臨 床 化 学35:390―399,2006
プ ロジ ェク ト報告
血清 中 の総 コ レス テ ロー ル濃度 測 定 の勧 告 法
日本 臨床化 学会酵素 ・試薬専 門委 員会
(〔 血清 コ レステ ロー ル測定 の勧 告法 「 比較 対照 法」 か ら
「 実用基準法」 へ の移行 に関す る研究〕 プロジ ェク ト)
栢 森 裕 三1,森 下 芳 孝2,松 本 祐 之3,荻 津 直 通4,木 澤 仙 次5,前 田 悟 司6, 増 田 詩 織7,吉 田 隆 則8,奈 須 正 人9,梅 本 雅 夫10,片 山 善 章11
1九州大 学病院検査 部,2三 重大 学医学部 附属 病 院検査部,3名 古屋 大学 医学部 附属 病 院検査部, 4藤田保健 衛生大 学短期大 学医療 情報技 術科,5愛 知医科大学 附属 病 院中央臨床検 査部, 6岐阜大学 医学部 附属病 院検 査部,7近 畿大学 医 学部附属病 院 中央 臨床検査 部,
8日本 生命 済 生会 附属 日生 病 院 中央 臨床 検 査 部,9独 立行 政法 人 国立病 院 機構 京都 医療 セ ンター研 究 検査 科, 10HECTEFス タ ンダー ドレファ レンスセ ン ター
,11近畿福祉 大 学(プロ ジェク ト代 表)
Recommended reference method for total cholesterol measurement in serum Committee on Enzyme-Reagent, Japan Society of Clinical Chemistry (JSCC)
Yuzo Kayamori 1*, Yoshitaka Morishita 2, Hiroyuki Matsumoto 3, Naomichi Okitsu 4, Senji Kizawa 5, Satoshi Maeda 6, Shiori Masuda7, Takanori Yoshida 8,Masato Nasu 9, Masao Umemoto 10
and Yoshiaki Katayama 11
1.序 文
本 勧 告 法 は 血 清 中 の 総 コ レス テ ロ ー ル 濃 度 測 定 の 実 用 基 準 法(referencemethod)と し て 日本 臨 床 化 学 会 の 酵 素 ・試 薬 専 門 委 員 会 プ ロ ジ ェ ク ト[血清 コ レス テ ロ ー ル測 定 の 勧 告 法
「比 較 対 照 法 」 か ら 「実 用 基 準 法 」 へ の 移 行 に 関 す る研 究]に よ っ て 作 成 さ れ た 。
血 清 中 の 総 コ レ ス テ ロ ー ル は 高 脂 血 症 を 診 断 す る重 要 な 項 目 で あ り,近 年 増 加 し つ つ あ る 冠 動 脈 疾 患 を は じめ と す る 成 人 病 の リ ス ク フ ァ ク タ ー と して 広 く測 定 さ れ て い る1,2)。総
コ レス テ ロ ー ル(total cholesterol)は,そ の 治 療 指 標 と して 血 清 総 コ レス テ ロ ー ル 濃 度 を 含 め た ガ イ ドラ イ ン が 日本 動 脈 硬 化 学 会,高 脂 血 症 診 療 ガ イ ドラ イ ン検 討 委 員 会 に よ っ て 示 さ れ た3)。従 来 は高 コ レス テ ロ ー ル 血 症 の 診 断 基 準 と し て220mg/dLで あ っ た の に 対 し, 200〜240mg/dLを20mg/dLご と に危 険 因 子 の 有 無 を 考 慮 して,食 事 指 導 と薬 物 投 与 を含 む 治 療 に分 け る こ と が 提 案 さ れ た 。 こ の よ う な 状 況 の 下 で は 総 コ レ ス テ ロ ー ル 測 定 は 更 に 正 確 度 ・精 密 度 の 向 上 が 要 求 さ れ る。
測 定 法 に 関 し て は 最 近 の 遺 伝 子 組 換 え を 含
む バ イ オ テ ク ノ ロ ジ ー の 進 歩 や 酵 素 精 製 技 術 の 向 上 に よ っ て リ ポ タ ン パ ク か ら の エ ス テ ル 型 コ レ ス テ ロ ー ル と遊 離 型 コ レス テ ロ ー ル の 切 り出 し と そ れ に 続 く加 水 分 解 を 含 む 全 反 応 系 に酵 素 を利 用 す る 測 定 法 が ほ と ん ど の 日常 検 査 法 と し て 汎 用 さ れ て い る 。 こ れ ら の 方 法 の ほ と ん ど が コ レ ス テ ロ ー ル エ ス テ ラ ー ゼ (CE:EC3.1.1.13),コ レ ス テ ロ ー ル オ キ シ ダ ー ゼ(CO:EC1.1.3.6)及 び ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ(PO:EC1.11.1.7)を 用 い る 酵 素 的 測 定 法 で あ る4)。 しか し,こ の 方 法 は コ レス テ ロ ー ル を 過 酸 化 水 素 に 導 き測 定 す る こ とか ら血 清 中 の 還 元 物 質 に よ る 負 誤 差 が 生 じ る 等 の 幾 つ か の 問 題 点 が 指 摘 され て い る56)。
米 国 で はFramingham Studyに 代 表 さ れ る 広 範 な 疫 学 調 査 に よ っ て,コ レス テ ロ ー ル の 冠 動 脈 疾 患 の リ ス ク フ ァ ク タ ー と し て の 重 要 性 か ら,国 内 す べ て の コ レ ス テ ロ ー ル 測 定 施 設 で 正 確 な 測 定 値 が 得 ら れ る よ う に 国 家 的 な コ レ ス テ ロ ー ル 測 定 体 系
(National Reference System for Cholesterol; NRS/Chol)
が確 立 され て い る 。 こ れ に よ る と,も っ と も正 確 度 の 高 い方 法 の 絶対 基準 法
(definitive method)
は,同 位 体希 釈 質量 分析 法 (isotope dilutionmass-spectrometry , ID-MS) 7)
で あ る と してい る 。 ま た,こ の 下 位 に 位 置 す る 実 用 基 準 法
(reference method)
はCenters for DiseaseControl and Prevention (CDC)
の標 準 的測 定 法 で あ るmodified Abell-Levy-Brodie-Kendall (ALBK)法8‑9)で あ る と規 定 し て い る 。 各 方 法 間 の 正 確 性 の伝 達 に は,各 々 一 次 標 準 物 質 と し てNational Institute of Standards andTechnology (NIST) ‚Ì Standard Reference
Material (SRM) 911b
が,二 次 標 準 物 質 と し て の 血 清 標 準 物 質 は,SRM909bあ る い は SRM1952aが,ま た,日 本 で はJC・CRM211が そ れ ぞ れ 利 用 さ れ て い る 。 そ して こ のCDCに よ るALBK法 を基 準 と して,各 施 設 の 酵 素 法 を は じめ と す る 日常 法 に 正 確 性 を伝 達 す る と い う 体 系 で あ る 。 こ の 測 定 体 系 に基 づ い て 日常 検 査 や 疫 学 的 調 査 に 利 用 す る フ ィ ー ル ドへ の 応 用 が 図 ら れ,総 コ レス テ ロ ー ル 測 定 値 の 正 確 性 を 確 保 す る こ とが 行 わ れ て い る 。 こ の 米国 で の 総 コ レ ス テ ロ ー ル 測 定 体 系NRS/Chol は,検 査 施 設(clinical laboratory)の た め の 国 家 的 測 定 体 系 の 一 部 と し て 組 織 さ れ て お り,
国家機 関
(CDC, NIST, FDA (Food and Drug Administration) , NIH (National Institute of
Health〕 な ど,試 薬 メ ー カ ー,臨 床 検 査 団 体 ・
医 療 機 関 [ CAP ( College of American Pathologists) ,ア メ リカ臨床 病理学 者 の会]な
ど の 協 調 体 制 を と っ て い る 。 さ ら に,こ れ ら の シ ス テ ム に 則 りCDCのCholesterol
Reference Method Laboratory Network (CRMLN)は 世 界 的 な 脂 質 測 定 値 の 統 一 化 を
目的 と し て 疫 学 の 研 究 施 設,試 薬 を 製 造 す る 試 薬 メ ー カ ー な ど を 通 し て デ ー タ の 精 密 性, 正 確 性 を 実 際 に 測 定 す る現 場 へ も た らす 活 動 を 行 っ て い る10)。本 勧 告 法 は こ れ ら総 コ レス テ ロ ー ル 測 定 値 の 世 界 的 な デ ー タ統 一 化 活 動 に 調 和 す べ く,し か もCDC法 と比 較 し て 精 密 性,正 確 性 が 優 劣 の な い 我 が 国 独 自 の 測 定 法 を 構 築 し,総 コ レ ス テ ロ ー ル 測 定 値 の 施 設 問 差 是 正 と精 密 度,正 確 度 を更 に高 め る た め の 測 定 体 系 を 明 確 に す る こ と,そ し て こ の 目 的 の た め に 測 定 法 を ア ル コ ー ル性 ア ル カ リ溶 液 に よ る 加 水 分 解 操 作 を組 み 合 わ せ た 酵 素 反 応 を指 示 反 応 系 とす る測 定 原 理11‑12)を 実 用 基 準 法 と して 提 示 す る も の で あ る13‑16)。
2.略 号
ALBK : Abell-Levy-Brodie-Kendall ATP 2Na : Adenosine-5'-triphosphate,
disodium salt
CD : Cholesterol dehydrogenase(
コ レ ス テ ロ ール脱水 素酵 素), EC No. not certified
CDC : Centers for Disease Control and Prevention
CE : Cholesterol esterase (コ レ ス テ ロ ー ル エ ス テ ラ ー ゼ) , EC 3.1.1.13, Steryl-ester acylhydrolase
CO : Cholesterol oxidase (コ レ ス テ ロ ー ル オ キ シ ダ ー ゼ), EC 1.1.3.6, Cholesterol: oxygen oxidoreductase
臨 床 化 学 第35巻 第4号2006年11月 391
