〔 技 術 資 料 〕
「 残 留 試 験 に お い て 使 用 さ れ る 分 析 方 法 の バ リ デ ー シ ョ ン 」 の
ガ イ ド ラ イ ン に お け る 検 出 限 界 （ LOD） 及 び 定 量 限 界 （ LOQ） に つ い て
小 池 良 治 、 水 野 安 晴 、 小 池 好 子 （ 平 成 25 年 4 月 24 日 受 付 、 平 成 26 年 9 月 25 日 受 理 ） ［ TECHNICAL REPORT］Methods for Determining the Limit of Detection (LOD)
and the Limit of Quantitation (LOQ) using the Guideline
titled “Validation of Analytical Methods Used in Residue Depletion Studies”
Ryoji KOIKE, Yasuharu MIZUNO, Kouko KOIKE
National Veterinary Assay Laboratory, Ministry of Agriculture, Forestry and Fisheries 1-15-1 Tokura, Kokubunji, Tokyo 185-8511, Japan
( Received : April 24, 2013 ; Accepted : September 25, 2014)
Summary
The VICH Steering Committee released four guidelines concerning “ Studies to evaluate the metabolism and residue kinetics of veterinary drugs in food-producing animals ” for implementation in the regions in February 2011. One of these guidelines is called “ Validation of analytical methods used in residue depletion studies ” . The guideline includes examples for calculating the validation parameters using hypothetical data in the annexes.
However, these examples are eliminated from the Japanese validation guideline. Therefore, this paper provides examples using hypothetical data and describes a part of the calculation procedures of the validation parameters using Microsoft Excel.
要 旨 「 食 用 動 物 に お け る 動 物 用 医 薬 品 の 代 謝 及 び 残 留 動 態 を 評 価 す る た め の 試 験 」 に 関 す る ４ つ の ガ イ ド ラ イ ン が 、 2011年２月 に VICH の 運 営 委 員 会 か ら 公 表 さ れ た 。 こ れ ら の ガ イ ド ラ イ ン の 一 つ が 「 残 留 試 験 に お い て 使 用 さ れ る 分 析 方 法 の バ リ デ ー シ ョ ン 」 で あ る 。 本 ガ イ ド ラ イ ン の 付 表 に は 、 仮 想 デ ー タ を 用 い た バ リ デ ー シ ョ ン の パ ラ メ ー タ の 計 算 例 が 示 さ れ て い る が 、日 本 で の 通 知 に お い て は 、計 算 例 が 省 略 さ れ て い る 。そ こ で 、本 資 料 で は 、
