ヒト動脈硬化性病変における peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-α および PPAR-γ の発現増加

ヒト動脈硬化性病変における

peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-α

および

PPAR-γ

日本大学医学部病態病理学系病理学分野

末吉 純久

申請年

2014

ヒト動脈硬化性病変における

peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-α

および

PPAR-γ

日本大学医学部病態病理学系病理学分野

末吉 純久

申請年

2014

目次

1. 概要 ... 1

2. 緒言 ... 3

2.1 粥状動脈硬化の病理(進展過程)... 3

2.2 Peroxisome Proliferator-Activated Receptors: PPARs ... 5

2.3 PPARsサブタイプ、組織分布および機能 ... 6

2.4 PPAR-αおよびPPAR-γと粥状硬化 ... 7

2.5 本研究の目的 ... 8

3. 対象と方法 ... 10

3.1 ヒト大動脈組織片 ... 10

3.2 全RNAの抽出 ... 10

3.3 Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) ... 11

3.4 病理組織学的解析のための組織標本作製 ... 13

3.5 免疫組織化学的染色... 13

3.6 Western blotting ... 15

3.7 細胞増殖 ... 16

3.8 CD68-陽性細胞の形態計測学的解析 ... 16

3.9 統計学的解析 ... 17

4. 結果 ... 18

4.1 PPAR-αおよびPPAR-γ mRNAの発現 ... 18

4.2 PPAR-γタンパク質発現 ... 19

4.3 細胞増殖 ... 20

4.4 マクロファージ数 ... 20

5. 考察 ... 21

6. まとめ ... 23

7. 謝辞 ... 25

Table 1 General data of examined cases and the number of samples used. ... 26

Table 2 Primer sequences and expected product size. ... 27

Table 3 Expression rates of PPAR-α and PPAR-γ in human aorta. ... 28

Figure 1. Study methodology. ... 29

Figure 2. Expression of PPAR-α and PPAR-γ mRNA in human aortas. ... 30 Figure 3. Comparison of the mRNA expression level in atheromatous plaques with

that in the DIT in individual cases, and between the PPAR-α and PPAR-γ mRNA

expression levels within each atheromatous sample for each type of lesion. ... 31 Figure 4. PPAR-γ protein expression in DIT, fatty streaks, and atheromatous

plaques. ... 32 Figure 5. Localization of the PPAR-γ protein in the aorta. ... 33 Figure 6. PPAR-γ protein expression analyzed by Western blotting. ... 34 Figure 7. Percentage of Ki67-positive cells (a) and total number of cells (b) in the

intima of human aorta, and comparison of PPAR mRNA expression with cell

proliferation (c). ... 35 Figure 8. Comparison of the mRNA expression of PPAR-α (a) and PPAR-γ (b)

with the macrophage proliferation. ... 36 Figure 9. Comparison of the mRNA expression of PPAR-α (a) and PPAR-γ (b)

with the percentage of CD68-positive area in DIT and fatty streak. ... 37 8. 引用文献 ... 38

1. 概 要

【 目 的 】 ペ ル オ キ シ ゾ ー ム 増 殖 薬 活 性 化 受 容 体(Peroxiso me

Proliferator-Act ivated Receptors: PPARs)は 脂 質 代 謝 、グ ル コ ー ス の 恒 常 性 維 持 機 構 、 炎 症 応 答 、 お よ び そ の 他 の 生 物 学 的 反 応 に 関 わ る 遺 伝 子 の 制 御 を 行 う 核 内 受 容 体 ス ー パ ー フ ァ ミ リ ー に 属 す る リ ガ ン ド 依 存 的 な 転 写 制 御 因 子 で あ る 。 本 研 究 は ヒ ト 粥 状 硬 化 の 発 症 の 機 構 を 解 明 す る の を 目 的 と し て 設 計 し た も の で 、粥 状 硬 化 性 病 変 に お け る PPAR サ ブ タ イ プ の mRNA と タ ン パ ク 質 の 発 現 お よ び こ の 発 現 と 血 管 内 膜 細 胞 の 増 殖 活 性 お よ び マ ク ロ フ ァ ー ジ 浸 潤 と の 関 連 を 調 べ た 。

【 方 法 】 剖 検 35 症 例 か ら 大 動 脈 を 採 取 し 、 組 織 学 的 に び 漫 性 内 膜 肥 厚 (diffuse int imal thickening : DIT)、 脂 肪 線 条 お よ び 粥 腫 の 3 つ の 型 に 分 類 し た 。 各 病 変 を 二 分 割 し 、 一 片 は PPARs mRNA あ る い は タ ン パ ク 質 発 現 を Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)法 あ る い は

Western blotting 法 に よ り 調 べ 、 他 片 は 抗 PPAR-γ 抗 体 、 抗 CD68 抗 体 、 抗 Ki67 抗 体 を 用 い た 免 疫 組 織 化 学 的 染 色 を 実 施 し た 。

【 結 果 】PPAR-α お よ び PPAR-γ mRNA は 、DIT に 比 べ 粥 腫 と 脂 肪 線 条 に 高 頻 度 に 発 現 し 、 か つ 発 現 レ ベ ル も 有 意 に 高 か っ た 。 粥 腫 と 脂 肪 線 条 の 両 者 に お い て 、PPAR-α mRNA 発 現 レ ベ ル は PPAR-γ mRNA 発 現 レ ベ ル と 相 関 し て い た 。 粥 腫 の PPAR-γ タ ン パ ク 質 発 現 レ ベ ル は 、DIT に お け る 発 現 レ ベ ル よ り 有 意 に 高 か っ た 。PPAR-γ タ ン パ ク 質 は 粥 腫 の 主 に マ ク ロ フ ァ ー ジ の 核 に 認 め た が 、 そ の 他 、 単 核 球 、 内 膜 平 滑 筋 細 胞 お よ び 血 管 内 皮 細 胞 の 核 内 に も 局 在 し た 。 粥 腫 で は 内 膜 細 胞 増 殖 活 性 が 有 意 に 増 加 し た が 、 こ の 増 殖 と PPAR-α お よ び PPAR-γ mRNA 発 現 は 関 連 し な か っ た 。DIT お よ び 脂 肪 線 条 の 両 者 に お い て 、PPAR-α お よ び PPAR-γ mRNA 発 現 と 内 膜 に 浸 潤 し た

マ ク ロ フ ァ ー ジ 数 と の 関 連 は 認 め な か っ た 。

【 考 察 】粥 腫 に お い て 、PPAR-α お よ び PPAR-γ mRNA 量 は DIT に 比 較 し て 有 意 に 増 加 し 、 脂 肪 線 条 か ら 粥 腫 へ と 重 症 化 す る に つ れ て 増 加 す る 傾 向 が 見 ら れ た 。ま た 、脂 肪 線 条 と 粥 腫 に お い て PPAR-α の 発 現 は PPAR-γ の 発 現 と 相 関 関 係 が 見 ら れ た 。 さ ら に 、 粥 状 硬 化 性 病 変 に お け る PPAR-γ 発 現 増 加 は 主 に マ ク ロ フ ァ ー ジ に 認 め た が 、 血 管 内 膜 の マ ク ロ フ ァ ー ジ 浸 潤 と 相 関 関 係 が 見 ら れ な い こ と か ら 、 あ る 特 定 の マ ク ロ フ ァ ー ジ の み が PPAR-γ を 発 現 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。 ま た 、PPARs は 細 胞 増 殖 を 調 節 す る と い わ れ て い る が 、 マ ク ロ フ ァ ー ジ の 増 殖 と は 関 連 し な か っ た 。

【 結 論 】PPAR-α お よ び PPAR-γ 発 現 増 加 は 粥 腫 の 形 成 と 関 連 す る こ と 、 PPAR-γ 発 現 増 加 は 動 脈 硬 化 性 病 変 進 展 過 程 の 早 期 か ら 関 与 す る こ と を 示 唆 し て い る 。

2. 緒 言

本 章 で は 、 本 研 究 の 背 景 と 目 的 に つ い て 述 べ る 。2.1 で は 、 粥 状 硬 化 の 病 理 、 特 に 進 展 過 程 に つ い て 歴 史 的 背 景 を ふ ま え 述 べ る 。2.2～2.3 で は PPARs に 関 す る 知 見 を 述 べ 、2.4 で は PPARs と 粥 状 動 脈 硬 化 症 と の 関 連 を 述 べ る 。 以 上 2.1～2.4 を ふ ま え て 2.5 で は 本 研 究 の 目 的 に つ い て 述 べ る 。

2.1 粥 状 動 脈 硬 化 の 病 理(進 展 過 程)