CRMLN : Cholesterol Reference Method Laboratory Network
DM : n-Dodecyl- p -D-maltopyranoside
EDTA¥Na¥H2O : Ethylenediamine-N, N, N', N'- tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate
G6PD : Glucose-6-phosphate dehydrogenase
(グ ル コ ー ス 昏 リ ン 酸 脱 水 素 酵 素),EC1.1.1.49,
D-Glucose-6-phosphate: NADP+ 1-oxidoreductase HEPES : 2- [4- (2-Hydroxyethyl) -1-pipe-
razinyl] ethanesulfonic acid
HK:Hexokinase(ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ),EC2.7.1.1, ATP: D-hexose-6-phosphotransferase
NAD : ƒÀ -Nicotinamide-adenine dinucleotide;
oxidized form
NADP : ƒÀ -Nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate : oxidized form
NADH : ƒÀ -Nicotinamide-adenine dinucleotide reduced form
NADPH : ƒÀ -Nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate reduced form
NIST : National Institute of Standards and Technology
NTA : Nitrilotriacetic acid
PO:Peroxidase(ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ),EC 1.11.1.7,
Donor: hydrogen-peroxide oxidoreductase SRM : Standard Reference Material
TC:Total cholesterol(総 コ レ ス テ ロ ー ル)
3． 適 用 範 囲
本 勧 告 法 は 実 用 基 準 法(referencemethod) と して,臨 床 検 査 の 日常 検 査 法 に よ る 血 清 中 総 コ レス テ ロ ー ル 測 定 値 の 正 確 性 の 確 認 や 評 価,日 常 検 査 法 に使 用 す るTC測 定 試 薬 の 検 量 用 試 料(キ ャ リ ブ レー タ)お よ び 精 度 管 理 調 査(サ ー ベ イ ラ ンス)試 料,精 度 管 理 試 料 等 の 値 付 け に 用 い る もの で あ る 。
な お,本 勧 告 法 でSI単 位 に対 す る トレ ーサ ビ リ テ ィ を と る に は,上 位 の 実 用 血 清 標 準 物 質 (二 次 標 準 物 質)で 校 正 す る 。
4.測 足 原 理
本 法 は 血 清 中 の 総 コ レス テ ロ ー ル と して エ ス テ ル 型 コ レ ス テ ロ ー ル と 遊 離 型 コ レ ス テ ロ ー ル を測 定 す る 。
こ の 項 で は 総 コ レ ス テ ロ ー ル の 略 号 と して TCを 使 用 す る 。
試 料 中 の エ ス テ ル 型 コ レ ス テ ロ ー ル は ア ル コ ー ル 性 ア ル カ リ溶 液(KOH)の 作 用 に よ り
リポ タ ンパ ク 質 か ら のTCの 切 り出 しに 続 い て, TCが コ レス テ ロ ー ル と脂 肪 酸 に 加 水 分 解 され る 。 次 い で,第 二 反 応 と してCD17)の 作 用 に よ り,補 酵 素 で あ るNADの 存 在 下 で コ レ ス テ ロ ー ル を 酸 化 し て △‑4‑コ レ ス テ ン‑3‑オ ン と NADHを 生 成 す る 。 生 成 す るNADHの340nm に お け る 吸 光 度 上 昇 量 を測 定 す る こ と に よ り 試 料 中 のTC濃 度 を 算 出 す る(CD‑UV法)。 こ のCDの 反 応 は 可 逆 反 応 を示 す こ と か ら試 料 中 の コ レ ス テ ロ ー ル 量 に 応 じ た 等 モ ル のNADH
を生 成 させ る こ と が で き な い 。 そ こで 生 成 す る 基 質 の △‑4‑コ レス テ ン‑3‑オ ン の3β 位 の ケ ト基 に ヒ ドラ ジ ン を付 加18)す る こ と で △‑4‑
コ レス テ ン‑3−オ ン をCDに 対 し て 非 基 質 化 し, NADか らNADHを 生 成 す る 方 向 に 反 応 方 向 を 変 化 さ せ た 。 こ れ に よ り試 料 中 の コ レ ス テ ロ ー ル を全 て 消 費 し,等 モ ル のNADHを 生 成 させ る こ とが で き る よ う に な っ た19‑23)。測 定 原 理 は 図1に 示 す よ う に,化 学 的 加 水 分 解 を共 役 させ た 酵 素 的 測 定 法 で あ る 。
5.試 薬 の 規 格 お よ び 調 製 法
表1に 本 測 定 法 に 用 い る 試 薬 の 規 格 を示 す 。 ま た,調 製 法 に つ い て以 下 に示 す 。
5.1全 般 的 な 注 意 事 項
調 製 及 び 保 存 用 容 器 に は,清 浄 な ガ ラ ス 製 ビ ー カ ー を用 い て 調 製 し,保 存 に は 密 栓 で き る容 器 を使 用 す る 。 ま た,試 薬 調 製 に お い て 特 に 規 定 し な い か ぎ り,組 成 物 を 溶 解 す る と き は マ グ ネ チ ッ ク ス タ ー ラ ー 等 で ゆ っ く り撹 拌 しな が ら溶 解 す る 。
図1測 定原 理
表1試 薬組成 物の規格
臨 床 化 学 第35巻 第4号2006年11月 393
5.2測 定 用 試 薬 の調 製 法 (1)第 一 試 薬
① 調 製 容 器(1000mL以 上 調 製 可 能 な 容 器) に800mLの 精 製 水 を 採 取 して 水 酸 化 カ リ ウ ム11.8gを 加 え,溶 解 し,冷 蔵 庫 ま た は氷 中 で 室 温 まで 冷 却 後,HEPES23.89を 加 え, 溶 解 す る 。 次 に② か ら⑤ の 試 薬 類 を 順 次 溶 解 して か ら加 え る 。
② 二 塩 化 ヒ ドラ ジ ニ ウ ム7.0gを 加 え,溶 解 す る 。
③EDTA・2Na0.37gを 加 え,溶 解 す る 。
④Triton(R)X‑100を6.0g加 え,溶 解 す る 。 Triton(R)X‑100は 粘 性 が 高 い た め採 取 器 具 に 付 着 す る 。 付 着 し たTriton(R)X‑100を 調 製 液 ま た は 精 製 水 で よ く洗 い 流 して完 全 に 溶 解 す る 。
⑤ デ オ キ シ コ ー ル 酸 ナ ト リ ウ ム2.Ogを 加 え, 溶 解 す る。
⑥pH8.0(25℃)で あ る こ と を確 認 す る 。pH を微 調 整 す る場 合 は,1mol/L水 酸 化 カ リ ウ ム 溶 液 ま た は1mol/L塩 酸 溶 液 を用 い る 。 pH8.0を 下 回 らな い よ う に 注 意 す る 。
⑦ 調 製 液 に精 製 水 を加 え て,全 量 を1000mL とす る 。
⑧ 調 製 液1000mLを 冷 蔵 庫 また は氷 中 で 冷 却 す る 。 冷 却 後,NAD3.879を 加 え,溶 解 す る 。
⑨ ① 〜 ⑧ の 手 順 で 調 製 し た調 製 液 を第 一 試 薬 とす る 。
⑩ 本 試 薬 は,密 栓 し て 冷 蔵 保 存(10℃ 以 下) す る 。
(2)第 二 試 薬
① 調 製 容 器 に700mLの 精 製 水 を採 取 し て 水 酸 化 カ リ ウ ム5.0gを 加 え,溶 解 し,冷 蔵 庫 ま た は 氷 中 で 室 温 ま で 冷 却 後,HEPES23.8g を加 え,溶 解 す る 。 次 に② か ら④ の 試 薬 類 を順 次 溶 解 して か ら加 え る 。
②NTA0.76gを 加 え,溶 解 す る 。
③ コ ー ル 酸 ナ トリウ ム3.0gを 加 え,溶 解 す る。
④DM5.1gを 加 え,溶 解 す る。
⑤pH8.0(25℃)で あ る こ と を確 認 す る 。pH を微 調 整 す る場 合 は,1mol/L水 酸 化 カ リ ウ ム 溶 液 ま た は1mol/L塩 酸 溶 液 を用 い る 。
⑥ 調 製 液 を冷 蔵 庫 ま た は 氷 中 で 冷 却 す る 。 冷 却 後,ク リ ス タ リ ン1.0gを 調 製 液 の 液 面 に 浮 か し て 撹 拌 な ど は 行 わ ず 静 置 溶 解 す る 。 完 全 に溶 解 後,マ グ ネ チ ッ ク ス タ ー ラ ー等
で ゆ っ く り撹 拌 し,一 様 に な る よ う に 混 和 す る 。
⑦ 調 製 液 に精 製 水 を 加 え て,全 量 を1000mL とす る 。
⑧ 調 製 液500mLを 別 の調 製 液 に採 り,冷 蔵 庫 ま た は 氷 中 で 冷 却 す る 。 冷 却 後,CD8.5 KUを 調 製 液 の 液 面 に 浮 か して 撹 拌 な ど は 行 わ ず 静 置 溶 解 す る 。 完 全 に溶 解 後,マ グ ネ チ ッ ク ス タ ー ラ ー 等 で ゆ っ く り撹 拌 し, 一 様 に な る よ う に 混 和 す る
。
⑨ ① 〜 ⑧ の 手 順 で 調 製 した 調 製 液 を 第 二 試 薬 と す る。
(3)ブ ラ ン ク 反 応 に 用 い る 第 一 試 薬 前 記,第 一 試 薬 を そ の ま ま使 用 す る 。 (4)ブ ラ ン ク反 応 に 用 い る 第 二 試 薬(第 三 試 薬)
前 記,第 二 試 薬 の 調 製 工 程'の 調 製 液 を そ の ま ま 使 用 す る 。 本 溶 液 を ブ ラ ン ク 反 応 に 用 い る 第 二 試 薬(第 三 試 薬)と す る 。
(5)ア ル カ リ加 水 分 解 用0.35Nア ル コ ー ル 性 KOH溶 液
エ タ ノ ー ル400mLを 採 取 し て水 酸 化 カ リ ウ ム11.559を 加 え,溶 解 す る(純 度85%と して 算 出)。 室 温 に 冷 却 後,エ タ ノ ー ル を加 え て,全 量 を500mLに す る 。 な お,本 溶 液 は 用 時 調 製 と す る 。
(6)ア ル カ リ加 水 分 解 用 ブ ラ ンク試 薬 イ ソ プ ロ ピ ル ァ ル コ ー ル を そ の ま ま 使 用 す