省 略 さ れ た 計 算 例 を 示 す と と も に 、 計 算 例 の 一 部 に つ い て エ ク セ ル を 用 い た 計 算 手 順 を 示 し た 。 Ⅰ 緒 言 動 物 用 医 薬 品 の 残 留 試 験 法 に つ い て は 、 日 本 、 EU 及 び 米 国 で ガ イ ド ラ イ ン が 異 な っ て い た こ と か ら 、 動 物 用 医 薬 品 の 承 認 審 査 資 料 の 調 和 に 関 す る 国 際 協 力 （ VICH） に「 代 謝 と 残 留 動 態 作 業 部 会 」が 設 置 さ れ 、 動 物 用 医 薬 品 の 残 留 試 験 法 に 関 す る 一 連 の ガ イ ド ラ イ ン が 作 成 さ れ た 。 ガ イ ド ラ イ ン は 、 以 下 の ４ つ で 構 成 さ れ て い る 。 ① 残 留 物 の 定 性 及 び 定 量 の た め の 代 謝 試 験 （ VICH GL46） ② 実 験 動 物 に よ る 比 較 代 謝 試 験 （ VICH GL47） ③ 製 剤 の 休 薬 期 間 確 立 の た め の 指 標 残 留 減 衰 試 験 （ VICH GL48） ④ 残 留 試 験 に お い て 使 用 さ れ る 分 析 方 法 の バ リ デ ー シ ョ ン （ VICH GL49） こ れ ら の ガ イ ド ラ イ ン を 日 本 で 施 行 す る た め 、「 薬 事 法 関 係 事 務 の 取 扱 い に つ い て 」 （ 平成12年3月31日 付 け 12 動 薬 A 第418号 農 林 水 産 省 動 物 医 薬 品 検 査 所 長 通 知 ）（ 以 下「 通 知 」 と い う 。） の 別 添 ８ の 「 14 動 物 用 医 薬 品 の た め の 残 留 試 験 法 ガ イ ド ラ イ ン 」 が 改 正 さ れ た 。 し か し 、「 残 留 試 験 に お い て 使 用 さ れ る 分 析 方 法 の バ リ デ ー シ ョ ン 」（ VICH GL49） の 付 表 に 示 さ れ て い る 仮 想 デ ー タ を 用 い た バ リ デ ー シ ョ ン の パ ラ メ ー タ の 計 算 例 に つ い て は 、 通 知 で 省 略 さ れ て い る こ と か ら 、 通 知 を 補 完 す る た め 、 本 資 料 で 省 略 さ れ た 計 算 例 を 紹 介 す る 。 ま た 、 計 算 例 の 一 部 に つ い て 、 表 計 算 ソ フ ト と し て 多 用 さ れ て い る Microsoft Office Excel （ エ ク セ ル ） を 用 い て 計 算 す る 手 順 を 紹 介 す る 。 エ ク セ ル に 関 す る 説 明 は 省 略 し た の で 、 他 の エ ク セ ル の 解 説 書 を 参 考 と さ れ た い 。 な お 、 本 資 料 は 通 知 を 補 完 す る た め の も の で あ る こ と か ら 、 本 資 料 を 利 用 す る 際 に は 、通 知 の 内 容 を 十 分 把 握 し た 上 で 、適 宜 、 通 知 を 参 照 す る 必 要 が あ る 。 以 下 の 計 算 例 で は 分 析 機 器 の 反 応 と し て 、 ピ ー ク 高 さ の み を 用 い た が 、 ピ ー ク 面 積 を 用 い る こ と も 可 能 で あ る 。 Ⅱ 計 算 例 １ 付 表 ２ LOD 及 び LOQ 決 定 の た め の 米 国 環 境 保 護 庁 の 方 法 の 解 説 例 第 １ 段 階 ： 評 価 す る 分 析 方 法 の 検 量 線 を 作 成 す る 。 本 例 で は 、 分 析 対 象 成 分 に つ い て 、 以 下 の 濃 度 の 緩 衝 液 又 は 水 に よ る 標 準 溶 液 を 準 備 し た 。 濃 度 機 器 の 反 応 （ µg/mL） （ ピ ー ク 高 さ ） 0.100 206,493 0.050 125,162 0.020 58,748 0.010 32,668 0.005 17,552 試 験 範 囲 内 の 直 線 性 を 確 認 す る た め に 、 濃 度 に 対 す る 分 析 機 器 の 反 応 を プ ロ ッ ト す る 。 グ ラ フ 及 び 付 随 す る 統 計 解 析 （ 回 帰 分
