5.3 2.6 2.8 1.3 1.2 1.2 1.3 m + 2.6SD 44 28.3 20.2 14.9 12.6 11.7 10.8 m − 2.6SD 38.1 24.6 17.2 13.4 11.3 10.2 9.4 最低検出感度 Table 1   

Channel values FCXM Tcell-IgG

LABScreen-IgG B*07:02 1,484 840 552 n = 20 × 16 × 32 × 64 × 128 × 256 × 512 × 1,024 平均値 413.1 364.1 325.6 294.7 276 265.9 257.4 SD 3.2 3.0 3.5 2.3 2.3 3.2 2.9 CV（%） 0.8 0.8 1.1 0.8 0.8 1.2 1.1 Max. 418 368 332 298 281 271 262 Mini. 403 357 314 288 270 258 248 Range 15 11 18 10 11 13 14 m + 2.6SD 421.4 372 334.8 300.7 282 274.2 264.9 m − 2.6SD 404.7 356.2 316.4 288.7 270 257.5 249.8 最低検出感度    

Linear values FCXM Bcell-IgG

LABScreen-IgG B*07:02 1,484 840 552 n = 20 × 16 × 32 × 64 × 128 × 256 × 512 × 1,024 平均値 110 60 36.7 23.8 16.2 12.2 10.3 SD 7.0 3.6 1.6 1.3 1.1 0.7 0.5 CV（%） 6.4 6.0 4.3 5.6 6.7 5.6 5.1 Max. 129 67.6 39.4 27.4 19.1 13.4 11.5 Mini. 101 52.6 34.3 21.7 14.5 11.1 9.6 Range 28 15.0 5.1 5.7 4.6 2.3 1.9 m + 2.6SD 128.3 69.3 40.8 27.3 19.0 14.0 11.7 m − 2.6SD 91.7 50.7 32.6 20.3 13.4 10.5 8.9 最低検出感度  

Channel values FCXM Bcell-IgG

LABScreen-IgG B*07:02 1,484 840 552 n = 20 × 16 × 32 × 64 × 128 × 256 × 512 × 1,024 平均値 522.6 454.8 400.3 352.1 309.4 278.3 259.3 SD 6.9 6.7 4.8 6.1 7.3 6.2 5.7 CV（%） 1.3 1.5 1.2 1.7 2.4 2.2 2.2 Max. 540 468 408 368 328 289 272 Mini. 513 440 393 342 297 268 251 Range 27 28 15 26 31 21 21 m + 2.6SD 540.4 472.2 412.8 368 328.4 294.3 274.1 m − 2.6SD 504.7 437.4 387.7 336.1 290.4 262.2 244.4 最低検出感度 0 50,000 100,000 150,000 200,000 250,000 MESF 0 50,000 100,000 150,000 200,000 250,000 300,000 350,000 MESF 0 200 400 600 800 ×1 ×2 ×4 ×8 ×16 ×32 ×64 ×1 ×2 ×4 ×8 ×16 ×32 ×64 ×1 ×2 ×4 ×8 ×16 ×32 ×64 ×1 ×2 ×4 ×8 ×16 ×32 ×64 MFI 0 200 400 600 800 1,000 MFI FCXM Tcell-IgG FCXM Bcell-IgG Linear values Channel values 抗HLA抗体陽性血清希釈倍率 抗HLA抗体陽性血清希釈倍率

抗HLA抗体陽性血清希釈倍率 抗HLA抗体陽性血清希釈倍率 _{（log values）}

FCXM-IgG解析法の検討

でおよそ 100 以下，Ratio 比では Sample/NC でおよ そ 1.5 以下であった（Table 2）。

2．LABScreen Single Antigen IgG Test

1）LABScreen single-IgG と FCXM-IgG の比較検討 LABScreen single-IgG nMFIと FCXM-IgG MFI の 比較では，FCXM Tcell-IgG の Linear values が r = 0.875・Channel values が r = 0.849 であり，FCXM