粥 状 動 脈 硬 化 は 、 多 数 の 因 子 が 関 与 し て い る 複 雑 な 疾 患 で あ る 。 そ の 特 徴 は 、 動 脈 壁 に 徐 々 に 脂 肪 が 蓄 積 す る こ と(粥 腫)で あ り 、 こ の 粥 腫 が 破 裂 す る と 冠 動 脈 な ど で は 血 流 が 途 絶 し 心 筋 梗 塞 を 発 症 す る 。 現 在 、 粥 状 動 脈 硬 化 は 内 皮 機 能 障 害 、 血 管 平 滑 筋 細 胞 の 増 殖 、 お よ び マ ク ロ フ ァ ー ジ 泡 沫 細 胞 形 成 に 導 く 炎 症 性 細 胞 に お け る 脂 質 の 蓄 積 に 特 徴 づ け ら れ る 慢 性 的 炎 症 性 状 態 と さ れ 、 そ の 発 生 ・ 進 展 に 関 す る 概 念 は 、「 傷 害 反 応 説

(response-to-injury hypothesis)」の 後 、広 く「 炎 症 説 ｣に 集 約 さ れ 今 日 に 至 っ て い る[1, 2]。

び 漫 性 内 膜 肥 厚(diffuse int imal thickening: DIT)は 、 発 生 機 序 は 不 明 で あ る が 、 既 に 小 児 期 か ら 認 め ら れ る 形 態 変 化 で あ る こ と か ら 生 理 的 な 適 応 現 象 と 考 え ら れ て い る[3]。DIT の 病 理 学 的 特 徴 は 、1) 規 則 的 な 平 滑 筋 細 胞 と 弾 性 線 維 を 含 む 間 質 の 増 生 に よ る 内 膜 肥 厚 で あ る こ と 、2) 脂 質 沈 着 を 認 め な い こ と 、3) マ ク ロ フ ァ ー ジ 浸 潤 は 殆 ど 無 く 、ま た は 内 膜 表 層 に 少 数 認 め る の み で あ る こ と で あ る 。DIT は 、American Heart Association 動 脈 硬 化 病

型 分 類 に お け る Type-I あ る い は Type-II へ と 進 展 し 、 粥 状 動 脈 硬 化 の 発 生 基 盤 と な り や す い 、即 ち 、動 脈 硬 化 を 発 生 し 易 い 領 域(atherosclerosis-prone region)の 一 つ で あ る と 考 え ら れ て い る[3, 4]。

ヒ ト 粥 状 動 脈 硬 化 の 早 期 病 変 で あ る 脂 肪 線 条 の 病 理 学 的 特 徴 は 、1) 肥 厚 内 膜 深 部 ま た は 全 層 に 認 め ら れ る 細 胞 外 と 細 胞 内 に お け る 脂 質 の 沈 着 、2) マ ク ロ フ ァ ー ジ の 内 膜 内 浸 潤・集 積 、3) こ れ ら の 病 理 学 的 変 化 に 伴 う 内 膜 の 間 質 な ら び に 細 胞 分 布 の 変 化 に 特 徴 づ け ら れ る[5-7]。 一 方 、 粥 腫 の 病 理 学 的 特 徴 は 動 脈 内 膜 下 の 脂 質 蓄 積 お よ び 平 滑 筋 細 胞 、 マ ク ロ フ ァ ー ジ 、T リ ン パ 球 の 浸 潤 お よ び そ れ ら の 組 織 崩 壊 物 の 蓄 積 を 結 合 組 織 が 被 覆 し た 隆 起 病 変 で あ る 。

単 球 ・ マ ク ロ フ ァ ー ジ の 浸 潤 経 路 は 、 早 期 病 変 で は 内 膜 表 層 か ら と 推 定 さ れ て い る が 、 病 変 の 進 展 と 共 に 内 膜 内 に 新 生 血 管 が 出 現 し 、 新 生 血 管 か ら の 単 球 ・ マ ク ロ フ ァ ー ジ の 浸 潤 も 重 要 な 経 路 と 考 え ら れ て い る[8]。

ま た 、 単 球 ・ マ ク ロ フ ァ ー ジ の 浸 潤 誘 導 機 序 に つ い て は 早 期 動 脈 硬 化 病 変 で は 不 明 で あ る が 、 早 期 の 脂 質 沈 着 部 な い し そ の 周 囲 の 内 膜 平 滑 筋 細 胞 に 単 球 走 化 性 蛋 白-1 (monocyte chemotactic protein-1: MCP-1)発 現 を 認 め る こ と 、 ま た 沈 着 脂 質 の 多 く は 酸 化 脂 質 で あ る こ と か ら 、 酸 化 ス ト レ ス に よ り DIT 深 部 の 平 滑 筋 細 胞 に 発 現 し た MCP-1 が 単 球 ・ マ ク ロ フ ァ ー ジ の 内 膜 内 へ の 浸 潤 に 関 与 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ て い る[5]。

粥 状 硬 化 症 の 進 展 に 伴 い 合 併 病 変 （ 臓 器 梗 塞 な ど の 動 脈 硬 化 関 連 疾 患 ） が 問 題 と な る が 、 そ れ に は 粥 腫 の 不 安 定 化(不 安 定 プ ラ ー ク)に 炎 症 が 関 与 し て い る と 考 え ら れ て い る[1, 2]。不 安 定 プ ラ ー ク と は 病 理 形 態 学 的 三 要 因 、 す な わ ち 、1) エ ス テ ル 化 コ レ ス テ ロ ー ル に 富 む 偏 在 性 粥 腫 で あ る こ と 、2) 粥 腫 を 被 覆 す る 線 維 性 被 膜 が 菲 薄 で あ る こ と 、3) 被 膜 に 高 度 な マ ク ロ フ ァ

ー ジ な ど の 炎 症 細 胞 浸 潤 を 認 め る が 、平 滑 筋 細 胞 は 少 な い こ と 、で あ る[9]。 居 石 ら[10]は 、 ヒ ト 冠 動 脈 硬 化 内 膜 内 新 生 血 管 の 病 理 学 的 研 究 か ら 、 粥 腫 内 に 認 め ら れ る 血 管 新 生 過 程 は 内 膜 の 傷 害 に 対 す る 修 復 反 応 で あ り 、 ま た 新 生 血 管 の 周 囲 に 密 な 炎 症 細 胞 の 集 簇 を 伴 っ て い る こ と は 、 動 脈 硬 化 が 進 行 性 、 か つ 活 動 性 で あ る こ と を 示 し て い る た め 、 血 管 新 生 は 動 脈 硬 化 病 巣 の 炎 症 を 促 進 す る の み な ら ず 、 粥 腫 不 安 定 化 の 病 理 学 的 要 因 の 一 つ で あ る と 述 べ 、 粥 状 動 脈 硬 化 症 の 進 展 ・ 発 生 病 態 に 関 す る 概 念 と し て 「 炎 症 ・ 修 復 説 」 を 提 唱 し て い る 。

2.2 Peroxisome Proliferator-Activated Receptors: PPARs

ペ ル オ キ シ ゾ ー ム 増 殖 薬 活 性 化 受 容 体(Peroxiso me Proliferator-Activated Receptors: PPARs)は 、 ペ ル オ キ シ ゾ ー ム 増 殖 薬 と 呼 ば れ る 合 成 化 合 物 の 遺 伝 子 転 写 に 対 す る 作 用 を 媒 介 す る 核 内 受 容 体 と し て 初 め て ク ロ ー ニ ン グ さ れ た[11]。 そ の 後 間 も な く 、 エ イ コ サ ノ イ ド や 脂 肪 酸 に も PPAR を 介 し た 遺 伝 子 転 写 の 調 節 能 が あ り 、 脂 質 代 謝 、 グ ル コ ー ス ホ メ オ ス タ シ ス 、 炎 症 応 答 と そ の 他 の 生 物 学 的 過 程 に 関 連 す る 遺 伝 子 の 制 御 を 行 う 核 内 受 容 体 ス ー パ ー フ ァ ミ リ ー に 属 す る リ ガ ン ド 依 存 的 な 転 写 制 御 因 子 で あ る こ と が 明 ら か と な っ た 。 分 子 レ ベ ル で は 、PPARs は 他 の 核 内 ホ ル モ ン 受 容 体 と 同 様 に 作 用 す る 。PPARs は 、9-cis retino ic acid を リ ガ ン ド と す る 核 内 受 容 体 で あ る レ チ ノ イ ド X受 容 体(retino ic X receptor: RXR)と ヘ テ ロ ダ イ マ ー を 形 成 し 、標 的 遺 伝 子 の プ ロ モ ー タ/エ ン ハ ン サ ー 領 域 に 存 在 す る 特 定 の ペ ル オ キ シ ソ ー ム 増 殖 因 子 応 答 配 列(peroxiso me-proliferator-response element: PPRE)

と 呼 ば れ る DNA 配 列(シ ス エ レ メ ン ト)に 結 合 す る 。次 に 、こ こ に ホ ル モ ン (リ ガ ン ド)が 結 合 す る と 、 そ れ に 応 答 し て 転 写 を 活 性 化 す る[12, 13]。

西 欧 社 会 に お い て 、 糖 尿 病 、 肥 満 、 動 脈 硬 化 症 、 癌 な ど の 慢 性 疾 患 が 死 亡 原 因 の 多 く を 占 め て い る が 、 こ れ ら の 疾 患 に は 、PPARs が 関 与 し て い る と 推 定 さ れ て い る[14]。