析 ） の 結 果 を 図 １ に 示 す 。 こ れ ら の 結 果 か ら 、 試 験 さ れ た 濃 度 の 範 囲 （ 0.005 ～ 0.100 µg/mL ） 内 で は 、 濃 度 に 対 す る 分 析 機 器 の 反 応 に 直 線 関 係 が 認 め ら れ 、 二 乗 平 均 平 方 根 誤 差 は 8987 で あ る （ 図 1 の 「 概 要 」 を 参 照 ）。 こ の 関 係 を 示 し た 式 は 、 以 下 の と お り で あ る （ 図 1 の 「 パ ラ メ ー タ の 評 価 」 の 計 数 を 参 照 ） : Y = 15,120 + 1,973,098 × （ 濃 度 ） Y は 、 分 析 機 器 の 反 応 （ ピ ー ク 高 さ ） で あ る 。 装 置 検 出 下 限 値 （ IDL） 及 び 装 置 定 量 下 限 値 （ IQL) は 、 こ れ ら の 値 を ブ ラ ン ク の 反 応 の 標 準 偏 差 の そ れ ぞ れ ３ 倍 及 び 10 倍 と し た 場 合 、 以 下 の よ う に 算 出 さ れ る 。 ① IDL で の ピ ー ク 高 さ （ YIDL） を 、 標 準 偏 差 （ 二 乗 平 均 平 方 根 誤 差 を 標 準 偏 差 と し て 用 い る 。） の ３ 倍 と し て 計 算 し 、 IQL で の ピ ー ク 高 さ （ YIQL） を 、 標 準 偏 差 の 10 倍 と し て 計 算 す る 。 YIDL = 15120 + 3 × （ 8987 ） = 42,081 YIQL = 15120 + 10 × （ 8987 ） = 104,990 ② こ れ ら の 値（ YIDL 及 び YIQL）か ら 、 関 連 し た 濃 度 を 以 下 の よ う に 算 出 す る 。 Y = 15,120 + 1,973,098 × （ 濃 度 ） こ れ を 変 換 す る と 、 濃 度 =（ Y － 15,120） ÷ 1,973,098 従 っ て 、 IDL = （ YLOD － 15,120 ） ÷ 1,973,098 = （ 42,081 － 15,120 ） ÷ 1,973,098 = 0.014 µg/mL IQL = （ YLOQ － 15,120 ） ÷ 1,973,098 = （ 104,990 － 15,120 ） ÷ 1,973,098 = 0.046 µg/mL 以 上 か ら 、IDL 及 び IQL は 、そ れ ぞ れ 0.014 及 び 0.046µg/mL で あ る 。 こ れ ら の IDL 及 び IQL は 、 溶 液 の 濃 度 と し て 示 し 、基 質 中 の 濃 度 で は な い 。そ の 後 、 溶 液 の 濃 度 （ µg/mL 溶 液 ） か ら 基 質 中 の 濃 度 （ 例 え ば µg/g 基 質 ） に 換 算 し 、 基 質 中 の 予 備 的 な LOD 及 び 予 備 的 な LOQ と す る 。 第 ２ 段 階 ： 第 ２ 段 階 で は 、 第 １ 段 階 で 算 出 さ れ た 予 備 的 な LOD（ 又 は IDL） 及 び 予 備 的 な LOQ （ 又 は IQL） 並 び に 検 証 さ れ た 検 量 線 を 用 い て 、 分 析 対 象 成 分 を 添 加 し た 基 質 試 料 で の LOQ 及 び LOD を 算 出 す る 必 要 が あ る 。 こ こ で は 、 分 析 機 器 の IDL 及 び 40 CFR Part 136, Appendix B4 で 詳 述 さ れ る LOQ を 算 出 す る た め の 方 法 を 使 用 し 、 分 析 方 法 の 回 収 率 が 許 容 さ れ る こ と を 検 証 す る 。 こ の 方 法 で は 、 未 処 理 の ブ ラ ン ク の 基 質 試 料 に 、 基 質 中 の 濃 度 が IQL か ら 換 算 し た 基 質 中 で の 予 備 的 な LOQ と な る よ う 分 析 対 象 成 分 を 添 加 し た ７ 以 上 の 試 料 が 必 要 で あ る 。 こ れ ら の 試 料 の 検 出 濃 度 の 標 準 偏 差 か ら 以 下 の よ う に LOD 及 び LOQ を 決 定 す る 。 LOD = t0.99 × S LOQ = 3 × LOD
