原 著 居女医蕪，、鵠62巻平諏庫1言〕
胎盤におけるgonadotropin releasing hormone（GnRH）の
生理学的意義とGnRH−hCG一性ステロイドホルモン
内分泌系の調節機構
東京女子医科大学 産婦人科学教室（主任 武田佳彦教授） セ ト ヤマ タク ヤ 瀬 戸 山 琢 也 （受付平成4年3月19日） The PLysiologic績l Significance of Gonadotropin Releasing Homlone（GnRH）in Human Placenta and Regulation Mechanism of GnRH葡hCG騨Gonadal Steroids System．． Tak町a SETOYAMA Department of Obstetrics and Gynecology（Director：Prof． Yoshihiko TAKEDA） Tokyo Wombn’s Medical College The hypothalamic decapeptide， gonadotropin・releasing hormone（GnRH）has been found in the human placenta． GnRH has been reported to stimulate human chorionic gonadotropin（hCG）release by placental tissue and cells in vitro， and hCG is well known to stimulate the secretion of estradiol and progesterone in the placenta． These results indicate the existence of GnRH−hCG−gonadal steroid axis in the placenta． The purpose of this study is to clarify the regulatory system in this axis by using trophoblast cell culture from early gestation． The concentration of GnRH in villous tissue was higher in early gestation and decreased along with gestation． Immunohist㏄h6mical study demonstrated that GnRH was localized in cytotrophoblast and in some casesl week stain was 31so observed in outer layer of syncytiotrophoblast． GnRH stimulated hCG release in a Concentration dependent manner by trophoblast cells from 6 to 12 weeks gestation． On the other hand， progesterone inhibited both the basal． and the GnRH・stimulated hCG release dose dependently while estradiol showed stimulatory effect at only superphysiological concentration． When trophoblast cells were incubated with GnRH for 24hour under the presence of anti−hCG antibody， GnRH reduced progesterope release． Although estradiol release was increased when cells were incubated with GnRH a董one this effect was abolished り by adding anti・hCG antibody， suggesting that GnRH suppresses progesterone production directly and increased estradiol production ind童r㏄tly by increasing hCG． These results indicated that placental GnRH regulates hCG secretion both in vivo and inサitro and that reghlation mechanism in GnRH−hCG−gonadal steroid axls， especially negative f㏄αback of progesterone may contribute luteo・placental sift of progesterone prodμction observed in early gestatlon． 