2.3 PPARs サ ブ タ イ プ 、 組 織 分 布 お よ び 機 能

PPARs は 、3 つ の サ ブ タ イ プ 、PPAR-α、PPAR-β/δ お よ び PPAR-γ が 同 定 さ れ 、 異 な る 組 織 分 布 と 生 物 学 活 性 を 持 つ こ と が 分 か っ て い る 。PPAR-α は 主 に 肝 臓 、 心 臓 、 筋 肉 、 腎 臓 と 褐 色 脂 肪 組 織 に お い て 発 現 さ れ 、 脂 肪 酸 異 化 の 制 御 を 行 う 。PPAR-α は フ ィ ブ レ ー ト 等 の 脂 質 降 下 剤 に よ り 活 性 化 さ れ 、ト リ グ リ セ リ ド 代 謝 に 作 用 す る 、あ る い は 肝 臓 に お け る HDL 代 謝 や 胆 汁 酸 合 成 お よ び 異 化 を 調 節 す る こ と で 血 漿 脂 質 輸 送 を 制 御 す る 。PPAR-γ は 脂 肪 細 胞 お よ び マ ク ロ フ ァ ー ジ 内 で 高 度 に 発 現 さ れ 、 脂 肪 細 胞 分 化 、 脂 質 貯 蔵 お よ び グ ル コ ー ス ホ メ オ ス タ シ ス を 制 御 す る 。 ま た 、 チ ア ゾ リ ジ ン 系 薬 剤 な ど の 抗 糖 尿 病 薬 で 活 性 化 さ れ 、 イ ン ス リ ン 抵 抗 性 を 持 つ 患 者 や II 型 糖 尿 病 患 者 の グ ル コ ー ス の 恒 常 性 維 持 機 構 を 制 御 す る 。PPAR-β/δ は ほ と ん ど 全 て の 組 織 に 発 現 し 、 脂 肪 細 胞 お よ び 骨 格 筋 に お い て 脂 質 代 謝 や エ ネ ル ギ ー 代 謝 に 関 与 す る[15]。

2.4 PPAR-α お よ び PPAR-γ と 粥 状 硬 化

PPAR-α の 活 性 化 は in vivo と in vitro に お い て 血 管 平 滑 筋 細 胞 の 増 殖 を 抑 制 す る[16]。こ の 研 究 は 、PPAR-α ア ゴ ニ ス ト が サ イ ク リ ン 依 存 性 キ ナ ー ゼ 抑 制 因 子(cyclin-dependent kinase inhibitor: CDKI, p16INK4a)を 誘 発 す る こ と で 休 止 し た 血 管 平 滑 筋 細 胞 の 細 胞 周 期 へ の 再 入 に 重 要 な イ ベ ン ト を 阻 止 す る こ と を 示 唆 し て い る 。PPAR-γ ア ゴ ニ ス ト は 網 膜 芽 腫 遺 伝 子 生 成 物 の リ ン 酸 化 を 抑 制 し 、CDKI p27Kip1 お よ び CDKI p21Cip1 を 分 解 す る こ と で 細 胞 周 期 の 制 御 も 行 っ て い る[17]。 ま た 、Zandbergen ら[18]は 、G0/G1 switch gene 2 (G0S2)が PPARs の 直 接 的 な タ ー ゲ ッ ト 遺 伝 子 で あ る こ と を 発 見 し 、 G0S2 が 線 維 芽 細 胞 の 成 長 停 止 と 脂 肪 細 胞 分 化 に 影 響 を 与 え る こ と を 示 し て い る 。 こ の た め 、PPARs の 活 性 化 は 血 管 壁 細 胞 の 増 殖 お よ び 移 動 を 抑 制 す る こ と で 粥 状 硬 化 の 形 成 か ら 組 織 を 守 る 可 能 性 が あ る 。

PPAR-α お よ び PPAR-γ ア ゴ ニ ス ト は 、病 変 内 へ の 単 球 と リ ン パ 球 の 補 充 と そ れ に 続 く 分 化 お よ び 活 性 化 を 促 す シ グ ナ ル 依 存 性 転 写 因 子 を 妨 げ る こ と で い く つ か の 炎 症 応 答 遺 伝 子 の 発 現 を 抑 制 す る こ と が 実 験 的 に 示 さ れ て い る[19-21]。ま た 、い く つ か の 研 究 で は PPAR-α と PPAR-γ の 両 方 が Liver X receptor-α (LXR-α)の 発 現 を 誘 発 し 、 そ れ に よ り ATP-binding cassette

transporter A1 (ABCA1)お よ び コ レ ス テ ロ ー ル 流 出 に 関 連 す る そ の 他 の 遺 伝 子 の 発 現 が 活 性 化 さ れ る こ と で 、 培 養 マ ク ロ フ ァ ー ジ に お け る コ レ ス テ ロ ー ル 流 出 を 促 進 す る こ と が 示 さ れ て い る[22, 23]。Liら[24]は 、PPAR-α お よ び PPAR-γア ゴ ニ ス ト が low densit y lipoprotein (LDL)レ セ プ タ ー 欠 損 マ ウ ス に お け る 泡 沫 細 胞 形 成 お よ び 粥 状 硬 化 を 阻 止 す る が 、PPAR-β/δ ア ゴ ニ ス ト は 阻 止 し な い こ と を 示 し た 。こ の 研 究 は PPAR-α お よ び PPAR-γ ア ゴ ニ

ス ト が 異 な る ABCA1 非 依 存 性 経 路 で in vivo の 泡 沫 細 胞 形 成 を 阻 止 す る こ と を 示 し て い る 。PPAR-α に よ る 泡 沫 細 胞 形 成 の 阻 止 に は LXR-α が 必 要 で あ っ た が 、PPAR-γ に よ る 阻 止 は LXR-α に 依 存 し て い な か っ た 。 活 性 化 し た PPAR-γ は コ レ ス テ ロ ー ル エ ス テ ル 化 を 減 少 さ せ 、ATP-binding cassette transporter G1 (ABCG1)の 発 現 を 誘 発 し 、LXR な し で HDL 依 存 性 の コ レ ス テ ロ ー ル 流 出 を 促 進 し た 。こ れ ら の 研 究 は PPARs が マ ク ロ フ ァ ー ジ に お け る コ レ ス テ ロ ー ル ホ メ オ ス タ シ ス に 影 響 を 与 え る 受 容 体 特 異 的 機 構 を 明 ら か に し 、PPAR-α お よ び PPAR-γ 遺 伝 子 発 現 の 制 御 が 粥 状 硬 化 の 形 成 時 に お け る 血 管 イ ベ ン ト に と っ て 重 要 で あ る こ と を 示 唆 し て い る 。 し か し 、 ヒ ト に お け る 粥 状 硬 化 の 発 症 の 分 子 機 構 は ま だ わ か っ て い な い 。

2.5 本 研 究 の 目 的

PPAR-α お よ び PPAR-γ は 、粥 状 硬 化 性 病 変 に お い て マ ク ロ フ ァ ー ジ 、血 管 平 滑 筋 細 胞 、 リ ン パ 球 、 お よ び 内 皮 細 胞 で 発 現 さ れ る こ と が 報 告 さ れ て い る 。 し か し ヒ ト に お い て 研 究 さ れ た 病 変 数 は 限 ら れ て お り 、 い く つ か の 報 告 で は 研 究 に 関 わ っ た 患 者 数 が 明 記 さ れ て い な か っ た[25-29]。 我 々 は 、 ヒ ト 大 動 脈 に お い て 同 一 の 大 動 脈 組 織 と 粥 状 硬 化 性 病 変 内 に PPAR-α お よ び PPAR-γ を 検 知 し た[30]。し か し 、ヒ ト 大 動 脈 壁 に お け る PPAR サ ブ タ イ プ の 詳 細 な 比 較 研 究 は 行 わ れ て い な い 。 ま た 、PPARs の 発 現 が 粥 状 硬 化 の 形 成 に 重 要 な 役 割 を 果 た す 血 管 内 膜 内 に お け る マ ク ロ フ ァ ー ジ 浸 潤 お よ び 細 胞 増 殖 に ど の よ う に 関 わ っ て い る か は ヒ ト 大 動 脈 に お い て 研 究 さ れ て い な い 。 ヒ ト 動 脈 硬 化 病 変 と 、 現 在 、 汎 用 さ れ て い る 動 脈 硬 化 動 物 モ デ ル の

病 変 と は 病 理 学 的 に 多 く の 点 で 異 な り が あ る こ と か ら 、 ヒ ト 粥 状 動 脈 硬 化 症 の 病 態 解 析 、 適 切 な 診 断 ・ 治 療 な ら び に 予 防 法 の 確 立 の 為 に は 、 ヒ ト 病 変 に お け る 基 礎 的 ・ 臨 床 的 研 究 が 重 要 で あ る 。 ヒ ト に お け る 粥 状 動 脈 硬 化 の 発 症 に お い て PPARs が ど の よ う に 関 わ っ て い る の か の 機 構 を 明 ら か に す る た め 、 我 々 は 同 一 個 体 に お け る 粥 状 硬 化 性 病 変 内 に あ る PPAR サ ブ タ イ プ の 発 現 パ タ ー ン を 比 較 し 、 ヒ ト 大 動 脈 壁 内 の 細 胞 増 殖 や マ ク ロ フ ァ ー ジ 浸 潤 と の 関 係 に つ い て 調 べ た 。