る 。
(7)一 次 標 準 物 質 及 び 標 準 液
コ レス テ ロ ー ル の 標 準 物 質 は 純 度 検 定 さ れ た もの がNISTか ら入 手 す る こ とが で き る た め, 一 次 標 準 物 質 と し て の コ レ ス テ ロ ー ル は
, NISTSRM911bコ レス テ ロ ー ル(純 度99.8%) が 適 して い る。
入 手 した コ レス テ ロ ー ル を室 温 に戻 し,デ シ ケ ー タ ー 中 に24時 間 保 存 し て 乾 燥 後,密 栓 が で き る100mLメ ス フ ラ ス コ 内 に 正 確 に100, 200,300,400mgを 秤 量 し,予 め 少 量 の イ ソ プ
図2測 定操作法(加 水分解操作)
表2基 本操 作法 指示反応系基本操作法
ASs､ASbは 試 料 に お ける各 々 総 反 応 と検 体 ブ ラン クを 、ASts､ASbは 一 次 検 量 用 物 質 に お け る各 々総 反 応 と検 体 ブラ ン ク、ACs,ACbは コン トロー ル に お け る各 々 総 反 応 と検 体 ブ ランクを示 す 。また 、AR2b、AR3b は各 々本 反 応 とブ ランク反 応 の 試 薬 ブ ランクを示 す｡
ロ ピ ル ア ル コ ー ル で 溶 解 後,イ ソ プ ロ ピル ア ル コ ー ル で 正 確 に100mLと す る 。 溶 解 後 は ス ク リ ュ ー キ ャ ッ プ 付 きの 容 器 に 入 れ 密 栓 して 4℃ の 冷 蔵 庫 に保 管 す る 。 こ の 標 準 液 は,6ヶ
月 程 度 で 再 調 製 す る 。 ま た,界 面 活 性 剤(例 え ば,TritonX‑100)と イ ソ プ ロ ピ ル ア ル コ ー ル で 溶 解 した 試 料 も 同様 に 使 用 可 能 で あ る。
6.基 本 操作 法および試薬組成
6.1基 本 操 作 法 軌11‑12)
基 本 操 作 法 に つ い て 加 水 分 解 ・抽 出 ・蒸 発 乾 固 の 操 作 を 図2に,指 示 反 応 系 操 作 を表2に 示 した 。 以 下,基 本 操 作 につ い て 詳 細 を示 す 。
臨床 化学 第35巻 第4号2006年11月 395
6.1.1加 水 分 解 操 作
試 料500μLと0.35Nア ル コ ー ル性KOH5mL を加 え混 和 後,50℃,60分 間 加 温 す る 。 そ の 後, 冷 却 し精 製 水5mL,n‑ヘ キ サ ン10mLを 加 え, 加 水 分 解 物 を ヘ キ サ ン 層 に 抽 出 す る 。 次 に, こ の2mLを 正 確 に 試 験 管 に分 取 し,蒸 発 乾 固 す る。
6。112指 示 反 応 操 作
「6.1.1加 水 分 解 操 作 」 で 試 料 あ る い は 標 準 液,コ ン ト ロ ー ル の 蒸 発 乾 固 し た試 料 に つ い て0.5葛nLの イ ソ プ ロ ピ ル ア ル コ ー ル を加 え,溶 解 す る 。 次 に,こ の 溶 解 した 試 料0.15mLを 正 確 に別 々 に2本 の試 験 管 に取 る 。 次 に,各 々 に 第 一 試 薬3mLを 加 え10分 間37℃ で 加 温 す る 。 そ の後,各 々 の 試 験 管 に第 二 試 薬(CDが 入 っ て い る試 薬)と 第 三 試 薬(CDが 入 っ て い な い ブ ラ ンク用 試 薬)を 各1mLを 加 え15分 間37℃ で 加 温 す る 。 セ ル キ ュ ベ ッ トに 各 々 の 反 応 液 を 入 れ,37℃ に 保 っ た ま ま 各 々 の 吸 光 度 を340 nmで 測 定 す る 。 各 々試 料 の 吸 光 度(ASs),標 準 液 の吸 光 度(ASts),コ ン トロ ー ル の 吸 光 度 (ACs)並 び に 第 二 試 薬 の 代 わ りに 第 三 試 薬 を 用 い て 同 様 に 操 作 した 各 々 の ブ ラ ン ク 反 応 で あ る 試 料 の 吸 光 度(ASb),標 準 液 の 吸 光 度 (AStb),コ ン トロー ル の 吸 光 度(ACb)と す る 。 第 二 試 薬,第 三 試 薬 の 試 薬 ブ ラ ン ク と し て イ
ソ プ ロ ピ ル ア ル コ ー ル を用 い て 同様 に 操 作 し
て,吸 光 度 を測 定 す る(AR2b,AR3b)。 以 下 の
「標 準 液 を用 い た 場 合 の 計 算 方 法 」 に 従 い,総 コ レ ス テ ロ ー ル濃 度 を 算 出 す る 。
標 準 液 を用 い た場 合 の 計 算 方 法
各 濃 度(0,100,200,300,400mg/dL)の 標 準 物 質 の 濃 度(x)と 吸 光 度 変 化 量(y)を も と に 最 小 二 乗 法 に よ り求 め ら れ る 回帰 式 の(x)に 試 料 の 吸 光 度 を代 入 し,計 算 に よ り濃 度(y)
を求 め る 。
具 体 的 な計 算 方 法 は,本 勧 告 法 解 説 書 の 図4 に 示 す 。
6.2試 薬 組 成 お よび 終 濃 度
試 薬 組 成 お よび 終 濃 度 を表3に 示 す 。
7.測 定 機器 の性 能
7.1分 光 光 度 計
下 記 に示 す 日本 臨床 化 学 会 教 育 委 員 会 及 び 日 本 臨 床 化 学 会 機 器 専 門 委 員 会,「 臨 床 検 査 室 に お け る 機 器 試 験 法 マ ニ ュ ア ル 」(リ フ ァ レ ンス 法 の 開 発 ・検 討 用 分 光 光 度 計 の 性 能 規 格)24)
に 準 じ る 。 ま た,測 定 温 度 は,37±0.5℃ 内 の 恒 温 に セ ッ トす る(表4)。
表3試 薬組成および 終濃度
表4分 光光度計 の性能 (1)分光光度計
7.2分 注 あ る い は分 取 に必 要 な デ ィ ス ペ ン サｰな ど
本 勧 告 法 は ア ル コ ー ル 性 ア ル カ リ溶 液 を 利 用 す る加 水 分 解 操 作 と加 水 分 解 物 で あ る コ レ ス テ ロ ー ル をn‑ヘ キ サ ン に よ っ て 抽 出,そ して 蒸 発 乾 固 しCDに よ る指 示 反 応 系 に よ っ て測 定 す る 方 法 で あ る 。
有 機 溶 媒 を 定 量 的 にサ ン プ リ ン グ す る 必 要 性 か ら,そ の 分 注 あ る い は 分 取 に は 細 心 の 注 意 を 注 ぐ必 要 が あ る 。 本 勧 告 法 で の 一 連 の 加 水 分 解 ・抽 出 操 作 定 量 性 に 決 定 的 に 影 響 す る 部 分 は① 試 料500μLを 採 取 す る 部 分,② 加 水
分 解 物 の 抽 出 の た め に加 え るn‑ヘ キ サ ン10mL の 添 加,③ 一 定 量 の 抽 出 物 の 分 取 で あ り,大 き
くは こ の3つ の 操 作 で あ る 。 こ の 加 水 分 解 物 の 定 量 操 作 に耐 え 得 る 装 置 の 精 度 の 基 準 は 同 じ 原 理 を採 用 し て い るCDCの 検 定 基 準 を 引 用 し, 目 的 とす る 容 量 に対 して 相 対 標 準 偏 差0.3%以 内 と し た 。 ま た,指 示 反 応 系 に お け る 酵 素 試 薬 の 分 注 精 度 は 相 対 標 準 偏 差1.0%以 内 と した 。
臨床化 学 第35巻 第4号2006年11月 397
8.使 用 器 具 の規 格
8.1使 用 器 具 の規 格
1.0mL及 び3.0mL用 ホ ー ル ピペ ッ ト,100mL 用 メ ス フ ラ ス コ(例:岩 城 硝 子(株)社 製,PYREX)
及 び0.5mLあ るい は0.15mL用 マ イ ク ロ シ リ ン ジ(例:HAMILTONCO.,USA,MICROLITER
#710)は,JIS規 格 適 合 品(例:エ ッペ ン ドル フ ピペ ッ トな ど),デ ィス ペ ンサ ー を使 用 す る 。 8.2器 具 類 の 検 定
使 用 す る ホ ー ル ピペ ッ ト及 び マ イ ク ロ シ リ ンジ,デ ィ ス ペ ンサ ー 等 は,以 下 の 操 作 で検 定 した 物 を使 用 す る 。
① 各 ホ ー ル ピペ ッ トあ る い は マ イ ク ロ シ リ ン ジ を用 い て,精 製 水 を規 定 量 採 取 す る 。
② 清 浄 な 秤 量 瓶(1.0mL及 び3.0mL用 ホ ー ル ピペ ッ ト検 定 の 場 合 は20〜50mL用 ビ ー カ ー を使 用 す る)に 精 製 水 の 蒸 発 を 防 ぐ た め に 必 要 に 応 じて 流 動 パ ラ フ ィ ン を 約1.0 mL加 え て か ら使 用 す る。
③ 各 容 量 を電 子 天 秤(例:研 精 工 業(株),ER‑
182,d=0.1mg)で10回 秤 量 し,そ の 平 均 値 を 各 器 具 の検 定 値(mL)と す る。
9.実 施 に あ た っ て の 注 意 事 項
本 法 は 用 手 法 に よ り ア ル コ ー ル 性 ア ル カ リ 溶 液 に よ る エ ス テ ル 型 コ レス テ ロ ー ル の 化 学 的 加 水 分 解 と指 示 反 応 系 を 酵 素 的 に よ っ て 反 応 させ る 方 法 で あ る 。 操 作 中 で 厳 密 に 行 う必 要 が あ り,ば らつ きの 原 因 の 大 きな 部 分 は 加 水 分 解 に お け る① 試 料(500μL)と ア ル コ ー ル 性KOH(5.0mL)の 採 取,② 抽 出 に用 い る n‑ヘ キ サ ン(10mL)の 添 加 量,③ 抽 出 した ヘ
キ サ ン 層 か ら のn一ヘ キ サ ン の 分 取(2mL), さ ら に指 示 反 応 系 操 作 に お け る,④ 蒸 発 乾 固 物 の 溶 解 量(0.50mL),⑤ 溶 解 物 の サ ン プ リ ン グ(0.15mL),⑥ 第 一 試 薬(3.0)mL)と 第 二 試 薬(1.0mL)の サ ン プ リ ン グ で あ る 。 そ の た め 本 法 を実 施 す る に 当 た っ て は,使 用 す る 定 量 器 具 の 検 定 を 行 い,用 手 法 に お け る 手 技 で200mg/dL(5.17mmol/L)前 後 のTC値 の 試 料 を10回 測 定 し た場 合 で 変 動 係 数 が1.0%以
下 に な る ま で 本 操 作 法 に慣 れ て か ら測 定 を 開 始 す る。
な お,本 法 でSI単 位 に 対 す る トレ ー サ ビ リ テ ィ を と る に は,上 位 の 実 用 血 清 標 準 物 質
(二 次 標 準 物 質)で 校 正 す る 。
■ 文 献
1)山 本 章(編 著):血 清 脂 質 一 そ の 臨 床,基 礎,分 析 法 ―,「高 脂血 症 」p.33‑49,中外 医 学社(東 京),1981.