緒 言 胎盤は母体から胎児への栄養輸送やガス交換な ど，胎児発育に重要な役割を担っている．胎盤は このような代謝機能だけでなく，内分泌臓器とし ても非常に活発であり，そ．の産生するホルモンの 種類の多さは他に類を見ない1）．胎盤から分．泌さ れる固有のホ．ルモンとしてなじみ深いものに human chorionic gonadotropin（hCG）， humanplacental lactogen（hPL）のような蛋白ホルモン があるが，胎盤はその他にもエストラジオール， プロゲステロンなどのステロイドホルモン，視床 下部・下垂体性ホルモンおよび成長因子など生体 の各種内分泌臓器から分泌される多種多様なホル モンを産生・分泌している1）．その一つに視床下部 ホルモンのgonadotropin−releasing hormone （GnRH）がある．胎盤にGnRH様の物質が存在す るのを初めて報告したのはGibbonsら2）である， この胎盤性GnRHは免疫学的3），生化学的4）にも 視床下部性のGnRHと同一のものであることが 確認されている．GnRHは下垂体からのゴナドト ロピン分泌を刺激することは周知の事実である が，胎盤の組織培養や細胞培養系にGnRHを添加 するとhCG分泌も促進する5》．このことから， GnRHは胎盤におけるhCGの調節因子として注 目を浴びるようになった5）一8）．hCGはその構造が 下垂体のluteinizing hormone（LH）に類似して おり，胎盤iからのエストラジオールやプμゲステ ロン分泌に関与していることが知られている．・こ のような事実より，胎盤内には視床下部一下垂体 一卵巣系に類似のGnRH−hCG一性ステロイドホ ルモンという内分泌系が存在することが示唆され る，視床下部一下垂体一卵巣の内分泌系の調節機 序については数多くの研究があるが，胎盤での GnRH−hCG一性ステロイドホルモン系の調節機構 についてはほとんど知見が得られていない．本研 究では胎盤でのこの内分泌系の二二機構を妊娠初 ；期絨毛および妊娠中期，末；期の胎盤を用いて解析 した． 方 法 1．ホルモンおよび薬品・’ 合成GnRH，エストラジオール，およびプロゲ ステロンは米国Sigma社（Sigma Che卑．， U．S．A） より，また，GnRHアンタゴニスト（〔D・pGu1， D−Phe2， D−Trp3・6〕GnRH）は米国Peninsula社 （Peninsula Laboratories Inc．， U．S．A．）， hCGは 持田製薬（東京），抗hCG抗体は米国Organon社 （Organon Teknika Corp．， U。SA）より購入し た．1251−GnRHは大塚アッセイ（東京）より購入し た．また，牛血清アルブミンは米国Sigma社， Freund’s complete adjuvantはギブコ社（ギブ コ・オリエンタル，東京），キレーティソグセファ ロースはPharmacia社（Pharmacia LKB， Sweden），コラゲナーゼは和光純薬工業（大阪）， DNase・1はWorthing‡on社（Worthington Bio・ chem：， U．S．A．）よりそれぞれ購入した． 2．絨毛および胎盤組織の採取 妊娠初期絨毛は，社会的適応により人工妊娠中 絶術を施行した妊娠6∼12週の正常妊娠例より， インフォームドコンセントを得た上で採取した． 妊娠中期および満期の胎盤は早産あるいは満期産 の経膣分娩時に採取した．妊娠品数は最終月経お よび超音波断層法による計測により算出した． 3．GnRHの免疫組織染色 妊娠初期絨毛を採取後，ただちに10％ホルマリ ン溶液に浸し，パラフィン包埋切片を作製した． 免疫組織染色は市販のキット（Vectastein ABC− kit， Vector Laboratories lnc．， U．S．A）を用い， ABC法で行った．抗GnRH抗体はRIAに使用し たものを100倍希釈で用いた． 4．絨毛細胞の培養 妊娠初期絨毛を生理食塩水で数回洗浄して血液 除去後，結合組織を取り除き細切した．1gの絨毛 組織に対し，キレーティングセファロースにて部 分精製したコラゲナーゼ10mg／mlと0．001％ DNase−1を添加したmedium 199中で37℃，20分 インキュベートし，遊離細胞を作製した．遊離細 胞はスチールメッシュにて濾過し未消化の組織を 取、り除き，800×gで10分間遠心後，2回培養液 （medium 199，10％仔牛血清，25mM HEPES， 2mg／ml NaHCO3，0．1mg／ml gentamicin， pH 7．4）にて洗浄した．Hemocytometerにて細胞数 をカウントし，2×105個／m1になるように上記培 養液で調節し，95％air，5％CO2下で2日間培養 後実験に使用した，なお，遊離細胞作製時のトリ パンブルーによるcell viabilityは常時80％以上 であった． 5．GnRH刺激実験 作製した遊離細胞は2日間培養し，仔牛血清を 含まない培養液で細胞を3回洗浄した後，種々の