3. 対 象 と 方 法

3.1 ヒ ト 大 動 脈 組 織 片

剖 検 35 例(女 性 12 例 、 男 性 23 例; 平 均 年 齢 64.4 歳 、13 歳 ～88 歳)か ら 大 動 脈 組 織 片(湿 重 量 62～1260 mg)を 採 取 し た 。大 動 脈 組 織 片 は 、1 例 を 除 き 全 て 死 亡 か ら 4時 間 以 内 、1例 の み 死 亡 か ら 6時 間 後 に 採 取 し た(Table 1)。

脂 肪 線 条 ま た は 粥 腫 を 含 む 粥 状 硬 化 性 病 変 を 正 常 な 部 分 か ら 肉 眼 的 に 切 り 離 し 、 各 病 変 を 縦 に 二 分 割 し た(Figure 1)。 一 片 は 、 全 RNA 抽 出 あ る い は タ ン パ ク 抽 出 を 行 う ま で 、た だ ち に-80°C で 保 存 し た 。全 RNA は 、ほ ぼ 全 て の 検 体 で 死 亡 か ら 3 ヶ 月 以 内 に 抽 出 し た 。 他 の 一 片 は 組 織 学 的 分 析 の た め 10%中 性 緩 衝 ホ ル マ リ ン 液 で 浸 漬 固 定 し た 。 本 研 究 は 、 日 本 大 学 医 学 部 附 属 板 橋 病 院 規 約 に よ る 研 究 承 認(1998 年 5 月 承 認)さ れ 、 全 患 者 の ご 遺 族 か ら 文 書 に よ る 同 意 を 得 た 上 で 行 っ た 。

3.2 全 RNA の 抽 出

線 維 脂 肪 組 織 の 混 入 を 防 ぐ た め 外 膜 を 除 い た 大 動 脈 片(72 片)か ら

TRIzol®試 薬(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA USA)を 用 い た acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform 法 に よ り 全 RNA を 抽 出 し た[31]。検 体 の RNA の 質 の 均 一 性 を 確 認 す る た め 、抽 出 し た 全 RNA を 分 光 光 度 計 を 用 い て 260 nm 値 を 測 定 し 、ま た は Agilent bioanalyzer 2100 (Agilent Techno logies, Sant a Clara, California)を 用 い て RNA integrity number (RIN)を 測 定 し た 。小 さ な 組

織 検 体 か ら 抽 出 し た 核 酸 を DNase で 処 理 す る と 、RNA が 分 解 あ る い は 破 壊 さ れ る こ と を 踏 ま え[32]、DNase で の 処 理 は 本 研 究 で は 行 わ な か っ た 。

3.3 Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)

RT-PCR を 製 造 業 者 の プ ロ ト コ ー ル に 従 い 、THERMOSCRIPTTM RT-PCR System (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA USA)を 用 い て 行 っ た 。

相 補 的 DNA(cDNA)は 全 RNA 1 µg を 用 い て 生 成 し た 。 全 RNA を rando m hexamer(5 ng)と DEPC 水 を 65°C で 5 分 間 予 加 熱 し 、氷 冷 し た 。次 に dTTP、 dCTP、dGTP お よ び dATP を 各 1mM ず つ 、40 units の RNaseOUT^{T M}、 お よ び 5 mM dithiothreitol(DTT)を 75 mM 酢 酸 カ リ ウ ム 、8 mM 酢 酸 マ グ ネ シ ウ ム 、 お よ び 50 mM Tris-acetate を 含 む 20 μL の cDNA 合 成 緩 衝 液(pH 8.4)と 一 緒 に 添 加 し た 。 次 に 、 混 合 物 を 5 分 間 25°C で イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 ThermoScript^{T M} 逆 転 写 酵 素(15 units), dNTPs、RnaseOUT^{T M}、DTT と cDNA 合 成 緩 衝 液 か ら な る PCR mixture を 、random hexamer の ア ニ ー リ ン グ を 行 う た め 、25°C で 10 分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し 、 次 に 65°C で 50 分 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 後 85°C で 5 分 間 加 熱 し 、 反 応 を 停 止 さ せ た 。cDNA ス ト ッ ク は –20°C で 保 存 し た 。

2 μL の 第 一 鎖 cDNA 溶 液 を プ ラ チ ナ Taq DNA ポ リ メ ラ ー ゼ を 2 ユ ニ ッ ト 、1.5 mM MgCl2、dNTP 混 合 物(各 0.2 mM)、各 0.2 μM の セ ン ス お よ び ア ン チ セ ン ス プ ラ イ マ ー を 含 む 全 50 μL の 溶 液 と 反 応 緩 衝 液 内 で 増 幅 し た 。 PCR サ イ ク リ ン グ 条 件 は 次 の 通 り で あ る 。初 期 変 性 工 程 を 94°C で 2 分 間 、 変 性 を 40 サ イ ク ル 94°C で 30 秒 毎 、 ア ニ ー リ ン グ を 55°C で 30 秒 間 、 伸

長 反 応 工 程 を 72°C で 60 秒 間 、そ し て 最 終 伸 長 反 応 を 1 サ イ ク ル 、75°C で 10 分 間 行 っ た 。RT mixture を 含 む 、 あ る い は 含 ま な い 無 菌 水 に よ る PCR を 陰 性 対 照 と し た 。

全 て の 反 応 は サ ー マ ル サ イ ク ラ ー(GeneAmp PCR System 2400, Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT)を 用 い て 行 っ た 。

PPAR 発 現 を 確 認 す る た め 、PPAR-α 用 に 2 つ の プ ラ イ マ ー を PPAR-γ 用 に 3 つ の プ ラ イ マ ー セ ッ ト を 作 製 し た 。 セ ン ス プ ラ イ マ ー と ア ン チ セ ン ス プ ラ イ マ ー は デ ー タ バ ン ク か ら 取 得 し た ヒ ト PPARs(GenBank accession no.

NM005036 お よ び NM005037)の cDNA 塩 基 配 列 か ら 設 計 し た 。 各 プ ラ イ マ ー セ ッ ト に は 同 じ PCR 試 薬 濃 度 と サ イ ク リ ン グ 条 件 を 用 い た(Table 2)。

PCR 産 物(10 μL/sample)を 1.5% ア ガ ロ ー ス ゲ ル を 含 む Tris-borate EDTA (TBE)緩 衝 液(89 mM Tris-base, 89 mM boric acid, 2 mM EDTA, pH 8.0)を 用 い て 電 気 泳 動 で 分 離 し た 。 ゲ ル を 1 μg/ mL エ チ ジ ウ ム ブ ロ マ イ ド で 染 色 し 、 280 nm UV 光 ボ ッ ク ス で 写 真 撮 影 し た 。 ゲ ル を CCD カ メ ラ(Printgraph, AE-6911CX, ATTO Corp., Tokyo, Japan)で デ ジ タ ル 画 像 と し て 捉 え 、 バ ン ド の 強 度 を public-domain National Institutes of Health Image program (version 1.61, the U.S. National Inst itutes of Health)に よ り 定 量 化 し た 。DNA 分 子 量 マ ー カ ー に は ΦX174-HincⅡ digest (Takara Shuzo, Kyoto, Japan)を 使 用 し た 。 遺 伝 子 発 現 量 は 、各 遺 伝 子 の 発 現 定 量 値 を 内 在 性 コ ン ト ロ ー ル β-actin 発 現 定 量 値 で 割 っ た 相 対 値 で 表 し た 。

3.4 病 理 組 織 学 的 解 析 の た め の 組 織 標 本 作 製

大 動 脈(74 組 織 検 体) を パ ラ フ ィ ン 包 埋 し た 。 回 転 式 ミ ク ロ ト ー ム (RM2155, Leica Microsystems AG, Wetzlar, Germany)を 用 い て 連 続 パ ラ フ ィ ン 切 片 を 4-µm 厚 で 作 製 し 、 病 変 を 評 価 す る た め ヘ マ ト キ シ リ ン-エ オ シ ン (H.E.)染 色 、 ア ル シ ア ン ブ ル ー(pH 2.5)染 色 、 お よ び エ ラ ス チ カ ‐ ワ ン ギ ー ソ ン 染 色 を 行 っ た 。「2.1 粥 状 動 脈 硬 化 の 病 理(進 展 過 程)」 で 記 載 し た 病 理 学 的 特 徴 に 基 づ き 、 こ れ ら を DIT、 脂 肪 線 条 ま た は 粥 腫 の 3 つ の グ ル ー プ に 分 類 し た 。3 つ の グ ル ー プ 間 で 年 齢(DIT、 脂 肪 線 条 お よ び 粥 腫 の 平 均 年 齢 は そ れ ぞ れ 60.0 歳 、59.5 歳 お よ び 69.7 歳)、性 別 お よ び 病 歴 に お い て 有 意 な 差 は 認 め ら れ な か っ た 。