Bcell-IgGの Linear values が r = 0.846・Channel values が r = 0.879 であった（Figure 3）。

LABScreen single-IgG nMFI と FCXM-IgG MESF の比較では，Linear values と Channel values において 共にほぼ一致した結果であり，FCXM Tcell-IgG が r = 0.870・FCXM Bcell-IgG が r = 0.836 であった （Figure 4）。

FCXM-IgG Cut-off値の検討（n = 35）

Linear values

CD3 NC Sample Sample − NC Sample/NC

MESF

CD19 NC Sample Sample − NC Sample/NC

MESF NC Sample Sample − NC NC Sample Sample − NC 平均値 7.3 8.2 0.9 1.1 1,657 1,889 232 8.9 10.4 1.5 1.2 2,053 2,440 388 SD 2.2 2.9 1.8 0.3 544 716 450 3.5 4.7 2.4 0.3 899 1,218 626 CV（%） 30.2 35.1 194 22.9 33 38 194 39.9 45.4 159.3 25.3 44 50 161 Max. 12.7 16.1 5.3 1.9 3,000 3,874 1,308 21.7 31.2 9.5 2.2 5,345 7,906 2,561 Mini. 4.4 4.5 −2.7 0.8 959 978 −682 5.1 4.3 −1.7 0.8 1,110 924 −401 Range 8.3 11.6 8.0 1.1 2,041 2,896 1,989 16.7 26.9 11.2 1.4 4,235 6,982 2,962 m + 3SD 13.9 16.9 6.4 1.9 3,288 4,037 1,581 19.5 24.6 8.8 2.1 4,750 6,096 2,265   Channel values

CD3 NC Sample Sample − NC Sample/NC

MESF

CD19 NC Sample Sample − NC Sample/NC

MESF NC Sample Sample − NC NC Sample Sample − NC 平均値 216 228 11.4 1.1 1,657 1,888 231 236 252 15.5 1.1 2,052 2,439 387 SD 31 37 23.1 0.1 545 715 451 36 43 25.6 0.1 899 1,213 623 CV（%） 14 16 202.4 10.4 33 38 195 15 17 165.6 11.3 44 50 161 Max. 282 309 71 1.4 2,983 3,876 1,309 342 382 88 1.4 5,338 7,867 2,529 Mini. 165 167 −31 0.9 959 978 −683 180 161 −29 0.9 1,109 923 −404 Range 117 142 102 0.5 2,024 2,898 1,992 162 221 117 0.6 4,228 6,945 2,933 m + 3SD 309 340 80.8 1.4 3,291 4,034 1,583 344 380 92.3 1.4 4,749 6,080 2,256 Table 2  0 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 120,000 140,000 0 1,000 2,000 3,000 FCXM Tcell-IgG MFI r＝0.846 0 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 120,000 140,000 160,000 0 1,000 2,000 3,000 4,000 FCXM Bcell-IgG MFI r＝0.849 0 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 120,000 140,000 0 200 400 600 0 200 400 600 FCXM Tcell-IgG MFI r＝0.879 0 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 120,000 140,000 160,000 FCXM Bcell-IgG MFI

Linear values Channel values

Linear values Channel values

r＝0.875 LABScreen IgG ClassⅠnMFI LABScreen IgG ClassⅠnMFI LABScreen IgG ClassⅠ/ⅡnMFI LABScreen IgG ClassⅠ/ⅡnMFI

LABScreen single-IgG（nMFI）と FCXM-IgG（MFI）の比較（n = 78）

III　考 察 当院では，1996 年頃から FCXM-IgG の基礎的検討 を重ね 2000 年頃より検査導入を開始している14)_。そ して，腎臓移植に使用される新しい免疫抑制剤の導 入により検査法自体に非特異的な反応を示す薬剤も 確認され徐々に検査法の改良を加えてきた15)_。 本研究では，まず FCXM-IgG 測定条件として，日 常精度管理に使用している CaliBRITE Beads をすべ ての初期設定値とし，測定結果に測定技師の主観が 影響しないようにした。