濃：度のGnRHを単独またはGnRHとGnRHア
ンタゴニストを添加し，3時間95％air，5％CO2 下でインキュベートした．インキュベーション後， 培養液を採取しhCG測定まで一20℃で保存した． 6．性ステロイドホルモンのhCG分泌に与え る影響 性ステロイドホルモンのhCG分泌に与える影 響を見るため，2日培養した絨毛細胞をエストラ ジオール0．01∼10μg／m1またはプロゲステロン 0．1㌻10μg／ml中で24時間インキュベートした． インキュベーション後，培養液を採取しhCG測定 まで一20℃で保存すると共に，細胞を再び培養液 で3回洗浄し10−5MのGnRHを添加後さらに3 時間インキュベートし，培養液中に放出された hCGを測定した． 7．GnRHの性ステロイドホルモン産生におよ ぼす直接影響 GnRHの性ステロイドホルモン産生に及ぼす 直接影響を見るため，絨毛細胞を抗hCG抗体（最 終希釈100倍）存在下，非存在下で10−5MのGnRH と24時間インキュベートし，培養液面のエストラ ジオールとプロゲステロンを測定した． 8．穎粒膜細胞培養および抗kCG抗体の影響 使用した抗hCG抗体がhCGの作用を抑制する かどうかを検討するため，hCGによる穎粒膜細胞 からのエストラジオール分泌に及ぼす抗hCG抗 体の影響を見た．穎粒膜細胞は体外受精時の卵胞 穿刺液より採取し，3日間培養し，牛血清を含ま ない培養液にて3回洗浄後，10単位のhCGを単独 または抗hCG抗体と共に添加し，48時間培養後培 養液中のエストラジオールを測定した． 9．ホルモン測定 GnRHの抗体は，合成GnRHをカルボジイミ ド反応にて牛血清アルブミンに結合したもの（100 μg）を500μ1の生理食塩水に溶解し，等量の Freund’s complete adjuvantと共に懸濁液を作製 し，2週間間隔で計5回家兎（New Zealand White）に免疫した．5回目の免疫終了の2週間後 に家兎耳静脈より採血し，抗血清を採取した．得 られた抗体は最終希釈10万倍でRIAに使用した． RIAは1251−GnRH 10，000cpmと抗体，試料を4℃ で24時間インキュベートし，B， F分離は通常の2 抗体法で行い沈渣の放射活性をガンマーカウン ターで測定し，抗体に対するトレーサーの結合率 を求めた． 妊娠各時期より得られた絨毛組織1gをただち に氷面で生理食塩水で洗浄後，2規定の酢酸にて ホモゲナイズした．4℃で20分遠心分離後，上清 を中和し凍結乾燥し，600μ1のPBS（50mM， pH 7．4）に溶解しGnRHをRIAにて測定した． hCGとプロゲステロンはenzyme immunoas− say（エルモテック，持田製薬，東京）で，エスト ラジオールはenzyme immUnOaSSay（セロザイ ム，セロノジャパン，東京）にて測定した．蛋白 量はBradford法9）により測定した． 10．統計 測定結果の有意差検定ぽStudent’s t検定を用 いた．濃度依存性の検定は最小二乗法により検定 した．GnRH濃度の測定結果はmean±SEで表 示し，絨毛細胞からのhCG分泌は各種薬剤一濃度 あたりtriplicate cultureの平均をmean±SEで 表示した． 結 果 1．絨毛および胎盤組織のGnRHの含有量 絨毛単位重量あたりのGnRHの免疫活性は妊 娠6∼9週では42．5±4．3pg／mg tissue，10∼13週 38．2±4．6pg／mg tissue，14∼24週33．0±4．Opg／ mg tissue，25∼40週22．2±5．Opg／mg tissueで妊 娠初期に最も含有量が多く以後虚数を経るにつれ て減少し，妊娠中期以降では初期のほぼ1／2の含有 量であった（図1）． 2．免疫組織染色によるGnRHの局在 図2に妊娠9週絨毛細胞の抗GnRH抗体によ る免疫組織染色を示す．GnRHはcytotrophob・ lastの細胞質に特異的に染色されているが， syncytiotrophoblastでは糸田胞質は染色されてお らず，一部のouter layerのみ染色された． GnRH のcytotrophoblastでの局在は検討した妊娠6 ∼9週置4標本すべてに認められた．
3．GnRHによるhCG分泌
図3は10−5MのGnRHを添加した時の培養液 中に分泌されたhCGの時間的推移の代表的な一 例を示す．培養液中のhCGはGnRH添加後60分曾 舅 9 翠 玉 δ 50 40 30 20 10 0 認ll、1：1：：纒