3.5 免 疫 組 織 化 学 的 染 色

免 疫 組 織 化 学 的 染 色 は Avidin/Biotinylated Enzyme Co mplex (ABC)法 (VECTASTAIN Elite ABC kit; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)に よ っ て 行 っ た 。

脱 パ ラ フ ィ ン 後 、切 片 を 再 水 和 し 、10 mM ク エ ン 酸 ナ ト リ ウ ム 緩 衝 剤(pH 6.0)内 で 30 分 間 マ イ ク ロ 波 加 熱 し た 。1%過 酸 化 水 素/メ タ ノ ー ル 内 に 組 織 切 片 を 20 分 間 浸 し て 内 因 性 ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ 活 性 を 失 活 し 、 下 降 エ タ ノ ー ル 系 列 で 検 体 を 再 水 和 し た 。 切 片 は リ ン 酸 緩 衝 生 理 食 塩 水(PBS)で 10 分 間 洗 浄 し 、 非 特 異 性 結 合 を 防 ぐ た め 、 抗 PPAR-γ 抗 体 お よ び 抗 CD68 抗 体 染 色 用 は 1.5% 正 常 ウ マ 血 清 で 、 抗 Ki67 抗 体 染 色 用 は 5%ス キ ム ミ ル ク

(Wako Pure Chemical Industries, Ltd, Osaka, Japan)で 切 片 を 30 分 間 処 理 し た 。 次 に 切 片 を 10 倍 希 釈 し た マ ウ ス モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 PPAR-γ 抗 体(E-8; Santa Cruz Biotechno logy, Inc., CA, USA)と 4°C で 16 時 間 、あ る い は 20 倍 希 釈 し た 抗 Ki67 抗 体(MIB-1; DAKO A/S, Glostrup, Denmark)ま た は 50 倍 希 釈 し た 抗 CD68 抗 体(PG-M1; DAKO A/S, Glostrup, Denmark)と 室 温 で 1 時 間 反 応 さ せ た 。PBS で 数 回 洗 浄 後 、 切 片 を ビ オ チ ン 化 ウ マ 抗 マ ウ ス IgG と 30 分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 後 、 ア ビ ジ ン － ビ オ チ ン 化 パ ー オ キ シ タ ー ゼ 複 合 体 (Vector Laboratories Inc.)を 室 温 で 30 分 間 反 応 さ せ 、DAB(3, 3’

-diaminobenzidine tetrahydrochloride, DAKO A/S)で 発 色 さ せ た 。 マ イ ヤ ー の ヘ マ ト キ シ リ ン で 核 染 色 の 後 、 脱 水 、 透 徹 お よ び 封 入 し 光 学 顕 微 鏡 で 観 察 し た 。 ま た 、 陰 性 対 照 と し て 同 蛋 白 濃 度 の 正 常 ウ サ ギ 血 清 あ る い は 、 抗 マ ウ ス IgG2a 抗 体(DAKO A/S, Glostrup, Denmark)を 一 次 抗 体 の 代 わ り に 切 片 と 反 応 さ せ 、 そ の 後 上 記 と 同 様 の 処 理 を 行 っ た 。 抗 PPAR-γ 抗 体 に つ い て は 、別 の 2 つ の 抗 体(rabbit polyclonal antibody, Cell Signaling Technology, Inc., MA, USA お よ び mouse monoclonal antibody A3409A, Perseus Proteomics Inc., Tokyo, Japan)の 解 析 か ら 同 様 の 発 現 パ タ ー ン を 得 た 。

免 疫 二 重 染 色 に つ い て 、脱 パ ラ フ ィ ン 化 し た 切 片 を 抗 Ki67 抗 体 と イ ン キ ュ ベ ー ト し 、 次 に 切 片 を ビ オ チ ン 化 ウ マ 抗 マ ウ ス IgG で 処 理 し た 後 、 ア ビ ジ ン － ビ オ チ ン ア ル カ リ ホ ス フ ァ タ ー ゼ 複 合 体 で 処 理 し た 。Vector Red で 発 色 を 行 っ た 後 、一 次 抗 体 を 外 す た め 切 片 を 0.1 M グ リ シ ン-HCl(pH2.2)で 60 分 間 処 理 し た 。2 回 目 の 染 色 は 、 抗 CD68 抗 体 と Histofine Simple Stain MAX PO を 用 い て 行 い 、DAB で 発 色 を 行 っ た 。核 染 色 に は マ イ ヤ ー の ヘ マ ト キ シ リ ン を 用 い た 。

3.6 Western blotting

剖 検5例(60歳 ～81歳 、Table 1の Case No.31-35)か ら 採 取 し た 大 動 脈 片(粥 腫 ：n = 3、DIT：n = 3)を 用 い た 。 各 検 体 を 半 分 に 切 断 し 、 一 片 は Western blotting に 使 用 し 、 他 の 一 片 は 病 変 の 組 織 学 的 検 索 の た め に 10%中 性 緩 衝 ホ ル マ リ ン 液 で 浸 漬 固 定 し た 。Western blotting は 、 大 動 脈 片 を 氷 冷 溶 解 緩 衝 液(50 mM Tris-HCl, pH 6.8; 10% glycerol, 2% sodium dodecyl

sulfate-polyacrylamide [SDS] and 0.002% bromopheno l blue)で 溶 解 し た 。組 織 溶 解 液 を 40°C で 15 分 間 3000-G で 遠 心 分 離 し 、 上 澄 液 の タ ン パ ク 質 濃 度 を BCA protein assay kit (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA)で 定 量 し た 。50 µg の タ ン パ ク 質 を 10% SDS-polyacrylamide gel 上 に 電 気 泳 動 分 離 し て か ら 、ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜 に 移 し た 。5% fat-free milk を 含 む 0.1% Tween 20/PBS(PBS-T)溶 液 で 膜 を 1 時 間 処 理 し 、1000 倍 に 希 釈 し た 抗 PPAR-γ 抗 体 (A3409A, Perseus Proteomics Inc., Tokyo, Japan)と 40℃ で 16 時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。タ ー ゲ ッ ト タ ン パ ク 質 を ECL Advance Western Blotting Detectio n kit (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)で 検 知 し た 。 化 学 発 光 性 は

Light-Capture AE-6972(ATTO Corp., Tokyo, Japan)で 検 知 し 、CS Analyzer version 2.07 software (ATTO Corp.)で 数 量 化 し た 。 内 在 性 コ ン ト ロ ー ル に は β-actin の 発 現 を 用 い た 。

3.7 細 胞 増 殖

DIT(n = 18)、脂 肪 線 条(n = 13)、お よ び 粥 腫(n = 40)の 血 管 内 膜 内 の 抗 Ki67 抗 体 と 反 応 し た 増 殖 性 細 胞 数 を 光 学 顕 微 鏡 下 で 数 え た 。Ki67-陽 性 細 胞 指 標 は 、各 ス ラ イ ド で 20～40 の 視 野(ラ ン ダ ム な 高 倍 率 視 野; 倍 率：400×)に お い て 、 全 核 数 が 1000 以 下 で あ っ た 8 つ の 検 体 を 除 き 、 少 な く と も 1000 個 の 核 を カ ウ ン ト し た 後 、陽 性 細 胞 の パ ー セ ン ト(Ki67-陽 性 核 数/全 核 数)と し て 表 し た 。全 核 数 は 、Ki67 陽 性 核 と ヘ マ ト キ シ リ ン 染 色 核 を 合 算 し た 。全 核 数 を 全 細 胞 数 と し た 。

3.8 CD68-陽 性 細 胞 の 形 態 計 測 学 的 解 析

血 管 内 膜 に お け る 抗 CD68 抗 体 陽 性 領 域 を DIT (n = 17)と 脂 肪 線 条(n = 13)病 変 の 各 ス ラ イ ド で 形 態 計 測 学 的 に 分 析 し た 。各 ス ラ イ ド に 付 き 、倍 率 25×の 顕 微 鏡 画 像 を 3 枚 デ ジ タ ル カ メ ラ(Olympus DP12; Olympus Corp., Tokyo, Japan)で 撮 影 し 、TIFF 形 式 で 保 存 し た 。画 像 は 、Scion Image program (National Inst itutes of Health, modified by Scion Corp., Frederick, MD, USA) を 用 い て 解 析 し 、CD68-陽 性 (マ ク ロ フ ァ ー ジ) 面 積 対 全 血 管 内 膜 面 積 の 比 率(CD68-陽 性 面 積/全 血 管 内 膜 面 積)を 算 出 し て マ ク ロ フ ァ ー ジ 数 と し た 。