t0.99 は 、 n-1 で の 片 側 99% 信 頼 区 間 と な る 値 （ 片 側 で 有 意 水 準 1 ％ ） で あ る 。 S は 、 予 備 的 な LOQ と な る よ う 分 析 対 象 成 分 を 添 加 し た n 個 の 試 料 の 検 出 濃 度 の 標 準 偏 差 で あ る 。 図 １ 第 １ 段 階 に お け る 統 計 結 果
パラメータの評価
係数
標準誤差
t
P値
下限 95.0% 上限 95.0%
切片
15119.954 5834.672
2.59
0.0810
-3448.891 33688.799
濃度
1973098.5 114317.5
17.26
0.0004
1609283.2 2336913.9
0 50,000 100,000 150,000 200,000 250,000 0 0.025 0.05 0.075 0.1 0.125 濃度 ピー ク 高 さ概要
R2（重決定）
0.99003
補正 R2
0.986707
二乗平均平方根誤差
8986.837
反応の平均
88124.6
観測数
5
以 下 は 、 上 式 で 用 い ら れ る ｔ 値 で あ る 。 検 体 数 自 由 度 t0.99 検 体 数 自 由 度 t0.99 （ n） （ n-1） （ n） （ n-1） 3 2 6.965 13 12 2.681 4 3 4.541 14 13 2.650 5 4 3.747 15 14 2.624 6 5 3.365 16 15 2.602 7 6 3.143 17 16 2.583 8 7 2.998 18 17 2.567 9 8 2.896 19 18 2.552 10 9 2.821 20 19 2.539 11 10 2.764 21 20 2.528 12 11 2.718 22 21 2.518 こ の 例 で は 、 未 処 理 の ブ ラ ン ク の 基 質 試 料 に 、 基 質 中 の 濃 度 が 予 備 的 な LOQ で あ る 0.05µg/g 以 上 と な る よ う 分 析 対 象 成 分 を 添 加 し た ７ 試 料 を 調 製 し 、 以 下 の 結 果 が 得 ら れ た 。 検 出 濃 度 回 収 率 （ µg/g） （ %） 0.0397 79.4 0.0403 80.6 0.0400 80.0 0.0360 72.0 0.0498 99.6 0.0379 75.8 0.0388 77.6 平 均 濃 度 ： 0.0404 µg/g 標 準 偏 差 ： 0.0044 µg/g 平 均 回 収 率 ： 80.7% 予 備 的 な LOQ で の 回 収 率（ 平 均 ： 80.7%、 範 囲 ： 72.0 ～ 99.6%） が 十 分 で あ れ ば 、 分 析 方 法 の LOD 及 び LOQ を 以 下 の よ う に 算 出 す る 。 LOD = t0.99 × S （ 自 由 度 = 7-1 = 6 ） = 3.143 × 0.0044 µg/g = 0.0138 µg/g LOQ = 3 × LOD = 3 × 0.0138 µg/g = 0.0414 µg/g ２ 付 表 ３ 残 留 分 析 法 バ リ デ ー シ ョ ン の プ ロ ト コ ー ル の デ ー タ セ ッ ト 例 LC-MS/MS で の 牛 乳 分 析 に つ い て 、 上 記 方 法 に 基 づ く バ リ デ ー シ ョ ン を 行 っ た 。 ６ 頭 の 異 な る 牛 か ら 採 材 し た ブ ラ ン ク 牛 乳 に 、 0、 4.2、 14.0、 35、 140 及 び 400ng/mL と な る 量 の 分 析 対 象 成 分 を 添 加 し 、 全 部 で 36 試 料 と し た 。 1 日 18 試 料 の 分 析 を ３ 日 間 行 う 。 毎 日 全 て の 牛 由 来 の 試 料 が い ず れ か の 添 加 濃 度 で 分 析 さ れ 、 ３ 日 間 で 全 て の 牛 由 来 の 試 料 が 全 て の 添 加 濃 度 で 分 析 さ れ る よ う 、 各 添 加 濃 度 ３ 個 の 試 料 を ラ ン ダ ム に 選 択 す る 。 ３ 日 間 で 全 54 個 の 分 析 結 果 を 解 析 し 、 併 行 精 度（ 分 析 ラ ン 内 精 度 ）、日 間 精 度（ 分 析 ラ ン 間 精 度 ）、LOD 及 び LOQ、を 求 め た 。 生 デ ー タ 及 び 統 計 解 析 結 果 を 以 下 に 示 す 。 生 デ ー タ の 統 計 的 解 析 を 以 下 の よ う に 実 施 し た 。 回 収 率 を 個 々 の 試 料 の 測 定 濃 度 と 添 加 濃 度 か ら 計 算 し た 。 処 理 （ 添 加 濃 度 ） を 固 定 因 子 と し 、 分 析 ラ ン （ 日 ）、 分 析 ラ ン 間 の 試 料 処 理 の 交 互 作 用 及 び 残 差 を 変 量 因 子 と し た モ デ ル を 、 最 小 二 乗 平 均 及 び 変 動 の 推 定 値 を 得 る た め