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雛“． 舗窮 髪滋 6【9 10國13 14−24 25−40 Gestational weeks 図1 妊娠各週の絨毛および胎盤GnRH含有量 700 600 500 0 400 呈 器 300 200 100 0 （％） ’ ” ！ ” 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 ノ ！ ！ ！ ” ’ − 〆 〆 ！ ！ 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 ノ ’ ’ ’ ” 〆 ’ ノ ノ ’ 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 ！ ！ ！ ノ ’ ！ ’ ！ ！ ！ ！ − 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 ノ ’ ” ！ ’ 〆 ’ 〆 ノ ’ 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 ！ ！ ！ ” ！ ’ ！ ” ！ 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 ’ ノ ” ！ ’ ！ ’ ！ ！ ！ ’ 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 〆 〆 〆 ” ノ ！ ！ ” ！ 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 ノ ノ ノ ノ ノ ’ ！ ’ ！ ！ ” 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 ’ 〆 ’ ” 〆 ！ ！ ！ ’ ノ 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 ノ ノ ！ ！ ！ ノ ’ ！ ！ ！ − 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 ’ ’ ’ ” 〆 ！ ’ ’ ” 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 ！ ！ ノ ！ ！ ノ ！ ’ ノ ノ 一 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 ’ ’ ’ ” − ！ r ” ノ 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 ” ！ ’ 〆 ’、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、〆 〆 ” r − 、 、 、 、 、 、” ！ ！ ！ 〆 ！ ’ ！ ’ ！、 、 、 、 、 ’ ’ ’ ” ！、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、！ ！ ” ノ ’ ’ ” 〆 ’ ！ ノ ノ ノ ！ ノ ” ノ ！ ’ 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 ！ ！ ” 〆 ！ 〆 ！ ！ ！ ’ ！ ’ ’ ’ ” ！ ’ 〆 ’ ！ ！ 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 〆 ” ！ ”A 、 、 、 、 ” ！ ’ 〆 ’A 、 、 、 、 ！ ’ ノ ’ ノ ’ A 、 、 、 、 、 ！ ’ ノ ！ ’ A 、 、 、 、 、 ’ ！ ！ ’ ” ’ ノ ！ ！ ’ ！ 〆 〆 ’ 〆 ’ ！ ’ 〆 ” ノ 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 ノ ’ 〆 ！ ノ ！ A 、 、 、 、 ” − ！ ’ ！ A 、 、 、 、 ノ ’ ノ ノ ノ ’ A 、 、 、 、 ！ ’ ノ ！ ’ A 、 、 、 、 、 ！ ！ 〆 ’ 〆 〆 ノ ！ ！ ’ ” 〆 〆 〆 〆 〆 ’ ” ノ ノ ！ 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 ’ ！ ’ ’ ”、 、 、 、 、 、 ！ ” ！ ノ ノ、 、 、 、 、 ’ ’ ’ ” 〆、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、！ 〆 ’ ” 〆 ！ 〆 〆 〆 ’ ” ！ ’ ” ノ ” ノ ノ ’ ！ ’ ノ ノ ’ 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 ！ ！ ’ ’ ” 〆 ！ ！ ！ ’ ！ ’ 〆 ’ 〆 ’ ！ ’ 〆 〆 ∫ ♂ 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 〆 ’ 〆 ’ 〆 ’ ” ！ ’ 〆 ’ ’ ” ノ ノ ！ ！ ” ノ ’ 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 ！ ！ ！ ！ ” 〆 〆 〆 ’ 〆 ！ ’ 〆 〆 ’ ！ 、 、 、 、 ㌧ 、 ’ ！ 〆 ” 〆 A 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 ノ 〆 ！ ” ！ A 、 、 、 、 、 ノ ’ ノ ！ ノ ノA 、 、 、 、 ’ ’ ” 〆 ！A 、 、 、 、 ’ ’ ’ ” ！A 、 、 、 、 ！ ’ ” 〆 A 、 、 、 、 、 〆 〆 ’ ！ 〆 ’ ！ ！ 〆 ” 〆 ’ ノ ！ ’ ” ノ ノ ’ 〆 ’ ！ ！ ノ ！ ！ ’ 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 丸 、 、 、 、 、 丸 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 ’ ” 〆 ’ A 、 、 、 、 、 I ノ ！ ’ ！ ’ ！ ！ ” ！ A 、 、 、 、 、 Y ！ ” 〆 ’ ノ ノ ’ ノ ノ ’ A 、 、 、 、 I ’ 〆 〆 〆 〆 ’ ” ノ ’ ！ A 、 、 、 、 I ノ ！ ’ 〆 ’ ’ ！ 〆 ” 〆 A 、 、 、 、 m ノ ’ ノ ノ ’ ’ ’ ” 〆 A 、 、 、 、 、 I ’ ノ ！ ’ 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 i 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 ”、 、 、 、 、 、 I ’ ” 〆 ’ A 、 、 、 、 、 f 〆 ！ ノ ノ ’ A 、 、 、 、 、 I ’ ” ！ ’ A 、 、 、 、 、 f ！ ノ ノ ノ ’ A 、 、 、 、 、 I ’ ’ ” 〆 ’ ” 〆 ’ A 、 、 、 、 、 m ！ ！ ’ ！ ． A 、 、 、 、 、 f ” 〆 ’ A 、 、 、 、 、 I ノ ！ ’ ノ A 、 、 、 、 、 f ” 〆 ’ A 、 、 、 、 、 I ！ ” ！ ． ’ ノ ！ ’ ノ ！ A 、 、 、 、 、 Y ！ ’ ！ 〆 ’ A 、 、 、 、 、 h ！ ” ノ A 、 、 、 、 、 Y 〆 ’ ！ 〆 ’ A 、 、 、 、 、 f ノ ！ ” ！ A 、 、 、 、 、 Y ” 〆 〆 ’ @ 、 、 ノ ’ ’ ’ ” A 、 、 、 、 Y ！ 〆 ’ 〆 〆 A 、 、 、 、 I ！ ’ ’ ” A 、 、 、 、 Y ’ 〆 〆 〆 〆 A 、 、 、 、 I ！ ’ ’ ” A 、 、 、 、 Y ’ 〆 ’ 〆 〆 〆 〆 ノ ！ ’ ！ A 、 、 、 、 m ’ ！ ’ 〆 ’ A 、 、 、 、 Y ！ ！ ！ ’ ！ A 、 、 、 、 h ！ ’ 〆 ’ A 、 、 、 、 Y ！ ’ ！ ’ ！ @、 、 、 、 m 一 ！ ’ 〆 4 @、 、 、 、 〆 〆 ’ 〆 ’ ！ @、 、 、 、 、 f ノ ノ ’ ノ ’ A 、 、 、 、 、 Y 〆 〆 〆 〆 ！ @、 、 、 、 丸f ” ノ ノ ！ @、 、 、 、 、 Y 〆 〆 〆 戸 ’ @、 、 、 、 、h ノ ノ ノ ！ @、 、 、 、 、 ’ 〆 ” 〆 A 、 、 、 、 、 I ！ ’ ” A 、 、 、 、 、 f ！ 〆 〆 〆 A 、 、 、 、 、 I ’ ’ ” 「 A 、 、 、 、 、 f ！ ！ ！ ノ A 、 、 、 、 、 I ！ ” 〆 A 、 、 、 、 、
C匿9−8・7・6・5・4
GnRH（log M） 図4 GnRHのhCGの分泌における作用用量曲線 （妊娠12週絨毛細胞） 図2 妊娠9週絨毛のGnRHの免疫組織染色 C：cytotrophoblast， S：syncytiotrophoblast．褐色部 分がGnRH陽性． 2000 ξ 15。。 9 9 睾 100。 6 2 500 0 30 60 90 120 150 180 Time（min） 図3 GnRHのhCG分泌の時間的推移（妊娠12週絨 毛細胞） でコントロールの2倍に増加し，3時間後には投 与10分後の値の約9倍に増加した． 図4は妊娠12週の絨毛培養細胞に種々の濃度の GnRHを添加し，3時間インキュベート後のhCG 濃度を測定したものである．培養液中のhCGは GnRHの濃度依存性に促進され，10−5MのGnRH ．