この測定条件において ASHI Laboratory Manual12)

に準じた方法を基準としドナー候補リンパ球の Protease処理の有無およびリンパ球数と血清量につ いて検討した結果，Protease 処理したリンパ球では Bcellに対する Fcγ レセプターなどの非特異的な反応 が抑制され16)_{，Tcell に対する抗 HLA 抗体陽性血清} の反応性も本研究では良好であった。しかし，Protease 処理に関して偽陽性反応が生じる可能性を懸念する 報告文献17)_{もあり未だ統一した見解は得られていな} い。また，血清量に対してリンパ球数の少ない割合 において反応性が良好であり，検出感度の向上に繋 がると考えられる。患者血清 78 検体において FCXM Bcell-IgGと LCT-XM Bcell（warm）とは，陽性一致 率 61.9%であったが，これは検出感度ではなく補体 結合性のある DSA 有無の問題と考えられる。

FCXM-IgG解析法について flow cytometer FACS Caliburの Channel values は 0–1,024，Linear values は 0–10,000 の scale range である。海外では，anti-human

IgGの Channel values 解析法を導入している施設が

多いようであるのに対し国内では，Linear values 解 析法が主流である。そして，近年では anti-human IgG の Channel values および Linear values を MESF 単位 に演算することにより測定閾値・直線性・機器間な どによる測定結果を統一化した定量比較を可能にす る単位として導入が検討されてきている。

ASHI Laboratory Manual10)では，Channel values 解

析法のみ記載されているため，筆者らは，同一条件 における anti-human IgG の Channel values および

Linear values解析法について検討した結果，Linear

valuesと Channel values 解析法で FCXM

Tcell・Bcell-IgG共に約 500 付近で結果に逆転現象が生じること を確認した。この逆転現象に伴い，特に Sample/NC 比など Cut-off 値の設定において大きく結果に影響を 及ぼすことを証明し，筆者らはこの現象についてそ r＝0.870 0 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 120,000 140,000 0 500,000 1,000,000 0 500,000 1,000,000 1,500,000 0 500,000 1,000,000 1,500,000 0 500,000 1,000,000 FCXM Tcell-IgG MESF r＝0.836 0 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 120,000 140,000 160,000 FCXM Bcell-IgG MESF r＝0.870 0 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 120,000 140,000 FCXM Tcell-IgG MESF r＝0.836 0 20,000 40,000 60,000 80,000 100,000 120,000 140,000 160,000 FCXM Bcell-IgG MESF

Linear values Channel values

Linear values Channel values

LABScreen IgG ClassⅠ/ⅡnMFI LABScreen IgG ClassⅠ/ⅡnMFI LABScreen IgG ClassⅠnMFI LABScreen IgG ClassⅠnMFI

LABScreen single-IgG（nMFI）と FCXM-IgG（MESF）の比較（n = 78）

れぞれの scale range の違いが要因であると推察した。 しかし，それぞれを MESF 単位に演算することによ り，ほぼ一致した解析結果が得られることも同時に 証明した。また，本研究での測定条件において得ら れた解析結果は，Bray18)の報告と概ね一致した結果 でもあった。 そして，比較対照として用いた LABScreen single-IgG nMFI と FCXM-IgG MESF を 比 較 し た 結 果 ，

FCXM-IgGで検出される自己抗体などの免疫グロブ

リンや LABScreen single-IgG で検出される natural antibody6)～8)などの影響も推測されたが，本研究にお

いて良好な相関性が得られたことによりそれぞれの 蛍光強度から近似曲線を作成し定量評価できる可能 性が期待される。

最 後 に FCXM-IgG 最 低 検 出 感 度 の 検 討 で は ， LABScreen-IgG の Cut-off を 500 nMFI か ら 1,000