2)原 一 郎,植 田伸 夫,赤 沼 保 夫(編):血 漿 リ ポ タ ン パ ク,「動 脈 硬 化 と リポ タ ンパ ク代 謝 」p.314‑344,講 談 社(東 京),1983.
3)日 本 動 脈 硬 化 学 会 高 脂 血 症 診 療 ガ イ ドラ イ ン検 討 委 員 会:高 脂 血 症 診 療 ガ イ ドラ イ ン,動 脈 硬 化, 25(1・2):1‑34,1997㌃
4) Allain CC, Poon LS, Chan CSG, Richmond W, Fu PC: Enzymatic determination of total cholesterol in serum. Clin Chem, 20(4) : 470-475,1974.
5)北 村 元 仕,仁 科 甫 啓:実 践 臨床 化 学(増 補 版):
545‑565,医 歯 薬 出 版(東 京),1982.
6) Artiss JD, Zak B: Measurement of Cholesterol Concentration. In: Rafai N, Warnick R, Dominiczak MH eds. Handbook of lipoprotein testing, 2nd ed. Washington DC: AACC Press, 2000:189-205.
7) Ellerbe P, Meiselman S, Sniegoski LT, Welch MJ, White VE: Determination of Serum Cholesterol by a Modification of the Isotopoe Dilution Mass
Spectrometric Definitive Method, Anal Chem, 61:
1718-1723, 1989.
8) Duncan IW, Mather A, Cooper GR: The Procedure for The proposed Cholesterol Reference Method:
Atlanta, GA, Centers for Disease Control, 1982.
9) Cooper GR, Smith SJ, Duncan IW, Mather A, Fellows WD, Foley T, Frantz IDJr, Gill JB, Grooms TA, Hynie I, Laessig R, LoBasso FA, Martin J, Naito H, Newman HA, Sideman L, Turner JH, Williams D: Interlaboratory Testing of The Transferability of A Candidate Reference Method for Total Cholesterol in Serum, Clin, Chem 32:
921-929, 1986.
10) Etheridge SF, Waynack PP: The cholesterol reference method. Centers for Disease Control and Prevention, 1994:1-24.
11)栢 森裕 三,片 山善 章,吉 田隆 則,増 田 詩織,森 下 芳 孝:
ア ル カ リ加 水 分 解 を 共 役 させ た コ レス テ ロー ル脱 水 素 酵 素 一UV法 に よ る 血 清 総 コ レス テ ロ ー ル 測 定
法,臨 床 化 学,27(Supp.3):67c,1998.
12) Kayamori Y, Katayama Y, Yoshida T, Masuda S,
8.使 用 器 具 の規 格
8.1使 用 器 具 の規 格
1.OmL及 び3.OmL用 ホ ー ル ピペ ッ ト,100mL 用 メ ス フ ラ ス コ(例:岩 城 硝 子(株)社 製,PYREX)
及 び0.5mLあ るい は0.15mL用 マ イ ク ロ シ リ ン ジ(例:HAMILTONCO.,USA,MICROLITER
#710)は,JIS規 格 適 合 品(例:エ ッペ ン ドル フ ピペ ッ トな ど),デ ィス ペ ンサ ー を使 用 す る 。 8.2器 具 類 の 検 定
使 用 す る ホ ー ル ピペ ッ ト及 び マ イ ク ロ シ リ ンジ,デ ィ ス ペ ンサ ー 等 は,以 下 の 操 作 で検 定 した 物 を使 用 す る 。
① 各 ホ ー ル ピペ ッ トあ る い は マ イ ク ロ シ リ ン ジ を用 い て,精 製 水 を規 定 量 採 取 す る 。
② 清 浄 な 秤 量 瓶(1.OmL及 び3.OmL用 ホ ー ル ピペ ッ ト検 定 の 場 合 は20〜50mL用 ビ ー カ ー を使 用 す る)に 精 製 水 の 蒸 発 を 防 ぐ た め に 必 要 に 応 じて 流 動 パ ラ フ ィ ン を 約1.O mL加 え て か ら使 用 す る。
③ 各 容 量 を電 子 天 秤(例:研 精 工 業(株),ER‑
182,dニ0.1mg)で10回 秤 量 し,そ の 平 均 値 を 各 器 具 の検 定 値(mL)と す る。
9.実 施 に あ た っ て の 注 意 事 項
本 法 は 用 手 法 に よ り ア ル コ ー ル 性 ア ル カ リ 溶 液 に よ る エ ス テ ル 型 コ レス テ ロ ー ル の 化 学 的 加 水 分 解 と指 示 反 応 系 を 酵 素 的 に よ っ て 反 応 させ る 方 法 で あ る 。 操 作 中 で 厳 密 に 行 う必 要 が あ り,ば らつ きの 原 因 の 大 きな 部 分 は 加 水 分 解 に お け る① 試 料(500μL)と ア ル コ ー ル 性KOH(5.OmL)の 採 取,② 抽 出 に用 い る n‑ヘ キ サ ン(10mL)の 添 加 量,③ 抽 出 した ヘ
キ サ ン 層 か ら のn一ヘ キ サ ン の 分 取(2mL), さ ら に指 示 反 応 系 操 作 に お け る,④ 蒸 発 乾 固 物 の 溶 解 量(0.50mL),⑤ 溶 解 物 の サ ン プ リ ン グ(0.15mL),⑥ 第 一 試 薬(30)mL)と 第 二 試 薬(1.OmL)の サ ン プ リ ン グ で あ る 。 そ の た め 本 法 を実 施 す る に 当 た っ て は,使 用 す る 定 量 器 具 の 検 定 を 行 い,用 手 法 に お け る 手 技 で200mg/dL(5.17mmol/L)前 後 のTC値 の 試 料 を10回 測 定 し た場 合 で 変 動 係 数 が1.0%以
下 に な る ま で 本 操 作 法 に慣 れ て か ら測 定 を 開 始 す る。
な お,本 法 でSI単 位 に 対 す る トレ ー サ ビ リ テ ィ を と る に は,上 位 の 実 用 血 清 標 準 物 質
(二 次 標 準 物 質)で 校 正 す る 。
■ 文 献
1)山 本 章(編 著):血 清 脂 質 一 そ の 臨 床,基 礎,分 析 法 ―,「高 脂血 症 」p.33‑49,中外 医 学社(東 京),1981.
2)原 一 郎,植 田伸 夫,赤 沼 保 夫(編):血 漿 リ ポ タ ン パ ク,「動 脈 硬 化 と リポ タ ンパ ク代 謝 」p.314‑344,講 談 社(東 京),1983.
3)日 本 動 脈 硬 化 学 会 高 脂 血 症 診 療 ガ イ ドラ イ ン検 討 委 員 会:高 脂 血 症 診 療 ガ イ ドラ イ ン,動 脈 硬 化, 25(1・2):1‑34,1997㌃
4) Allain CC, Poon LS, Chan CSG, Richmond W, Fu PC: Enzymatic determination of total cholesterol in serum. Clin Chem, 20(4) : 470-475,1974.
5)北 村 元 仕,仁 科 甫 啓:実 践 臨床 化 学(増 補 版):
545‑565,医 歯 薬 出 版(東 京),1982.
6) Artiss JD, Zak B: Measurement of Cholesterol Concentration. In: Rafai N, Warnick R, Dominiczak MH eds. Handbook of lipoprotein testing, 2nd ed. Washington DC: AACC Press, 2000:189-205.
7) Ellerbe P, Meiselman S, Sniegoski LT, Welch MJ, White VE: Determination of Serum Cholesterol by a Modification of the Isotopoe Dilution Mass
Spectrometric Definitive Method, Anal Chem, 61:
1718-1723, 1989.
8) Duncan IW, Mather A, Cooper GR: The Procedure for The proposed Cholesterol Reference Method:
Atlanta, GA, Centers for Disease Control, 1982.
9) Cooper GR, Smith SJ, Duncan IW, Mather A, Fellows WD, Foley T, Frantz IDJr, Gill JB, Grooms TA, Hynie I, Laessig R, LoBasso FA, Martin J, Naito H, Newman HA, Sideman L, Turner JH, Williams D: Interlaboratory Testing of The Transferability of A Candidate Reference Method for Total Cholesterol in Serum, Clin, Chem 32:
921-929, 1986.
10) Etheridge SF, Waynack PP: The cholesterol reference method. Centers for Disease Control and Prevention, 1994:1-24.
11)栢 森裕 三,片 山善 章,吉 田隆 則,増 田 詩織,森 下 芳 孝:
ア ル カ リ加 水 分 解 を 共 役 させ た コ レス テ ロー ル脱 水 素 酵 素‑UV法 に よ る 血 清 総 コ レス テ ロ ー ル 測 定
法,臨 床 化 学,27(Supp.3):67c,1998.