でhCGの最大分泌が得られ，そのEC5。は4．0× 10−7Mであった． GnRHによるhCG分泌反応は， 妊娠6∼12週の絨毛で妊娠週数と共に増加した が，そのEC5。は回数による差はなかった．また， GnRHと3時間インキュベート中の培養液中の エストラジオールとプロゲステロン濃度を測定し たが，有意な上昇は見られなかった． 図5は10−5MのGnRH添加と同時に種々の濃 度のGnRHアソタゴニストを添加し，3時間イン キュベートした時の培養液中のhCG濃度を示し たものである．GnRHアンタゴニストはGnRH によるhCG分泌を濃度依存性に抑制したが， basa1と表示したhCGの基礎分泌以下には抑制 しなかった． 4．hCG分泌に対する性ステロイドホルモンの 影響プロゲステロン添加時のhCG基礎分泌と
GnRH刺激によるhCG分泌を，コントロールに800 冨6・・ 董 ま ξ 400 … 8 200 ＝ 0 O 脚9 −8 −7 冒6 脚5 basal GnRH antagonist（log M） GnRH（1じ5 M） 図5 GnRHアンタゴニス．トのGnRHによるhCG 分泌への影響（妊娠12週絨毛細胞） ＆ 葱 ぢ 9 ε 5 慧 “ ％ で20 100 80 60 40 ％
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一■O− Basal 祠・・磁・… GnRH stim田ated ＆ 器 5 8 Σ 器 § α ，00 80 60 40 20 0 ★Pく0．01VS control1＼庫、脚＿
⊥★ ％ 一〇一 Basal ・・脳鵡…・ GnRH stimulated 図6 control O．1 1．0 10 PrOgeSterone（μ91ml） プロゲステロンのhCG分泌に対する影響 対するパーセントで表示したものが図6である．hCG基礎分泌もGnRHによるhCG分泌もプロ
ゲステロンの濃度依存性に抑制され，プロゲステ ロン10μg／ml添加では両者ともコントロールの ＼ Control O．01 0．1 1 10 Estradiol（μ9／mり 図7 エストラジオールのhCG分泌に対する影響 約50％まで抑制された．一方，エストラジオール は10μg／mlという高濃度においてのみhCG基礎 分泌とGnRHによるhCG分泌を充進させたが， 0．01∼1μg／mlの間ではhCG分泌に変化は見ら れなかった（図7）． 5．性ステロイドホルモン分泌に対するGnRH の直接作用 表に妊娠6∼12週の絨毛細胞を10−5M GnRH と24時間インキュベートした時の培養液中のエス トラジオールとプロゲステロン濃度を示す．．コン． トロールを100とした時，GnRH単独添加ではエ ストラジオ’一ルは128．8±9．1とコントロールに比 較し有意に上昇したが，GnRHと抗hCG抗体同 時添加ではエストラジオール分泌82．5±6．1と， GnRH単独投与よりも有意に低値となった．一 方，プロゲステロンはコントロールを100とする 表 GnRHの性ステロイドホルモソ分泌への影響（基礎分泌を100としたと きのパーセントで表示） 基礎分泌 GnRH単独添加 GnRH＋抗hCG抗体 Estradiol orogesterone 綿（n＝28） 癖串＊（n＝28） P00 128．8±9．1 82．5±6．1 P00 79．3±6．5 51．7±5．8 @ 傘（n＝10） 累＊零（n＝9） 傘p＜0．05 ＊串pく0．01 纏＊p＜0．001§ 琶 語 （ng／mg protein） 12 10 hCG hCG （10LU．） （101．U．） 十 抗hCG抗体 G単独 図8 四四膜細胞からのhCGによるエストラジオー ル分泌に及ぼす抗hCG抗体の影響 と，GnRH単独添加では79．3±6．5とコントロー ルに比べて有意に低下し，GnRHと抗hCG抗体 同時添加ではさらにプロゲステロンの濃度は低下 した． 6．穎粒膜細胞における抗hCG抗体のエスト ラジオール分泌に対する効果 穎粒膜細胞にhCG 10単位を添加すると，24時 間後の培養液中エストラジオール濃度は11．0± LOng／mg proteinであったが， hCGと同時に抗 hCG抗体を添加するとエストラジオール濃度は 2．2±0．7ng／mg proteinに減少した（図8）． 考 案 GnRHは妊娠初期絨毛細胞よりhCGを濃度依 存性に分泌させるが，そのEC5。（4．0×10−7M）は 下垂体細胞からのしH分泌のEC5。に比較し10倍 ほど多い．胎盤からのhCG分泌に比較的多量の GnRHが必要であることは，他の研究者の報告と も一致する10）11）．この原因として胎盤のGnRHの レセプターは下垂体のGnRHレセプターより GnRHに対する親和性が低いためと考えられる． 胎盤のGnRHレセプターはGnRHに対する親和 性が低いだけでなく，その分子量や構造も下垂体 のものとは異なる11）12）．