nMFIの範囲で設定している施設が多いようである が，mean ± 2.6SD 法において FCXM Tcell・Bcell-IgG 共に LABScreen-IgG と比較すると 840 nMFI まで抗 体検出が可能であった。この結果から臨床上必要な 検出感度が十分得られた高感度クロスマッチ検査法 であると示唆されるが，抗 HLA 抗体以外の免疫グ ロブリンなどヒトリンパ球に対する特異性について は，今後基礎的な追加検討が必要であると考える。 IV_{結 語} FCXM-IgGは，ヒトリンパ球を使用した高感度な DSA検出法として今後，検査法および解析法を統一 化することにより国内でも普及していくと思われる。 　 なお，本論文は 2014 年 5 月開催の第 63 回日本臨 床検査学会にて発表した。 ■文献  1) 石塚 敏：「臓器移植における HLA 抗体検査について」，日本 組織適合性学会，2013; 20: 121–129.

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 5) Tait BD et al.: “Review article: Luminex technology for HLA antibody detection in organ transplantation,” Nephrology (Carlton), 2009; 14: 247–254.

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 7) El-Awar N et al.：“Epitopes of HLA antibodies found in sera of normal healthy males and cord blood,” Clinical Transplants, 2008; 199–214.

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 9) Fujiwara K, et al.: “Application of bead array technology to simultaneous detection of human leucocyte antigen and human platelet antigen antigen antibodies,” Vox Sang, 2009; 96: 244– 251.

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14) Abe M et al.: “Postoperative production of anti-donor antibody and chronic rejection in renal transplantation,” Transplantation, 1997; 63: 1616–1619.

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16) Lobo PI et al.: “Improved specificity and sensitivity when using pronase-digested lymphocytes to perform flow-cytometric crossmatch prior to renal transplantation,” Transplant International, 2002; 15: 563–569.

17) Hetrick SJ et al.: “Impact of pronase on flow cytometric crossmatch outcome,” Hum Immunol, 2011; 72: 330–336. 18) Bray RA: “Lymphocyte crossmatching by flow cytometry,”

Methods in Molecular Biology, 2013; 1034: 285–296.

Technical Article

A novel procedure of flow cytometry lymphocyte crossmatch test with

high sensitivity using human lymphocytes in renal transplantation

Yuri KOBAYASHI1)_{Tsutomu ISHIZUKA}1)_{Mineko YASUO}1)_{Hitomi MIURA}1)

Kazuhiro IWADOH2)_{Ichiro NAKAJIMA}2)_{Shohei FUCHINOUE}2)

1)Division of Transplant Immunology, Central Clinical Laboratories, Tokyo Women’s Medical University(8-1, Kawada-cho, Shinjuku-ku, Tokyo 162-8666, Japan)

2)Department of Surgery, Kidney Center, Tokyo Women’s Medical University

Summary

In renal transplantation, it is immunologically critical to detect donor-specific HLA antibodies (DSA) at a highly sensitive level before transplantation to avoid antibody-mediated acute rejection. We conducted basic research on refining the conventional flow cytometry lymphocyte crossmatch-IgG (FCXM-IgG) test to detect HLA antibodies at a highly sensitive level and on standardizing this novel procedure. We measured the levels of FCXM-IgG and LABScreen single-IgG using human donor lymphocytes in serum samples of 78 renal transplant recipients who visited the outpatient clinic of the Department of Surgery III at Tokyo Women’s Medical University. The correlation coefficients between FCXM-IgG MFI level and LABScreen single-IgG nMFI level were as good as about 0.8 for both B and T cells. These coefficients measured in linear values were almost equal to those measured in channel values. Even if we consider that the LABScreen single-IgG level could be affected by the coexistence of natural antibodies to some extent, we demonstrated in this study that the measured levels of FCXM-IgG and LABScreen single-IgG with fluorescence intensity correlated well with each other.

Key words: human leukocyte antigen (HLA), donor-specific HLA antibodies (DSA), lymphocyte cytotoxicity

crossmatch test (LCT-XM), flow cytometry lymphocyte crossmatch-IgG test (FCXM-IgG), LABScreen Single Antigen IgG Test (LABScreen single-IgG)