3.9 統 計 学 的 解 析

結 果 は 平 均 ±標 準 誤 差 と し て 表 記 し 、 一 元 配 置 分 散 分 析(ANOVA)で 分 析 後 、Dunnett の 多 重 比 較 検 定 を 行 っ た 。 相 関 関 係 は ノ ン パ ラ メ ト リ ッ ク な ス ピ ア マ ン の 相 関 係 数 を 用 い て 計 算 し た 。P 値 が 0.05 未 満 の 場 合 に 有 意 で あ る と し た 。

4. 結 果

4.1 PPAR-α お よ び PPAR-γ mRNA の 発 現

い く つ か の DIT と 脂 肪 線 条 、 ま た 粥 腫 全 例 に お い て PPAR-α と PPAR-γ mRNA の 両 方 が 検 知 さ れ た(Figure 2 a)。PPAR-α と PPAR-γ mRNAs が 認 め ら れ た 頻 度 は 粥 腫 で も っ と も 高 く(そ れ ぞ れ 35/45 例 、42/45 例)、次 に 脂 肪 線 条（ そ れ ぞ れ 8/13 例 、13/13 例 ）、次 に DIT（ そ れ ぞ れ 9/18 例 、15/18 例 ） で あ っ た(Table 3)。

PPAR-α mRNA の 発 現 量 は 病 変 型 の 重 症 度 に 比 例 し て 増 加 す る 傾 向 が 見 ら れ た 。 粥 腫 に お い て プ ラ イ マ ー1 で 検 知 し た PPAR-α mRNA の 発 現 量 は DIT よ り 有 意 に 高 く(3.7 倍 、p<0.05)、 粥 腫 に お い て プ ラ イ マ ー2 で 検 知 し た 発 現 量 は DIT の 3 倍 で あ っ た が 、 そ の 差 は 統 計 的 に 有 意 で は な か っ た (Figure 2 b)。 脂 肪 線 条 お よ び 粥 腫 に お い て プ ラ イ マ ー3 か ら 5 を 用 い て 検 知 し た PPAR-γ mRNA 発 現 量 は DIT よ り も 有 意 に 高 か っ た(Figure 2 c)。 プ ラ イ マ ー3 で 検 知 し た PPAR-γ mRNA 発 現 量 は PPAR-α mRNA 発 現 量 と 比 較 し て 、粥 腫 と 脂 肪 線 条 の 両 方 で 高 か っ た(Figure 2 b and c)。各 患 者 の 検 体 で は 同 様 の 傾 向 が 認 め ら れ 、 粥 腫 に お け る 発 現 量 が も っ と も 高 か っ た(Figure 3 a)。14 例 で は 、粥 腫 に お け る PPAR-α と PPAR-γ mRNA 発 現 量 を DIT に お け る 量 と 比 較 し 、PPAR-α mRNA 発 現 量 を 同 じ 大 動 脈 か ら 採 取 し た PPAR-γ mRNA 発 現 量 と 比 較 し た 。DIT に お け る PPAR-α と PPAR-γ の mRNA 発 現 量 は 比 例 し て い な か っ た 。 脂 肪 線 条 お よ び 粥 腫 で は PPAR-α と PPAR-γ mRNA 発 現 量 の 間 に 相 関 関 係 が 認 め ら れ た(Figure 3 b)。

4.2 PPAR-γ タ ン パ ク 質 発 現

PPAR-γ 陽 性 細 胞 を 含 む 検 体 数 は 、DIT で 7/18 例(39%)、脂 肪 線 条 で 7/13 例(54%)、 粥 腫 で 27/40 例(68%)で あ り 、 粥 状 硬 化 性 病 変 で よ り 高 頻 度 に 認 め た 。い く つ か の DIT で は 、粘 液 腫 性 大 動 脈 内 膜 を 炎 症 性 細 胞 が 浸 潤 し て い た(Figure 4 a)。こ れ ら の 例 で は 、PPAR-γ タ ン パ ク 質 発 現 は い く つ か の 大 動 脈 内 膜 平 滑 筋 細 胞 で も 発 現 さ れ て い る が 、主 に 単 球/マ ク ロ フ ァ ー ジ の 核 で 認 め ら れ 、こ れ ら が 抗 CD68 抗 体 と 反 応 し た(Figure 4 b and c)。脂 肪 線 条 に お い て CD68-陽 性 領 域 で PPAR-γ発 現 陽 性 を 観 察 し た(Figure 4 d, e and f)。 粥 腫 で は PPAR-γ タ ン パ ク 質 は マ ク ロ フ ァ ー ジ と 凝 集 し た 脂 質 に 富 む コ ア の 周 囲 の 領 域(Figure 4 g, h and i)と プ ラ ー ク シ ョ ル ダ ー(Figure 4 j, k and l) で 主 に 発 現 さ れ て い た 。PPAR-γ と CD68 の 発 現 陽 性 領 域 は マ ク ロ フ ァ ー ジ 集 簇 塊 と プ ラ ー ク シ ョ ル ダ ー の 両 方 で 重 な っ て い る が 、 粥 腫 に お け る 内 皮 細 胞 、 単 核 球 細 胞 、 お よ び 大 動 脈 内 膜 平 滑 筋 細 胞 の い く つ か の 核 も 抗 PPAR-γ 抗 体 と 反 応 し て お り(Figure 5 a, b, c and e)、 頻 度 は 単 球/マ ク ロ フ ァ ー ジ 、 大 動 脈 内 膜 平 滑 筋 細 胞 、 内 皮 細 胞 の 順 で 高 か っ た 。 大 動 脈 中 膜 平 滑 筋 細 胞 の 細 胞 質 で も 微 弱 で は あ る が 抗 PPAR-γ 抗 体 と の 反 応 が 見 ら れ た (Figure 5 d)。

陰 性 対 照 と し て 抗 マ ウ ス モ ノ ク ロ ー ナ ル IgG1 抗 体 で 染 色 し た 連 続 切 片 で は 大 動 脈 壁 に お い て 陽 性 シ グ ナ ル が 認 め ら れ な か っ た （ デ ー タ 非 表 示 ）。

Western blotting に よ り 、PPAR-γ タ ン パ ク 質 発 現 量 が DIT と 比 較 し て 粥 腫 に お い て 有 意 に 増 加 す る こ と が わ か っ た(p=0.0033, Figure 6)。

4.3 細 胞 増 殖

抗 Ki67 抗 体 染 色 に よ り 求 め た 増 殖 性 細 胞 数 は 病 変 型 の 重 症 度 に 比 例 し て 増 加 す る 傾 向 が 見 ら れ た 。 粥 腫 の Ki67-陽 性 細 胞 指 標 は DIT よ り 有 意 に 高 く(2.2-fo ld, p < 0.05, Figure 7 a)、 粥 腫 の 全 細 胞 数 は DIT の そ れ と 同 等 で あ っ た(Figure 7 b)。 し か し 、DIT、 脂 肪 線 条 あ る い は 粥 腫 に お け る PPAR-α お よ び PPAR-γ mRNAの 発 現 量 と Ki67-陽 性 細 胞 指 標 は 相 関 が 見 ら れ な か っ た(Figure 7 c)。PPAR-γ タ ン パ ク 質 発 現 頻 度 が マ ク ロ フ ァ ー ジ 、大 動 脈 内 膜 平 滑 筋 細 胞 、粥 腫 の 内 皮 細 胞 の 順 で 高 か っ た こ と か ら マ ク ロ フ ァ ー ジ の 増 殖 活 性 を 二 重 染 色 で 調 べ た 。8 例 の 剖 検 例（ 年 齢 56 歳 ～88 歳 ）か ら 採 取 し た 10 例 の 粥 腫 で は 、CD68-陽 性 マ ク ロ フ ァ ー ジ に お け る Ki67-陽 性 細 胞 指 標 はPPAR-αお よ び PPAR-γ mRNAの 発 現 量 と の 相 関 を 示 さ な か っ た(Figure 8)。

4.4 マ ク ロ フ ァ ー ジ 数

い く つ か の DIT に お い て 、PPARs タ ン パ ク 質 が 主 に マ ク ロ フ ァ ー ジ 内 で 観 察 さ れ た こ と か ら 、PPARs mRNA 発 現 と DIT と 脂 肪 線 条 に お け る マ ク ロ フ ァ ー ジ 数 と の 関 連 を 調 べ た 。脂 肪 線 条 の CD68-陽 性 領 域 はDITと 比 べ7.8- 倍 で あ っ た(3.54 ± 0.87%、n = 13 に 対 し 0.45 ± 0.09%、n = 17, p < 0.01)。 し か し 、DIT お よ び 脂 肪 線 条 の 両 者 に お い て 、PPAR-α と PPAR-γ mRNA の 発 現 量 と マ ク ロ フ ァ ー ジ 数 と の 間 に 相 関 関 係 は 認 め ら れ な か っ た(Figure 9)。