さらに，下垂体のレセプ ターでは，GnRHのスーパーアゴニストとよぼれ る一群のGnRHアナログはGnRHより高い親和 性を示すが13），胎盤のレセプターではGnRHと同 様の低い親和性しか持たない14）．しかしながら， GnRHは濃度依存性に胎盤細胞よりhCGの分泌 を促進し，そのEC5。（4．0×10−7M）は胎盤の GnRHレセプターに対するGnRHの親和性に一 致する（Kd；9．1×10 7M）10）．また， GnRHのア ンタゴニストはGnRHと胎盤のレセプターを競 合し11），本研究より明らかなようにGnRHによる hCG分泌を抑制する．このような事実より，胎盤 に存在するGnRHのレセプターは下垂体性のレ セプターとはその生化学的性状は異なるが，hCG 分泌というGnRHの生物学的作用を仲介する機 能的なレセプターであり，胎盤性GnRHは胎盤か らのhCG分泌調節にこのレセプターを介して関 与していると考えられる． 妊娠中はGnRHに対する下垂体の反応性は抑 制されており15），さらに妊婦1血中のLH， GnRHは 非訟時より低い16）ことより視庄下部一下垂体一卵 巣系は抑制されていると考えられる．視床下部 一下垂体一卵巣の内分泌系は排卵現象に深く関与 しており，妊娠の成立と共にこの内分泌系が抑制 され，妊娠中はそれ以上の排卵が起こらないよう な機構は生体にとって重要と考えられる．また， 胎盤のGnRHレセプターの低い親和性は， para・ crine／autocrine環境下で胎盤のGnRHが作用す るには十分な親和性であるぽかりでなく，視床下 部から末梢に放出されるGnRHによって胎盤か らのhCG分泌が影響されないという利点を持つ と考えられる．
本研究の免疫組織染色で胎盤のGnRHは
cytotrophoblastに局在することが確かめられた が，これは他の研究者17）18）の結果と一致する．胎盤 のGnRHレセプターの局在に関する報告はない が，免疫組織染色でsyncytiotrophoblastの表面 の一部が染色されることや，hCGはsyncytiotro− phoblastから分泌されることなどより，GnRHは syncytiotrophoblastのGnRHレセプターを介し てhCG分泌を促進する， paracrineの分泌機構が 想定される．hCGはsyncytiotrophoblastからの エストラジオールとプロゲステロンの分泌を刺激 すると考えられているが，免疫組織染色でhCGの レセプターはsyncytiotrophoblastとcytotro一phoblastに染色され，妊娠中期ではcytotrophob− lastよりsyncytiotrophoblastに弓螢く染色される ことが報告されている19）．このことは，hCGによ るautocrineのエストラジオールとプロゲステロ ンの分泌機構が存在することを意味する．このよ うに胎盤内に形成されるGnRHの内分泌調節系 はautocrine／paracrineによる調節系であり，従 来のendocrine調節系の概念とは異なっていると 考えられる． 視床下部一下垂体一卵巣系では，視床下部，下 垂体に対して卵巣のエストラジオールによるネガ ティブフィードバック機構が存在する．我々の実 験結果ではエストラジオールは10μg／mlという 高濃：度においてのみhCG基礎分泌， GnRHによ るhCG分泌を二進したことより，胎盤におけるエ ストラジオールはhCG分泌調節機構にはそれほ ど関与していないと考えられる．一方，プロゲス
テロンはhCGの基礎分泌およびGnRHによる
hCGの分泌を濃度依存性に抑制した．hCG分泌に 対するプロゲステロンの抑制作用は他の研究者の 報告とも一致する20）21）．本研究で用いたプPゲス テロンは胎盤組織内濃度と同レベルであり22）生理 学的濃度といえる．このことから，プロゲステロ ンはhCG分泌に対しネガティブフィードバック 機構をもっていると考えられる． 胎盤のGnRH内分泌系では，エストラジオール とプロゲステロンのhCG分泌への調節機構だけ でなく，以下の3つの調節機序について検討が必 要である．すなわち，（1）性ステロイドホルモン のGnRHへのフィード・ミック機構，（2）hCGの GnRHへのフィード・ミック機構，（3）GnRHによ る性ステロイドホルモンへの直接抑制の3つであ る．エストラジオールやプロゲステロンは胎盤か らのGnRHの基礎分泌には影響しないが， cAMP で促進されたGnRH分泌をエストラジオールは さらに促進し，反対にプロゲステロンは抑制する ことが報告されている23）．一方，hCGのGnRH分 泌への影響をみた報告はまだない． コラゲナーゼで処理直後の絨毛細胞は，細胞表 面のレセプターが損傷されており，GnRHによる hCG分泌反応は見られない．したがって， GnRH によるhCG分泌をみるためには数日の培養が必 要である．