12) Kayamori Y, Katayama Y, Yoshida T, Masuda S,
Morishita Y: Cholesterol dehydrogenase- ultraviolet method for assaying total cholesterol in serum coupled with alkali saponification, Clin Chem Lab Med, 37: S263, 1999.
13)日 本 臨 床 化 学 会 分 析 部 会 近 畿 支 部 試 薬 委 員 会:総 コ レ ス テ ロ ー ル測 定 法 の 標 準 化 ― コ レス テ ロ ー ル エ ス テ ラ ー ゼ水 解 の妥 当性 ―,第6回 日本 臨 床 化 学 会 夏 期 セミナー資 料 集:18‑23,1986.
14)辻 岡 直 良,栢 森 裕 三,片 山 善 章,岸 浩 司,渡 津 吉 史:コ レス テ ロ ー ル 脱 水 素 酵 素 一UVエ ン ドポ イ ン
ト法 を利 用 した 血 清 コ レス テ ロ ー ル 測 定 法 一反 応 生 成 物 コ レ ス テ ノ ン の 捕 捉 効 果 一.臨 床 化 学,21(Supp.2):131b,1992.
15)松 本 祐 之,森 下 芳 孝,中 根 清 司,深 津 俊 明:コ レ ス テ ロ ー ル デ ヒ ドロ ゲ ナ ー ゼUV法 に よ る実 用 基 準 法 を指 向 して,臨 床 化 学,25(Supp.2):6‑7,1996.
16)日 本 臨 床 化 学 会:ヒ ト血 清 コ レス テ ロー ル 測 定 の 勧 告 法‑実 試 料 の 測 定 値 を評 価 す るた め の 比 較 対 照 法‑,臨 床 化 学,30:189‑216,2001.
17) Kishi K, Watazu Y, Katayama Y, Okabe H:
Characteristic and applies of recombinant cholesterol dehydrogenase, Biosci Biotechnol Biochem, 64(7) :1352-1358, 2000.
18) Dutcher JD, Wintersteiner O: Studies on the Wolff-Kishner Reduction of Steroid Ketones, J Am Chem Soc, 61: 1992-2000: 1939.
19)松 本 祐 之,森 下 芳 孝,深 津 俊 明:コ レ ス テ ロ ー ル デ ヒ ド ロ ゲ ナ ー ゼ ―UV法,臨 床 検 査,41(9),1033‑
1038,1997.
20) Kayamori Y, Hatsuyama H, Tsujioka T, Nasu M, Katayama Y, Matsuyama T: An endpoint colorimetric method for assaying total cholesterol in serum with cholesterol dehydrogenase, Clin Chem, 43(6) : S263, 1997.
21)池 田 昌 郁,渡 津 吉 史:NAD(P)H定 量 法,臨 床 検 査, 41(9):989‑993,1997.
22)辻 岡 直 良,初 山 弘 幸,栢 森 裕 三,片 山 善 章:コ レ ス テ ロ ー ル 脱 水 素 酵 素 紫 外 部 エ ン ドポ イ ン ト法 を 利 用 し た 血 清 総 コ レ ス テ ロ ー ル 測 定 法 の 開 発,生 物 試 料 分 析,21(4):249‑256,1998.
23) Kayamori Y, Hatsuyama H, Tsujioka T, Nasu M, Katayama Y: Endpoint colorimetric method for assaying total cholesterol in serum with cholesterol dehydrogenase, Clin Chem, 45(12) : 2158-2163, 1999.
24)日 本 臨 床 化 学会 教 育 委 員 会,日 本 臨床 化 学 会 機 器 専 門 委 員 会 編,臨 床 検 査 室 にお け る 機 器 試 験 法 マ ニ ュ ア ル ・リフ ァ レ ンス 法 の 開発 ・検 討 用 分 光 光 度 計 の性 能 規 格:p32‑37,あ りい出 版(株)(東 京), 1993.
臨床 化 学 第35巻 第4号2006年11月 399
プ ロ ジ ェク ト報 告
臨 床 化 学35:400‑419,2006
血 清 中 の総 コ レス テ ロ ー ル濃 度 測 定 の勧 告 法 (実用 基 準 法)
《解 説 書 》
日本 臨床化 学会 酵素 ・試薬 専 門委 員会
(〔 血清 コ レステ ロール測 定 の勧 告 法 「 比 較対 照法 」 か ら
「 実用 基準 法」 へ の移行 に関す る研 究 〕 プ ロジ ェク ト)
1.実 用 基 準 法 勧 告 ま で の 経 緯 説 明 1983年 に 旧 分 析 部会 関東 支 部 お よび近畿 支 部 か ら成 る 臨 床 検 査 薬 技 術 懇 談 会 コ レス テ ロ ールワー キ ング グル ー プ を中心 にTC測 定 に お ける勧 告 法 作 成 の活 動 を開 始 した。 コ レス
テ ロ ー ル エ ス テ ラ ー ゼ
(CE; Cholesterol Esterase, EC 3.2.1.13)
の反応 性 を含 む種 々 の 検 討 結 果1の を ま とめ て,1987年 の 第7回 日本 臨 床 化 学 会 夏 期 セ ミナ ー に お い て,「 酵 素 法 に よ る血 清 コ レ ス テ ロ ー ル の 標 準 的 測 定 法 へ の ア プ ロ ー チ(草 案)」3)が 作 成 さ れ た 。 こ の 草 案 に 基 づ き 日本 臨 床 化 学 会 旧 分 析 部 会 関 東 支 部 試 薬 委 員 会 で は酵 素 法 とALBK変 法 と の 比 較 検 討 を 行 い 精 密 性 お よ び 正 確 性 に 差 が な い こ と を報 告 し た4)。そ して,こ れ らの 成 果 を 1993年 の 第13回 日本 臨 床 化 学 会 夏 期 セ ミナ ー に お い て 血 清 コ レ ス テ ロ ー ル 測 定 の 勧 告 法 案 を発 表 した5)。 こ こ で 報 告 し た 方 法 を実 用 基 準 法 の勧告 法 の 候 補 と して酵 素 法(CE-CO-P0- DAOS[N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl) -
3,5-dimethoxyaniline])
を推 薦 して い る 。 こ の 方 法 は反 応 を過 酸化 水 素 に導 き測 定 す る酵 素 法 で あ るた め,PO反 応 系 に関 わ る還元物 質 の 影 響 を受 けや す い こ と,化 学 量 論 的 な反 応 を 検 証 す る こ とが 難 しい こ とな どの問題 点 を解 決 す る に至 っ てい ない 。 また,物 理 的指 標 に 基 づ く濃 度 算 出 が可 能 な ピ リジ ンヌ ク レオチ ド[NAD(H),NADP(H)]の よ う な モ ル 吸 光 係 数 に よ っ て 濃 度 を 求 め る と い っ た 理 論 的 算 出 方 法 が 困 難 で あ る 。 こ れ ら の こ とか ら,一 次 標 準 物 質 か らの 値 の 伝 達 を体 系 付 け る 測 定 体 系 の 実 用 基 準 法 と し て は 承 認 さ れ る ま で に は 至 ら な か っ た 。一 方,日 本 臨 床 化 学 会 旧 分 析 部 会 近 畿 支 部 脂 質 小 委 員 会 で は,1986年 に 開 催 さ れ た 夏 期 セ ミ ナ ー に お い て,コ レス テ ロ ー ル の 標 準 的 測 定 法 の 設 定 を 目 的 に,標 準 物 質 以 外 の ピ リ ジ ン ヌ ク レ オ チ ドの 変 化 量 を も と に して 理 論 的 な 測 定 が 可 能 と され た,CDを 利 用 した 測 定 法 に つ い て検 討 し報 告 した2)。 こ の 時 点 で は,試 薬 の 安 定 性,大 量 のNADに よ る 高 い初 期 吸 光
度,反 応 の 場 に 存 在 す る 基 質 の コ レ ス テ ロ ー ル 量 に対 してCDが 理 論 上86%程 度 しか 反 応 し な い な ど の 問 題 点 を 有 し て い た 。 し か し, 1992年CD反 応 に よ って 生 成 す る △‑4‑コ レス テ ン‑3一オ ン を ヒ ドラ ジ ン の 作 用 に よ り,△ ―4―コ レ ス テ ン‑3‑オ ン の ケ ト基 と 反 応 させCDの 作 用 を受 け な い よ う に し,CD反 応 をNADHの 生 成 方 向 に 傾 け る こ と に よ っ て 中 性 付 近 で の 反 応 が 可 能 と な っ た 。 さ ら に 補 酵 素 で あ るNAD添 加 量 も少 な く,理 論 的 な 吸 光 度 変 化 量 が 得 ら れ る測 定 方 法 が 報 告 さ れ た 昏7)。そ の 後 さ ら に こ の 方 法 に つ い て 改 良 が 加 え られ た 。 す な わ ち,1996年 に 日本 臨 床 化 学 会 試 薬 専 門 委 員 会 で は,近 畿 地 区 及 び 中部 地 区 を 中心 にCDを 用 い,NADHの 生 成 量 か ら 総 コ レス テ ロ ー ル 濃 度 を 求 め る 測 定 法 に つ い て の 有 用 性 を報 告 し た8)。 さ ら に 同 年,CDを 指 示 反 応 系 と し て 利 用 した 測 定 法 に つ い て プ ロ ジ ェ ク ト 「血 清 コ レス テ ロ ー ル の 実 用 基 準 法 の 確 立 」 が 発 足 し, CDの 酵 素 特 性,測 定 条 件,測 定 試 薬 の 組 成 検 討,基 本 性 能 の 確 認,普 遍 性 の検 討 を行 い 良 好 な 成 績 を得 た9‑11)。