に 用 い た 。 表 中 の デ ー タ を 得 る た め 、 1/分 散 を 重 み と し た 重 み 付 き 回 帰 に よ り 検 量 線 を 求 め た 。他 の 重 み（ 例 え ば 、1/添 加 濃 度 、1/ （ 添 加 濃 度 ）２） も 検 量 線 の 回 帰 式 の 計 算 に 適 切 に 使 用 で き る だ ろ う 。 日 内 変 動 を 評 価 す る た め 、 個 々 の 処 理 及 び 処 理 を ま た が る CV の 計 算 に 残 差 分 散 を 用 い た 。 残 差 分 散 の 平 方 根 （ 標 準 誤 差 ） を 平 均 で 除 し 、100 を 乗 じ て 、CV を 計 算 し た 。 日 間 変 動 を 評 価 す る た め 、 残 差 分 散 の 合 計 、 分 析 ラ ン の 分 散 、 分 析 ラ ン 内 の 試 料 及 び 処 理 ご と の 分 析 ラ ン を 、 個 々 の 処 理 及 び 全 体 の 処 理 の CV を 算 出 す る 際 の 分 散 の 推 定 に 用 い た 。 0, 4.2, 14.0, 35.0, 140 及 び 400 ng/mL と な る 量 を 添 加 し た ブ ラ ン ク 牛 乳 中 の 3 日 間 の 分 析 に お け る 分 析 対 象 の 濃 度 添 加 分 析 ラ ン 1 分 析 ラ ン 2 分 析 ラ ン 3 濃 度 動 物 ID 測 定 動 物 ID 測 定 動 物 ID 測 定 ng/mL 濃 度 濃 度 濃 度 ng/mL ng/mL ng/mL 0 B 0.494 A 0.233 B 0.154 F 0.654 C 0.012 E 0.120 D 0.588 C 0.117 F 0.313 4.2 B 4.38 D 4.97 A 3.80 C 4.13 F 3.85 B 4.12 E 4.33 F 4.41 E 3.67 14.0 C 13.2 A 11.1 D 11.8 C 13.5 B 12.0 F 10.5 E 11.9 E 12.8 D 11.7 35.0 A 31.5 A 51.0 B 27.3 B 32.7 C 33.2 E 29.4 E 34.4 D 32.9 F 25.5 140 B 131 C 137 A 118 C 147 E 124 D 106 E 127 F 131 F 118 400 A 396 D 396 A 335 B 394 F 390 C 316 B 384 F 373 E 344
分 析 の 結 果 は 以 下 の と お り 。 分 析 ラ ン 内 及 び 分 析 ラ ン 間 精 度 及 び 真 度 の 決 定 理 論 濃 度 , n 平 均 回 収 率 * 95% 信 頼 区 精 度 , %CV ng/mL % 間 分 析 ラ ン 分 析 ラ ン 内 間 4.2 9 99.6 87.9 – 111.4 7.8 10.2 14.0 9 86.1 75.0 – 97.2 7.1 7.5 35.0 9 94.6 77.3 – 111.9 19.3 22.6 140 9 90.4 79.5 – 101.3 5.8 9.2 400 9 92.4 82.1 – 102.8 3.0 8.2 LOD 及 び LOQ の 決 定 の 図 を 以 下 に 示 す 。 LOD = 1.6 ng/mL LOQ = 3.7 ng/mL こ れ は 、 ３ 日 間 の 1 つ の 試 験 で 、 バ リ デ ー シ ョ ン の 精 度 、 真 度 、 LOD 及 び LOQ を 正 確 に 決 定 す る た め の 簡 単 な 方 法 で あ る 。 測 定 濃 度 測 定 濃 度 添加濃度