5. 考 察

本 研 究 で は 、 脂 肪 線 条 お よ び 粥 腫 に お け る PPAR-γ mRNA 発 現 お よ び 粥 腫 に お け る PPAR-α mRNA 発 現 が DIT に お け る 発 現 量 よ り も 有 意 に 高 い こ と を 示 し 、こ れ ら の PPARs 発 現 が 脂 肪 線 条 か ら 粥 腫 へ と 重 症 化 す る に つ れ て 増 加 す る 傾 向 が あ る こ と を 示 し た 。こ れ は 、こ れ ら PPARs の 発 現 が 粥 腫 形 成 に 関 連 し 、PPAR-γ が ヒ ト 粥 状 硬 化 の 初 期 段 階（ 脂 肪 線 条 の 形 成 ）に 関 連 し て い る 可 能 性 を 示 唆 し て い る 。

DIT に お い て 、PPAR-α あ る い は PPAR-γ mRNA 発 現 が 粥 腫 に 相 当 す る く ら い 高 発 現 例 が 3 例 認 め ら れ た(Case No. 22, 24 お よ び 30, Figure 3 a)。 こ れ ら の 例 に お い て PPAR-γ タ ン パ ク 質 が 主 に 粥 状 硬 化 の 初 期 病 巣 を 示 す 軽 度 の 細 胞 外 マ ト リ ク ス 沈 着 が 見 ら れ る 血 管 内 膜 内 の マ ク ロ フ ァ ー ジ に て 認 め ら れ た こ と か ら 、DIT と 脂 肪 線 条 の マ ク ロ フ ァ ー ジ の 数 を 測 定 し た 。 し か し 、DIT と 脂 肪 線 条 で は 、PPAR-α お よ び PPAR-γ mRNA 発 現 と マ ク ロ フ ァ ー ジ 数 と の 間 に は 相 関 関 係 は 認 め ら れ な か っ た 。 こ れ ら の 所 見 は 、 あ る 特 定 の 単 球/マ ク ロ フ ァ ー ジ の み が PPARs を 発 現 し 、 細 胞 内 外 の 脂 質 含 有 量 お よ び 各 病 変 内 の 炎 症 性 反 応 が PPARs 発 現 を 促 進 し 、そ れ が 粥 状 硬 化 の 形 成 に つ な が る 可 能 性 を 示 唆 し て い る 。 各 症 例 の DIT に お い て PPAR-α お よ び PPAR-γ mRNA 発 現 量 が 相 関 関 係 を 示 さ な い と い う 我 々 の 所 見 は 、 コ レ ス テ ロ ー ル や 血 糖 値 な ど の 循 環 血 に 関 連 し た 全 身 性 要 因 で は な く 、 大 動 脈 血 管 壁 内 の 個 々 の 病 変 の 炎 症 性 反 応 が ヒ ト の 大 動 脈 に お け る PPAR-α と PPAR-γ の 発 現 誘 導 に 影 響 を 与 え る と い う 考 え を 示 唆 す る も の で あ る 。 PPARs が 最 終 的 に 細 胞 を 脂 質 の 過 負 荷 か ら 守 る た め の 脂 質 セ ン サ ー と し て 機 能 す る と い う 報 告[12]と 、 ス カ ベ ン ジ ャ ー 受 容 体 が 媒 介 す る 取 込 み を 通

じ て PPAR-γ を 転 写 的 に 活 性 化 す る oxidized low densit y lipoprotein [26, 33, 34]、タ ン パ ク 質 の 酸 化 生 成 物[35]、過 酸 化 脂 質 由 来 の 主 要 な ア ル デ ヒ ド で あ る 4-hydroxy-2 nonenal (4-HNE) [36]、お よ び C 反 応 性 タ ン パ ク 質[37]が ヒ ト 粥 状 硬 化 内 に 蓄 積 す る と い う 報 告 が こ の 可 能 性 が あ る こ と を 支 持 し て い る 。

PPARs に よ る 細 胞 増 殖 の 誘 導 に 関 し て は ま だ 論 争 が 続 い て い る 。PPAR-α と PPAR-γ は 血 管 平 滑 筋 細 胞 に 対 す る 増 殖 阻 害 活 性 を 持 ち 、 線 維 芽 細 胞 の 成 長 停 止 を 誘 導 す る タ ー ゲ ッ ト 遺 伝 子 で あ る G0S2 を 共 有 す る 。 し か し 、 最 近 の 別 の 研 究 で は 、PPAR-α は 血 管 平 滑 筋 細 胞 が S 期 に 入 る の を 防 ぐ が 、 PPAR-γは 血 管 平 滑 筋 細 胞 増 殖 に 影 響 を 与 え な い こ と が 示 さ れ た[38]。ま た 、 PPAR-α と PPAR-γ の 機 能 は 乳 が ん 細 胞 に お い て 、PPAR-α は 増 殖 を 促 進 し 、 PPAR-γ は 抑 制 に 関 連 し て い る[39]。我 々 が 観 察 し た ヒ ト の 大 動 脈 で は 、粥 腫 に お い て 増 殖 性 細 胞 数 お よ び PPARs mRNA 発 現 量 は 増 加 し た が 、抗 Ki67 抗 体 を 用 い て 分 析 し た 細 胞 増 殖 活 性 は 、DIT、 脂 肪 線 条 、 ま た は 粥 腫 に お け る PPAR-α お よ び PPAR-γ の 発 現 量 と 相 関 関 係 が 見 ら れ な か っ た 。PPAR-γ タ ン パ ク 質 が 粥 腫 の 他 の 細 胞 と 比 べ 、 マ ク ロ フ ァ ー ジ で よ り 頻 繁 に 発 現 さ れ て い た こ と か ら 、 マ ク ロ フ ァ ー ジ の 増 殖 量 を 調 べ た が 、 粥 腫 に お け る PPAR-α お よ び PPAR-γ mRNAs 発 現 量 と の 相 関 関 係 は 認 め ら れ な か っ た 。 こ れ ら の デ ー タ は 、単 球/マ ク ロ フ ァ ー ジ を 含 む 細 胞 増 殖 が ど の 病 変 型 に お い て も PPARs の 発 現 量 と は 関 連 し な い こ と を 示 唆 し て い る 。

PPAR-γ タ ン パ ク 質 は 内 皮 細 胞 、マ ク ロ フ ァ ー ジ 、単 核 球 細 胞 の 核 お よ び 粥 腫 の 大 動 脈 内 膜 平 滑 筋 細 胞 で 発 現 を 認 め た 。 こ の 事 は そ の 他 の 報 告 と 一 致 し て い る[26-29]。 本 研 究 に お い て 大 動 脈 中 膜 平 滑 筋 細 胞 の 細 胞 質 は 抗 PRAR-γ 抗 体 と 弱 く 反 応 し た が 、 こ の 反 応 は 各 例 に お け る RT-PCR に よ る

mRNA の 発 現 と の 相 関 関 係 は 見 ら れ な か っ た 。

本 研 究 で は 、脂 肪 線 条 と 粥 腫 に お い て PPAR-α と PPAR-γ 発 現 の 相 関 関 係 が 認 め ら れ た 。こ の PPAR-α お よ び PPAR-γ mRNA 発 現 誘 導 は 、動 脈 硬 化 性 病 変 進 展 を 遅 ら せ る こ と を 目 的 と す る 適 応 性 反 応 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 PPAR-α と PPAR-γア ゴ ニ ス ト の 両 方 が 細 胞 外 マ ト リ ク ス メ タ ロ プ ロ テ ア ー ゼ 誘 発 因 子 を 抑 制 し 、 そ の 結 果 matrix metalloproteinase 9 分 泌 と マ ク ロ フ ァ ー ジ お よ び 泡 沫 細 胞 の 活 性 を 低 減 し[40]、 増 加 し た 泡 沫 細 胞 形 成 の 抑 制 [41, 42]お よ び Zucker 糖 尿 病 肥 満 ラ ッ ト に お け る グ ル コ ー ス 耐 性 の 改 善 に つ な が っ て い る[43]。 臨 床 研 究 に お い て 、PPAR-α ア ゴ ニ ス ト[44]あ る い は PPAR-γ ア ゴ ニ ス ト[45]で 糖 尿 病 患 者 を 治 療 し た 場 合 、粥 状 硬 化 性 病 変 の 促 進 を 抑 制 し た 。PPAR-α と PPAR-γ の 両 者 が 粥 状 硬 化 に つ な が る 一 連 の イ ベ ン ト に 保 護 的 に 関 わ る と い う こ れ ら の 報 告 と 脂 肪 線 条 と 粥 腫 に お い て

PPAR-α と PPAR-γ 発 現 の 相 関 関 係 を 認 め た 本 研 究 知 見 を 併 せ て 考 え る と 、 PPARs ア ゴ ニ ス ト や PPAR-α/γ コ ア ゴ ニ ス ト を 併 用 し て 治 療 す る こ と で 粥 状 硬 化 の 抑 制 に 相 乗 効 果 が 期 待 さ れ る こ と を 示 唆 し て い る 。