日本 臨 床 化 学 会 で は こ の 結 果 を受 け,試 薬 専 門 委 員 会 の 活 動 を ま と め,2001年9月 に 日本 臨 床 化 学 会 勧 告 法[ヒ ト血 清 コ レス テ ロ ー ル 測 定 の 勧 告 法 ― 実 試 料 の 測 定 値 を 評 価 す る た め の 比 較 対 照 法 ―]を 発 表 した12)。 こ の 方 法 は リ ポ タ ンパ ク か ら の コ レ ス テ ロ ー ル の 切 り出 し と エ ス テ ル 型 コ レス テ ロ ー ル の 加 水 分 解 はCEを 利 用 して 行 い,生 成 す る遊 離 型 コ レス テ ロ ー ル はCDを 用 い て 測 定 す る 全 酵 素 法 で あ る 。 こ の
「比 較 対 照 法 」 と して の 勧 告 法 は,CDCの 実 用 基 準 法 で あ るALBK法13‑14)と 比 較 検 討 し,良 好 な結 果 を得 た 。 そ の 後,世 界 的 な検 査 デ ー タ 共 有 化 の 高 ま りの 中 で ト レ ー サ ビ リ テ ィ 体 系 構 築 の 必 要 性 の 議 論 が 国 際 的 に 行 わ れ て き た 。 そ の 中 で 健 康 志 向 の 世 論 も 高 ま り コ レ ス テ
ロ ー ル の 正 確 な 測 定 値 を確 立 す る測 定 体 系 を 求 め る 必 要 性 が 出 て きた 。 そ こ で,わ が 国 独 自 の 実 用 ・基 準 法 設 定 を 目的 に2004年7月,新 た な プ ロ ジ ェ ク ト 〔血 清 コ レ ス テ ロ ー ル 測 定 の 勧 告 法 「比 較 対 照 法 」 か ら 「実 用 基 準 法 」 へ の 移 行 に関 す る研 究 〕 が 発 足 した15)。
測 定 法 の 選 択 に 当 た っ て は,2001年 に確 立 し た 「比 較 対 照 法 」 やCDCの 実 用 基 準 法 と して 長 年 の 実 績 を もつALBK法 が 候 補 と し て 考 え られ た 。 しか し,後 者 の 方 法 を わ が 国 の 実 用 基 準 法 と して そ の ま ま受 け 入 れ て 良 い か ど う か は,過 去 の 本 学 会 専 門 委 員 会 に お い て 長 年 議 論 の あ る と こ ろ で あ る 。 発 色 系 の 不 安 定 さ か ら くる 手 技 の 習 熟 度 の 必 要 性 が あ る も の の, 長 年 実 用 基 準 法 と して 世 界 的 に 利 用 さ れ,正 確 さ の 拠 り所 と して 広 く普 及 し,デ ー タ の 均
一 性 を 保 っ て い る か ら 変 更 の 必 要 性 は な い。 しか し,ALBK法 の発 色 は 化 学 反 応 で あ る た め に試 薬 の ロ ッ トに よ り影 響 さ れ る こ と,血 清 中 に は 少 な い が コ レス テ ロ ー ル 以 外 の ス テ ロ イ ド骨 格 を もつ 類 似 物 質 も反 応 す る1t17),発 色 が 一 定 に な る 時 間 は 短 く(あ る い は 無 く), 厳 密 に 試 験 管 内 の 反 応 液 を 同 一 時 間 で 測 定 し な け れ ば 退 色 に よ り定 量 性 が 失 わ れ る な ど, 試 薬 ブ ラ ン ク や 標 準 物 質 を 立 て る と は い え, 操 作 上 の 大 き な 問 題 点 が 存 在 す る 。 そ の た め 本 プ ロ ジ ェ ク トで は,わ が 国 独 自 の 実 用 基 準 法 設 定 に 向 け て 活 動 す る こ とが 必 要 と考 え た 。
「比 較 対 照 法 」 は 当 初 実 用 基 準 法 と して の 候 補 と し て 最 有 力 で は あ っ た が,酵 素 に よ る 加 水 分 解 が そ の 解 説 書 で は 十 分 な 加 水 分 解 能 を 有 し て い る こ と を確 認 して い る もの の,国 際 的 に実 用 基 準 法 と し て の 加 水 分 解 操 作 法 と認 め ら れ る か の 懸 念 が あ っ た 。 そ こ で,脂 質 加 水 分 解 法 の 常 道 で あ る 「ア ル カ リ加 水 分 解 」 はCDCALBK法 で も採 用 さ れ て い る こ とか ら, こ の 方 法 を採 用 す る こ と に 異 論 は な か っ た 。 ま た,発 色 系 と して は 「比 較 対 照 法 」 で 採 用
して い るCD‑UV法 が 方 法 論 の 継 続 性 と 定 量 的 な 測 定 系 で あ る こ とが 認 め ら れ て い る こ と か
ら,比 較 対 照 法 と して の 勧 告 法 解 説 書(2001 年)12)に 「比 較 対 照 法 の 補 完 的 役 割 を担 う方 法 」 と し て 一 部 検 討 成 績 が 報 告 さ れ て い る
「ア ル カ リ加 水 分 解 一CD―UV法 」18‑20)が 考 え ら れ た 。 そ こ で,総 コ レ ス テ ロ ー ル の 実 用 基 準 法 候 補 と し て の 選 定 作 業 を 進 め る に あ た り,
「ア ル カ リ加 水 分 解 ―CD―UV法 」 を そ の 候 補 と し て 検 討 し た 。 そ の 検 討 の 結 果,CDC ALBK法.同 位 体 希 釈 質 量 分 析 法(ID―MS)と
臨 床 化 学 第35巻 第4号2006年11月401
図1測 定原理
の 測 定 値 と比 較 し て も そ の 精 密 性,正 確 性 に 比 肩 で き る 方 法 で あ る こ と を確 認 し た 。 そ の 測 定 原 理 を 図1に 示 す 。
2.略 号
ALBK : Abell-Levy-Brodie-Kendall ATP• 2Na : Adenosine-5'-triphosphate,
disodium salt
CD : Cholesterol dehydrogenas( (コ レ ス テ ロ ー ル 脱 水 素 酵 素), EC No. not certified CDC : Centers for Disease Control and
Prevention
CE : Cholesterol esterase (コ レ ス テ ロ ー ル エ ス テ ラ ー ゼ), EC 3.1.1.13, Steryl-ester acylhydrolase CO : Cholesterol oxidase (コ レ ス テ ロ ー ル オ キ
シ ダ ー ゼ), EC 1.1.3.6, Cholesterol: oxygen oxidoreductase
CRMLN : Cholesterol Reference Method Laboratory Network
DM : n-Dodecyl- β-D-maltopyranoside
EDTA.2Na¥2H2O : Ethylenediamine-N, N, N' N'- tetraacetic acid, disodium salt, dihydrate G6PD : Glucose-6-phosphate dehydrogenase
(グ ル コ ー ス‑6‑リ ン 酸 脱 水 素 酵 素) , EC
1.1.1.49,D-Glucose-6-phosphate: NADP+ 1- oxidoreductase
HEPES:2- [4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl]
ethanesulfonic acid
HK: Hexokinase(ヘ キ ソ キ ナ ー ゼ),EC2.7.1.1,
ATP: D-hexose-6-phosphotransferase
NAD : β-Nicotinamide-adenine dinucleotide;
oxidized form
NADP : β-Nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate : oxidized form
NADH : β-Nicotinamide-adenine dinucleotide ;reduced form
402
NADPH : β-Nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate reduced form
NIST : National Institute of Standards and Technology
NTA : Nitrilotriacetic acid
PO : Peroxidase (ペ ル オ キ シ ダ ー ゼ),EC 1.11.1.7, Donor: hydrogen-peroxide oxidoreductase SRM : Standard Reference Material
TC : Total cholesterol (総 コ レ ス テ ロ ー ル) 3測 定 法 の 選 択
2001年 勧 告 され た 「比 較 対 照 法 」 と 同 様 に, 以 下 に 示 す 事 項 を満 た す こ と を 条 件 に 測 定 法
を 選 択 した11)。
a)反 応 機 序 が 明確 で あ る こ と
b)本 来 の 総 コ レス テ ロ ー ル量 を反 映 す る こ と c)共 存 物 質 の 影 響 を 極 力 受 け な い こ と d)系 を構 成 す る 物 質 も し くは 反 応 生 成 物 に よ
り,そ の 系 が 阻 害 さ れ な い こ と
e)標 準 物 質 を用 い る相 対分析 と物 理 的指標 に 基 づ く分析 の両 者 が可 能であ る こ と f)測 定 操作 が比 較 的 簡便 で 日常 使 用 す る標 準
物 質の検 定 に使 用 で きる こと
こ れ ら の 点 を踏 ま え 本 法 を実 用 基 準 法 と し て 採 用 し た理 由 を以 下 に 示 した 。