Ⅲ エ ク セ ル を 用 い た 計 算 手 順 こ こ で は 、 Ⅱ の １ で 示 し た 付 表 ２ の 図 １ の 「 第 １ 段 階 に お け る 統 計 結 果 」 を エ ク セ ル を 用 い て 計 算 す る た め の 手 順 を 示 す 。 Ⅱ の １ の そ の 他 の 部 分 は 電 卓 で 容 易 に 計 算 で き る こ と 、 ま た 、 Ⅱ の ２ で 示 し た 付 表 ３ の 計 算 例 は 、 統 計 解 析 ソ フ ト で あ る Ｓ Ａ Ｓ 等 を 用 い て 計 算 し て お り 、 エ ク セ ル で は そ の 計 算 を 容 易 に 再 現 で き な い こ と か ら 、 こ こ で は 触 れ な い こ と と し た 。 計 算 手 順 ① Ⅱ の １ の 表 を 入 力 （ こ こ で は 、 A1 ～ A6 に 濃 度 を 、 B1 ～ B6 に 機 器 の 反 応 を 入 力 ： 図 ３ 参 照 ） ② 機 器 の 反 応 の 平 均 は 、 エ ク セ ル 関 数 AVERAGE を 用 い て 算 出 （ こ こ で は 「 =AVERAGE( B2:B6) 」） ③ メ ニ ュ ー バ ー か ら 「 ツ ー ル 」 → 「 分 析 ツ ー ル 」を 選 択（ 2007 以 降 の 場 合 に は「 デ ー タ 」 → 「 デ ー タ 分 析 」 を 選 択 ） ④ 起 動 し た 分 析 ツ ー ル か ら 「 回 帰 分 析 」 を 選 択 （ 図 ２ 参 照 ） ⑤ 必 要 な 情 報 を 入 力 し 、「 OK」 を ク リ ッ ク （ 図 ３ 参 照 ） ⑥ 出 力 さ れ た 概 要 を 確 認 （ 矢 印 の 後 は 対 応 す る 図 １ の 用 語 。 用 語 が 同 じ も の は 省 略 ） 「 重 決 定 R2」 → 「 R2（ 重 決 定 ）」 「 標 準 誤 差 」 → 「 二 乗 平 均 平 方 根 誤 差 」 注 意 ： 分 析 ツ ー ル は 、 統 計 解 析 の た め の エ ク セ ル の ア ド イ ン プ ロ グ ラ ム で 、 初 期 状 態 で は 使 用 で き な い こ と か ら 、 マ ニ ュ ア ル 等 を 参 照 し て 組 み 込 む 必 要 が あ る 。 図 ２ 起 動 し た 分 析 ツ ー ル
図 ３ エ ク セ ル の シ ー ト 及 び 起 動 し た 回 帰 分 析
引 用 文 献
日 本 規 格 協 会 （ 1972） 統 計 数 値 表 JSA-1972. pp.76, pp.336. 日 本 規 格 協 会 . 東 京 .
EMEA（ 1995 ）Note for Guidance : Approach towards H a r m o n i s a t i o n o f W i t h d r a w a l P e r i o d s . EMEA/CVMP/036/95-Final.
FDA （ Revised 1994 ） General Principles for Evaluating the Safety of Compounds Used in Food-Producing Animals : V. Guideline For Establishing A Withdrawal Period
JECFA ： Software-based workbook for statistical
evaluation of residue depletion data for veterinary drugs （ http://www.fao.org/ag/agn/agns/jecfa_archive_statistical_en.asp） 農 林 水 産 省 （ 2000） 農 林 水 産 省 動 物 医 薬 品 検 査 所 長 通 知 12 動 薬 A 第418号 “ 動 物 用 医 薬 品 関 係 事 務 の 取 扱 に つ い て ” . 平成 12年3月31 日 . 農 林 水 産 省 （ 2012） 農 林 水 産 省 動 物 医 薬 品 検 査 所 長 通 知 23 動 薬 第 3324 号 “ 動 物 用 医 薬 品 関 係 事 務 の 取 扱 の 一 部 改 正 に つ い て ” . 平 成 24 年 １ 月 30 日 .