6. ま と め

PPAR-α お よ び PPAR-γ mRNAは 、粥 腫 と 脂 肪 線 条 に 高 頻 度 に 発 現 し た 。 ま た 、PPAR-α お よ び PPAR-γ mRNA は 、 い く つ か の DIT に も 発 現 し た 。 粥 腫 に お け る PPAR-α お よ び PPAR-γ mRNA 発 現 レ ベ ル は 、DIT に お け る 発 現 レ ベ ル よ り 有 意 に 高 か っ た 。 さ ら に 、DIT に お け る PPAR-α お よ び PPAR-γ mRNA 発 現 レ ベ ル は 、 粥 腫 に お け る PPAR-α お よ び PPAR-γ

mRNA 発 現 レ ベ ル に 比 例 し て い な か っ た 。 こ の こ と は 、PPAR-α お よ び PPAR-γ mRNA 発 現 誘 導 は 、循 環 血 に 関 連 し た 全 身 性 要 因 で は な く 大 動 脈 血 管 壁 内 の 個 々 の 病 変 の 炎 症 性 反 応 に よ り 調 節 さ れ て い る こ と を 示 唆 し て い る 。

PPAR-γ タ ン パ ク 質 は 、粥 腫 の マ ク ロ フ ァ ー ジ 、単 核 球 、内 膜 平 滑 筋 細 胞 お よ び 血 管 内 皮 細 胞 の 核 内 に 局 在 を 認 め た 。PPAR-γ タ ン パ ク 質 発 現 は 、 い く つ か の DIT に 認 め た 。 そ れ ら の 発 現 は 、 内 膜 浸 潤 マ ク ロ フ ァ ー ジ 、 炎 症 性 細 胞 お よ び 活 性 化 平 滑 筋 細 胞 に 認 め た 。

粥 腫 で は 、 細 胞 増 殖 活 性 が 有 意 に 増 加 し た 。 し か し 、PPAR-α お よ び PPAR-γ mRNA 発 現 と 細 胞 増 殖 活 性 と の 関 連 は 認 め な か っ た 。 ま た 、 PPAR-α お よ び PPAR-γ mRNA 発 現 は 、DIT お よ び 脂 肪 線 条 の 両 者 に お い て 内 膜 浸 潤 マ ク ロ フ ァ ー ジ 数 と も 関 連 は 認 め な か っ た 。

本 研 究 は 、ヒ ト 動 脈 壁 に お け る PPAR-α お よ び PPAR-γ 発 現 増 加 は 粥 腫 の 形 成 と 関 連 す る こ と 、PPAR-γ 発 現 増 加 は 動 脈 硬 化 性 病 変 進 展 過 程 の 早 期 か ら 関 与 す る こ と を 示 唆 し て い る 。

7. 謝 辞

本 研 究 は 、 日 本 大 学 医 学 部 病 態 病 理 学 系 病 理 学 分 野 で 、 三 俣 昌 子 教 授 に よ る 御 指 導 の も と に 行 っ た も の で あ る 。 研 究 に つ い て 終 始 適 切 な 助 言 を 賜 り 、 ま た 丁 寧 に 指 導 し て 頂 き 、 深 く 感 謝 い た し ま す 。

本 研 究 の 遂 行 に 当 た り 、 日 本 大 学 医 学 部 病 態 病 理 学 系 病 理 学 分 野 櫻 井 勇 名 誉 教 授 お よ び 根 本 則 道 主 任 教 授 に は 、 研 究 の ご 許 可 か ら 論 文 の 指 導 ま で 幅 広 い 御 指 導 を い た だ き ま し た 。 心 よ り 感 謝 い た し ま す 。

有 益 な ご 意 見 な ら び に 実 験 の ご 協 力 を い た だ き ま し た 日 本 大 学 医 学 部 病 態 病 理 学 系 病 理 学 分 野 関 係 諸 氏 に 深 く 感 謝 い た し ま す 。

最 後 に 本 研 究 の 施 行 に あ た り 、 快 く 協 力 し て 頂 い た 患 者 様 お よ び ご 家 族 の 皆 様 に 深 く 感 謝 い た し ま す 。 本 当 に あ り が と う ご ざ い ま し た 。

Table 1 General data of examined cases and the number of samples used .

Table 2 Primer sequences and expected product size.

Table 3 Expression rates of PPAR-α and PPAR-γ in human aorta.

Figure 1. Study methodology.

Figure 2. Expression of PPAR-α and PPAR-γ mRNA in human aortas.

PPAR-α and PPAR-γ mRNA expression in the aorta from a representative case (a). M: mo lecular weight markers; 1: β -actin; 2: PPAR-α (Primers 1: 491 bp);

3: PPAR-α (Primers 2: 547 bp); 4: PPAR-γ (Primers 3: 473 bp); 5: PPAR-γ (Primers 4: 582 bp); 6: PPAR-γ (Primers 5: 845 bp). Densitometric analysis o f the PPAR-α (b) and PPAR-γ (c) mRNA expression. The total RNA extracted fro m individual aortic specimens was analyzed by RT-PCR using primers 1 and 2, which are specific for PPAR -α, and using primers 3, 4, and 5, which are specific for PPAR-γ. Values were normalized to the β-actin mRNA and are expressed as means ± SEM. *, **: significant ly different from the DIT at p <

0.05 and p < 0.01, respectively (Dunnett’s test).

Figure 3. Co mparison of the mRNA expression level in atheromatous plaques with that in the DIT in individual cases, and between the PPAR -α and PPAR-γ mRNA expression levels within each atheromatous sample for each type of lesion.

In each individual case (n = 14), the expression levels of PPAR -α and PPAR-γ in the DIT were not proportional to those i n the atheromatous plaque (a). The expression level of PPAR-α correlated with that of PPAR-γ in the fatty streaks and atheromatous plaques (b).

Figure 4. PPAR-γ protein expression in DIT, fatty streaks, and atheromatous plaques.

Sections from DIT (a, b, and c), fatty streaks (d, e, and f) and atheromatous plaques (g to l) were stained with hematoxylin and eosin (a, d, g, and j), or reacted with the ant i-PPAR-γ ant ibody (b, e, h, and k) or ant i-CD68 ant ibody to detect macrophages (c, f, i, and l), and visualized by the avidin -biotin complex method. PPAR-γ was detected in the nuclei o f macrophages in the DIT (arrowheads in b and c) and in fatt y streaks, and in intimal smooth muscle cells (arrow in c). Comparison of CD68 -posit ive staining and PPAR-γ

immunoreactivity indicated that the PPAR -γ protein was mainly localized to macrophages. The boxed areas are shown in higher magnificat ion in the same panel. Original magnificat ion ×100 and ×250 (boxed area in j, k, and l).

Figure 5. Localizat ion of the PPAR-γ protein in the aorta.

The PPAR-γ protein was expressed in the nuclei of macrophages (a),

mononuclear cells (b), int imal smooth muscle cells (c), and endothelial cells (e), and also weakly in the cytoplasm of medial smooth muscle cells (d). ABC method counterstained with hematoxylin. Original magnification ×250.

Figure 6. PPAR-γ protein expression analyzed by Western blotting.

Six samples from human aortas, composed of 3 DIT and 3 atheromatous plaques, were obtained from 5 autopsied individuals (b). The same blot was reprobed with a specific anti-β-actin ant ibody and then relat ive ratios were quant ified (a).

Figure 7. Percentage of Ki67-posit ive cells (a) and total number of cells (b) in the intima of human aorta, and comparison of PPAR mRNA expressio n with cell proliferation (c).

Sections from DIT (n = 18), fatty streak (n = 13), and atheromatous plaques (n

= 40) were immunohistochemically stained with the anti-Ki67 ant ibody to detect proliferating cells, using the avidin -biotin co mplex method. (a) The Ki67-posit ive cells in the int ima was calculated (number of Ki67 -posit ive nuclei / total number of nuclei). (c) The lab eling indexes of cell growth did not correlate with the expression levels of PPAR -α (left panel) or PPAR-γ mRNA (right panel) in the DIT (open circles), fatty streak (so lid triangles), or atheromatous plaques (solid squares).

Figure 8. Co mparison of the mRNA expression of PPAR-α (a) and PPAR-γ (b) with the macrophage proliferation.

The Ki67-positive cell index in CD68 -positive macrophages was analyzed by double staining in atheromatous plaque, and was indicated at horizontal axis.

C: Double immuno staining for CD68 (brown cytoplasm) and Ki-67 (red nuclei) in atheromatous plaque. Inset: high power view of Ki67 -posit ive and CD68-positive macrophage. The labeling indexes of macrophage growth did not correlate with the expression levels of PPAR -α or PPAR-γ mRNA in atheromatous plaque.

Figure 9. Co mparison of the mRNA expression of PPAR -α (a) and PPAR-γ (b) with the percentage of CD68 -posit ive area in DIT and fatt y streak.

Sections from DIT (open circles, n = 17) and fatty streak (solid triangle, n = 13) were immunohistochemically stained with an ant i-CD68 ant ibody to detect macrophages. The CD68-posit ive areas in the intima were analyzed

morpho metrically, and then the ratio of the CD68 -posit ive area (macrophages) to the total int imal area was ca lculated. No correlat ion was observed

between the PPAR mRNA levels and the macrophage content in the DIT or fatty streak.