リ ポ タ ンパ ク の 構成 成 分 で あ る 遊 離 型 コ レ ス テ ロ ー ル と エ ス テ ル 型 コ レス テ ロ ー ル を 総 コ レ ス テ ロ ー ル と し て 定 量 的 に 測 定 す る た め に は,エ ス テ ル 型 コ レ ス テ ロ ー ル の 加 水 分 解 反 応 が100%進 行 す る 必 要 が あ る 。 こ の 加 水 分 解 に は ア ル コ ー ル 性 の ア ル カ リ 溶 液 を利 用 す る 方 法 と コ レス テ ロ ー ル エ ス テ ラ ー ゼ な どの 酵 素 を 利 用 す る方 法 が あ る。 後 者 の 酵 素 を 利 用 す る 方 法 は新 鮮 な ヒ ト血 清 を 試 料 と して 用 い る 場 合 に は特 に 問 題 に な ら な い こ と は 多 く の 報 告 か ら明 ら か で あ る 。 しか し,キ ャ リ ブ レ ー タ や技 能 試 験(Proficiency Test)に 利 用 さ れ る 血 清 試 料 は 安 定 性 の 面 か ら 凍 結 乾 燥 処
図2本 勧告法の測 定体系
臨床 化学 第35巻 第4号2006年11月 403
理 を し て い る場 合 が 多 い 。 そ の 場 合,酵 素 反 応 に よ る 加 水 分 解 反 応 は 凍 結 乾 燥 処 理 に ま つ わ る変 性 の 問 題 が あ る 。 こ の よ う な 点 を 明 確 に 解 決 す る こ と,さ ら に 国 際 的 に 調 和 の あ る 方 法 と い う こ とで 長 年 の 実 績 の あ るALBK法 の 加 水 分 解 操 作 と 同 じア ル コ ー ル 性 ア ル カ リ 溶 液 に よ る 加 水 分 解 法 を採 用 し た 。 さ ら に, 指 示 反 応 系 は 「比 較 対 照 法 」 で の 十 分 な 検 討 の 結 果,優 れ た 定 量 性 を有 し,反 応 自 身 が エ ン ドポ イ ン トで の 測 定 が 可 能 で あ り,測 定 に お け る厳 密 な 時 間 管 理 がALBK法 ほ ど は 厳 密 で な い 緩 和 な 条 件 で 反 応 が 可 能 なCD21‑22)を 用 い る 酵 素 反 応 を 採 用 し た 。 測 定 操 作 方 式 と し て は,測 定 を 紫 外 部 波 長 で 行 う こ と か ら 分 析 試 料 の 色 調 やCD以 外 の 脱 水 素 酵 素 反 応 に 伴 う ブ ラ ン ク 反 応 を差 し引 く た め にCDを 含 ま な い ブ ラ ン ク測 定 用 の 試 薬 を 用 い る こ と に し た 。 ま た,反 応 に 関 与 し た コ レス テ ロ ー ル と 等 量 のNADHを 生 成 す る こ と か ら 反 応 系 が 明 確 で あ り,自 家 調 製 で き,基 本 的 な性 能 や 試 薬 の 安 定 性 も確 保 で き る こ と も本 法 を採 用 した 理 由
で あ る 。
以 上 の こ とか ら血 清 総 コ レス テ ロ ー ル の 測 定 体 系 を図2に 示 す よ う にCDC法 と同 じ く実 用
基準法 (reference method) と して の位 置付
け と し た 。 す な わ ち,最 上 位 の 絶 対 、基 準 法
(definitive method)
と して 最 も誤 差 の 少 な い同位体希釈質量分析法 (ID-MS; isotope dilution mass-spectrometry) 23‑24)が あ り,そ
の正確 性 は実 試料(実 用 血 清)標 準 物 質(二 次 標 準 物 質)を 用 い て 下 位 の 実 用 基 準 法
(reference method)
へ 伝 達 され,さ ら に得 ら れ た常用 血 清標 準 物 質 を用 い て 日常 検 査 法 へ 正 確性 を伝 達 す る とい う測 定体 系 で あ る 。 ま た,国 際 的 なデ ー タ共 有 化 を推 進す る観 点 か ら検 討 を 行 っ た 結 果, CDC-CRMLN が採 用 し て い る ALBK 法 と も互換 性 の あ る方 法 で あ る こ と が 分 か っ た 。 こ れ ら の 検 討 成 績 に 基 づ い て,総 コ レ ス テ ロ ー ル 測 定 の 施 設 間 差 是 正 と 正 確 な 測 定 値 を 日常 検 査 や 疫 学 的 調 査 等 に 提 供 す る こ とが 可 能 で あ る 。4.分 析試料の条件
4.1分 析 試 料
分 析 用 試 料 と して の ヒ ト血 清 は,新 鮮 血 清 ま た は 新 鮮 血 清 を プ ー ル した も の を使 用 す る 。 4.2標 準 液
イ ソ プ ロ ピ ル ア ル コ ー ル で 溶 解 し た 標 準 液 は,密 栓 が で き る 容 器 に入 れ て4℃ の 冷 蔵 下 で 保 存 す る 。 自 家 調 製 した 標 準 液 は,結 晶 な ど の 残 留 が 無 い こ と を確 認 し,よ く混 和 し て使 用 す る。 また,冷 蔵 保 存 した標 準 液 は,必 ず 室 温 に戻 した後 に使 用 す る。
4.3血 清 標 準 物 質
新 鮮 血 清 ま た は 新 鮮 血 清 を プ ー ル した もの, あ る い は何 らか の 方 法 に よ っ て リ ポ タ ンパ ク 質 成 分 を分 離 して 血 清 に 添 加 し て 作 製 した も の を 血 清 標 準 物 質 の ベ ー ス と し,所 定 の 測 定 方 法 で 値 付 け を行 う 。 冷 蔵 あ る い は 凍 結 した 血 清 標 準 物 質 は 冷 蔵 下 で 溶 解 し,十 分 に 混 和 後 使 用 す る 。 な お,凍 結 乾 燥 し た 血 清 標 準 物 質 も特 に限 定 し な い 。
4.4キ ャ リブ レ ー タ 及 び 精 度 管 理 用 試 料 新 鮮 血 清 を プ ー ル,あ る い は 何 ら か の 方 法 に よ っ て リ ポ タ ンパ ク質 成 分 を 分 離 し て 血 清 に 添 加 して 作 製 し た 凍 結 あ る い は 液 状 の もの を 使 用 す る 。 な お,凍 結 乾 燥 した キ ャ リ ブ レ ー
タ 及 び 精 度 管 理 用 試 料 も特 に 限 定 し な い 。
5.コ レ ス テ ロ ー ル の 規 格 5.1一 次 標 準 物 質
コ レ ス テ ロ ー ル の 標 準 物 質 は 純 度 検 定 され た もの がNISTか ら入 手 す る こ とが で き る た め, 一 次 標 準 物 質 と し て の コ レ ス テ ロ ー ル は
, NIST SRM 911b コ レ ス テ ロ ー ル(純 度99.8%) が 適 して い る。
5.2標 準 液
NIST か ら入 手 し た コ レス テ ロ ー ル を 室 温 に 戻 し,デ シ ケ ー タ ー 中 に24時 間 保 存 して 乾 燥 後,密 栓 が で きる100mLメ ス フ ラ ス コ 内 に 正 確 に100,200,300,400mgを 秤 量 し,予 め 少 量 の イ ソ プ ロ ピ ル ア ル コ ー ル で 溶 解 後,イ ソ プ ロ ピ ル ァ ル コ ー ル で 正 確 に100mLと す る。 た
だ し,実 際 に は 正 確 に は 区 切 りの 良 い 数 字 で 秤 量 す る こ とが 困 難 な 場 合 も あ る た め,秤 量 し た 重 量 を そ の 標 準 物 質 濃 度 と して 計 算 に用 い る 。 溶 解 後 は ス ク リ ュ ー キ ャ ッ プ付 きの 容 器 に 入 れ密 栓 し て4℃ の 冷 蔵 庫 に保 管 す る 。 こ の 標 準 液 は,6ヶ 月 程 度 で 再 調 製 す る 。 ま た, 界 面 活 性 剤(例 え ば,Triton X‑100)と イ ソ プ ロ ピ ル ァ ル コ ー ル で 溶 解 し た試 料 も 同 様 に使 用 可 能 で あ る。
6.本 法 に用い る酵素の活性定義 と 活性測定法
6.1コ レ ス テ ロ ― ル 脱 水 素 酵 素 (1)測 定 原 理 お よび 単 位 の 定 義
CDはNADの 存 在 下,コ レス テ ロ ー ル を酸 化 し △‑4‑コ レス テ ン‑3‑オ ン に 変 換 す る 。 こ の と き 生 成 す るNADHの 増 加 量 を 測 定 す る 。25℃
恒 温 下 で,1分 間 に1μmolの コ レス テ ロ ー ル を
△‑4‑コ レ ス テ ン‑3‑オ ン に 触 媒 す る 酵 素 量 を1 単 位(U)と す る 。
(2)CD酵 素 活 性 測 定 用 試 薬
① 基 質 液 の 調 製
コ レ ス テ ロ ー ル50mgを イ ソ プ ロ ピ ル ア ル コ ー ル4mLで 溶 解 す る 。 次 に,予 め 調 製 した 2%ト リ ト ン(R)X‑100溶 液40mLを 加 え,70〜
80℃ で10分 間 加 熱 す る 。 放 置 し冷 却 後,2%ト リ ト ン(R)X‑100で全 量 を50mLと し,基 質 液 とす る｡
② 補 酵 素 液 の 調 製
0.3mol/Lト リ ス(ヒ ド ロ キ シ メ チ ル)ア ミ ノ メ タ ン 緩 衝 液(pH8.5,25℃)50mLにNAD
150mgを 溶 解 し,補 酵 素 液 と す る 。
(3)試 料 の 調 製
10mmol/Lリ ン 酸 緩 衝 液(pH7.0,25℃)50
mL中,コ ー ル 酸 ナ ト リ ウ ム150mgを 溶 解 し, 酵 素 希 釈 液 と す る 。 こ の 酵 素 希 釈 液 を 用 い, CDを 含 む 溶 液 を0.07〜0.12U/mLと な る よ う
に 希 釈 す る 。
(4)操 作 手 順
① 基 質 液2.OmLと 補 酵 素 液1.OmLを 混 和 し, 25℃ の恒 温 に す る 。
② 試 料0.1mLを 添 加 し,撹 拌 後 直 ち に波 長 340nmで 吸 光 度 変 化 を記 録 す る 。
③ 反 応 初 期 の 比 例 的 に 反 応 す る 部 分 を 求 め,1 分 間 当 た り の 吸 光 度 変 化 量 を 求 め る
(CDA1)。
④ 盲 検 と して,試 料 の 代 わ りに 酵 素 溶 解 液 を 用 い て 同様 に操 作 す る(CDA2)。
⑤ 以 下 の計 算 式 に 従 い,酵 素 活 性 を算 出 す る 。 CD(U/mL)=(CDA1‑CDA2)×3.1×n×
103/6.30×103×0.1
6.30×103:NADHの340nmに お け る モ ル 吸 光 係 数(1・mol‑1・cm‑1)
n:試 料 調 製 時 の 希 釈 倍 数
こ こ で使 用 す る モ ル 吸 光 係 数 は,「10.追 記 モ ル 吸 光 係 数 を 用 い た 基 本 操 作 法 」 で 求 め た 見 か け の モ ル 吸 光 係 数 を使 用 す る 。
7.測 定 条件
7.1測 定 操 作 法
本 測 定 法 に お け る 測 定 操 作 法 を 図3(加 水 分 解 操 作)と 表1(指 示 反 応 系 操 作)に 示 す 。 ま た,標 準 物 質 を 用 い た コ レス テ ロ ー ル 濃 度 算 出 例 に つ い て 図4に 示 す 。 基 本 的 な 測 定 系 列 と
し て は,本 反 応 及 び ブ ラ ン ク 反 応 に つ い て 各 々 標 準 物 質(0,100,200,300,400mg/dL)
は3重 測 定,コ ン トロ ー ル,血 清 試 料 は2重 測 定 を す る こ とが 望 ま し い 。
7.2試 薬 濃 度 設 定 7.2.1基 本 操 作
本 法 測 定 に お け る 至 適 条 件 の 検 討 を行 っ た。
比 較 対 照 法 の 試 薬 組 成 検 討 成 績 を 基 本 に ア ル カ リ加 水 分 解 検 体 を使 用 す る 際 の 至 適 条 件 を 設 定 した 。 基 本 測 定 法 と して,コ レス テ ロ ー ル の イ ソ プ ロ ピ ル ア ル コ ー ル 溶 液0.1mLに 第 一 試 薬(5 .5mmol/L NAD,66.7mmol/L二 塩 化 ヒ ドラ ジ ニ ウ ム,0.2%デ オ キ シ コ ー ル 酸 ナ
ト リ ウ ム,0.2%Triton(R)X‑100,1.00mmol/L EDTA,100mmol/L HEPES緩 衝 液,pH8.0)の
臨床化学 第35巻 第4号2006年11月 405
基本操作法 加水分解操作
図3ア ル カリ加水分解操作法
表1指 示反応系基本 操作 法
ASs、ASbは 試 料 に お ける各 々総 反応 と検 体ブ ランクを、ASts、AStbは 一次 検量 用 物 質にお ける各 々総 反 応 と検 体ブ ランク、ACs,ACbは コン トロー ル にお ける各 々総 反応 と検 体ブランクを示 す 。また、AR2b、AR3b は各 々本反応 とブ ランク反 応の 試薬ブ ランクを示 す。
3.OmLを 添 加 し て37℃ 中 で10分 間 放 置 後,第 二 試 薬(17U/mL CD,0.3%コ ー ル 酸 ナ ト リ ウ ム, NTA,100mmol/L HEPES緩 衝 液,pH8.0)1.O mLを 添 加 し,NADが 還 元 さ れ て 生 成 す る NADHの340nmに お け る 吸 光 度 を 測 定 し た 。 特 に 指 定 す る 場 合 を 除 き,180mg/dL(4.65
mmol/L)コ レ ス テ ロ ー ル の イ ソ プ ロ ピ ル ア ル コ ー ル 溶 液[ア ル カ リ 加 水 分 解 換 算 時 450mg/dL(11.63mmol/L)]を 試 料 と して 使 用 した 。 ま た,「7.2.2緩 衝 液 の種 類 とpH」 及 び 「7.2.4二塩 化 ヒ ドラ ジ ニ ウ ム 濃 度 」 は 比 較 対 照 法 の 条 件 設 定 を そ の ま ま採 用 し た 。
STD‑0は 試 料 として イソプ ロ ピルア ル コー ル を加 え る｡AR2b、AR3bは 各 々 本 反 応 とプ ランク反応 の 試 薬 ブランクを 示 。
*「試 薬 ブランク(AR2b‑AR3b)」 の3重 測 定 の 率 均 値
**各 測 定吸 光 度 か ら試 薬 ブ ラン ク吸 光度 を差 し引 く
***秤 量 濃 度と吸 光 度 変 化 量 を各 々x軸 、y軸にプ ロットし最 小 二 乗 法 によ り回 帰 式 を計 算 す る。
****MS EXCELの 「分 析 ツー ル 」回 帰 分 析 により求 め た 回 帰 式y=0.002316x+O.005121を もとにyに**
の 吸 光 度 を代 入 し、xを求 め ると各 試 料 コレス テロ一 ル 濃 度 が算 出 でき る｡
図4標 準物質 を用い た濃 度算出例
図5最 適pHの 検 討
試 料:○,300mg/dL(7.76mmol/L)コ レ ス テ ロ ー ル 水 溶 液;●,新 鮮 ヒ ト血 清A;▲,新 鮮 ヒ ト血 清B;矢 印,最 適pHを 示 す 。
7.2.2緩 衝 液 の 種 類 とpH
HEPES緩 衝 液 を 用 い てpHを6.5〜8.5ま で 変 化 さ せ,37℃ に お け るCD活 性 の1分 間 当 た り の 吸 光 度 変 化 量(△Abs./min.)を 求 め,最 適pH 条 件 を 検 討 し た 。 図5に 示 す よ う に,2例 の 新 鮮 ヒ ト血 清,300mg/dL(7.76mmol/L)コ レ
ス テ ロ ー ル の イ ソ プ ロ ピル ア ル コ ー ル 溶 液 の い ず れ もpH6.0〜7.5ま で はpHの 上 昇 と と も に 反 応 速 度 は 増 加 を示 した が,pH7.5以 上 で は ほ ぼ 一 定 で あ っ た 。 な お,HEPES緩 衝 液 以 外 に
もPIPES緩 衝 液 を 用 い た 検 討 に お い て も,pH 7.5以 上 でCD反 応 が 一 定 とな り,緩 衝 液 の 種 類 の 違 い に よ る 影 響 は ほ とん ど認 め られ な い 結 果 が 得 られ た 。 こ れ ら よ り,反 応pHを8.0に 設 定 し,酸 塩 基 平 衡 定 数(pKa)を 考 慮 し て HEPES緩 衝 液 を 用 い る こ と に し た 。 ま た, HEPES緩 衝 液 の 濃度 を25,50,100,150,200 mmol/Lと 変 化 さ せ た が,3検 体 と も反 応 速 度 は ほ ぼ 一 定 で あ り,緩 衝 能 を 考 慮 し て100 mmol/Lと した 。
7.2.3CDの 特 性 と使 用 量 の検 討
CDの 各 基 質 に対 す る ミ カ エ リ ス 定 数(Km 値)を 算 出 した と こ ろ,コ レス テ ロ ー ル に 対
して はKm=7.1×10‑4mol/Lで あ り,NADに 対 して はKm=4.5×10‑4mmol/Lで あ っ た 。 第 二 試 薬 中 のCD添 加 量 を3.0,6.5,10.0,13.5,17.0, 20.5,24.0,27.5U/mLと 変 化 させ て 反 応 が 定 常
に達 す る 時 間 を 測 定 した と こ ろ,CD活 性 の 増 加 と と も に 反 応 速 度 は 徐 々 に 増 加 を 示 した 。 CD添 加 量13.5U/mL以 上 で ほ ぼ 一 定 と な っ た
臨床 化学 第35巻 第4号2006年11月 407
図6コ レス テ ロ ー ル 脱 水 素 酵 素 濃 度(CD)添 加 量(第2試 薬)の 検 討
矢 印,最 適 条 件
た め,第 二 試 薬 中 のCD添 加 量 を17.0U/mL (終 濃 度4.25U/mL)と し た(図6)。
7.2.4二 塩 化 ヒ ドラ ジ ニ ウ ム 濃 度
CD反 応 を完 全 に 正(右)方 向 へ 進 め る た め に,△‑4‑コ レ ス テ ン‑3‑オ ンの トラ ッ ピ ン グ剤 と して 二 塩 化 ヒ ドラ ジ ニ ウ ム を 添 加 し た 。 二 塩 化 ヒ ドラ ジ ニ ウ ム 濃 度 を0,10,30,50,70,100 mmol/Lと 変 化 させ,200mg/dL(5.17mmol/L)
の コ レ ス テ ロ ー ル 溶 液 を イ ソ プ ロ ピ ル ア ル コ ー ル で 希 釈 し,コ レス テ ロ ー ル 測 定 に お け る 直 線 性 を調 べ た 。 二 塩 化 ヒ ドラ ジ ニ ウ ム が 30mmol/L以 上 の 濃 度 で 直 線 性 が 認 め られ,コ
レ ス テ ロ ー ル 高 濃 度 ま で 直 線 性 が 得 ら れ た 。 CD活 性 に 阻 害 が 認 め ら れ な い50mmol/Lの 二 塩 化 ヒ ド ラ ジ ニ ウ ム を 添 加 す る こ と に し た
(図7)。
7.2.5NAD濃 度
第 一 試 薬 中 のNAD濃 度 を1.9,3.1,4.3,5.5,6.7, 7.9mmol/Lと 変 化 さ せ,反 応 が 定 常 に 達 す る
時 間 を 測 定 し た と こ ろ,NAD濃 度 の 増 加 と と も に 反 応 速 度 は 徐 々 に 増 加 を 示 し た 。NAD濃 度4.3mmol/L以 上 で ほ ぼ 一 定 と な っ た た め, 第 一 試 薬 中 に5.5mmol/L(終 濃 度4.125 mmol/L)に 設 定 し た(図8)。
7.2.6反 応 促 進 剤
第 一 試 薬 中 の デ オ キ シ コ ー ル 酸 ナ ト リ ウ ム
図7二 塩 化 ヒ ド ラ ジ ニ ウ ム 濃 度 の 効 果 試 料:200mg/dL(517mmol/L)を イ ソ プ ロ ピ ル ア ル コ ー ル で 希 釈 し て 使 用 し た 。 二 塩 化 ヒ ド
ラ ジ ニ ウ ム 濃 度:○,Ommol/L;●,10 mmol/L;□,30mmol/L;■,50mmol/L;△, 75mmol/L;▲,100mmol/L。
図8NAD濃 度 添 加 量(第1試 薬)の 検 討 矢 印,最 適 条 件
添 加 量 を0,0.05,0.1,0.2,0.3%と 変 化 さ せ た と こ ろ,い ず れ も 添 加 量 の 増 加 と と も に 反 応 速 度 は 徐 々 に 増 加 を 示 し た 。 こ の 結 果 か ら,第 一 試 薬 中 の デ オ キ シ コ ー ル 酸 濃 度 を0.2%(終 濃 度0.15%)に 設 定 し た(図9a,b)。 ま た,同 様 に 第 一 試 薬 中 にTriton(R)X‑100を 添 加 し た 。 第 一 試 薬 中 のTriton(R)X‑100添 加 量 を0.2,0.4, 0.6,0.8,1.0%と 変 化 さ せ た と こ ろ,第 一 試 薬 中
のTriton(R)X‑100の 添 加 量0.2〜0.8%ま で37℃,7