しかし，遊離細胞作製直後はcytotro・ phoblastとsyncytiotrophoblastが混在するが， 2日間の培養ですべてのcytotrophoblastは syncytiotrophoblastヘトランスフォームしてし まい24），我々の培養系でも2日間の培養後は cytotrophoblastは見られない．免疫組織染色で 明らかなようにsyncytiotrophoblastにGnRH は局在せず，我々の培養系にGnRHアンタゴニス トを添加してもhCGは基礎分泌以下には抑制さ れない．これらの事実より，2日間の培養後には 培養細胞中には内因性のGnRHは存在せず， hCG の基礎分泌には内因性のGnRHは関与していな いと思われる．したがって，培養細胞系を用いた 実験では内因性のGnRHは発現していないため， hCGや性ステロイドホルモンのGnRHに対する 影響を見ることはできないと思おれる． GnRHの胎盤での性ステロイドホルモンへの 影響に関しては，エストラジオールの分泌を促進 さぜるという報告22）25）と，抑制するという報告21） があり，結論が得られていない．また，プロゲス テロンに関しても，GnRHはプロゲステロン分泌 促進に働くという報告22）20）と分泌抑制に働くとい う報告21）26）があり確立されたものはない．胎盤の これらのフィードバック機構の解明には，従来よ り組織培養や細胞培養系を用いて行われてきた が，syncytiotrophoblastからはhCGと性ステロ イドホルモンの双方が分泌されるという胎盤の特 殊性を考慮した上での研究は見られない．GnRH はsyncytiotrophoblastからのhCG分泌を促進 するため，hCGの性ステロイドホルモン分泌への 影響を除かなければGnR｝1のステロイドホルモ ンへの直接効果の正確な分析は不可能である． 我々はGnRHの性ステロイドホルモンへの直接 の影響を見るにあたり，抗hCG抗体を培養液に添 加しhCGの影響を除外した上で実験を行った．用 いた抗hCG抗体がhCGの作用を抑制するかは穎 粒膜細胞を使用して検討した．穎隔膜細胞ではエ ストラジオールの分泌はhCGによって促進され ることは確立されており27），抗hCG抗体の添加に よりhCGによるエストラジオール分泌が抑制されたことより，抗hCG抗体は絨毛細胞でも同様に hCGの作用を中和すると考えられる．絨毛細胞に GnRHを添加するとエストラジオールは上昇す るが，抗hCG抗体とGnRHの同時添加ではこの 作用はなくなる．このためGnRHはhCGを介し てエストラジオール分泌を上昇させるが，．GnRH のエストラジオール直接分泌作用はないと考えら れる．一方，プロゲステロンはGnRH単独投与に よって抑制され，さらにGnRHと抗hCG抗体投 与ではGnRH単独投与よりもさらにプロゲステ ロン分泌は抑制された．これらのことより，GnRH はプロゲステロン産生に関してhCGを介した分 泌促進作用と直接抑制作用の二相性の制御を行 い，逆にプμゲステロンはhCG分泌に関してネガ ティブフィードバック機構を持っていることが推 測される．このGnRHのプロゲステロン分泌抑制 の作用機序としては，ブレグネノロソをプロゲス テロンに変換させる3β一hydroxysteroid dehy− drogenase（3β一HSD）の抑制， hCGによって増加 した細胞中cAMP依存性の経路をGnRHが抑制 することなどが考えられるが詳細は不明であ る21｝． 本研究で示された通り，胎盤の蛋白あたりの GnRH含量は妊娠初；期〉中期〉末；期の順で減少 する．血中のhCGは妊娠初期の9∼10週がピーク であり，以後は減少するという事実を考えると生 体においても胎盤のGnRHがhCGの調節因子と して作用していることが示唆される．一方，in vitroで胎盤組織をGnRHで刺激すると，その
hCG分泌反応は妊娠16∼17週目6∼9週＞
39∼40週目順であり14），必ずしも血中のhCGの ピークとは一致しない．この理由として，単位重 量当たりの胎盤でのプロゲステロン産生は妊娠13 週で最大となり22），このプロゲステロンがhCG分 泌を抑制するためhCG分泌は9∼10週に最大と なることが考えられる． 妊娠黄体からのプロゲステロンの分泌は妊娠の 継続のために必要であることが知られているが， 妊娠の初期ではhCGが黄体からのプロゲステロ ン分泌を促進させていたものが，胎盤でのプロゲ ステロン産生が優位となると，胎盤局所のプロゲ ステロンのネガティブフィードバックにより hCG分泌は抑制され，以後の黄体からのプロゲス テロン分泌は減少していくボこのように胎盤にお けるプロゲステロンのネガティブフィードバック 機構は妊娠黄体から胎盤へのプロゲステロン産生 の切り替えに重要な役割を果していることが推測 される． 胎盤からのGnRH分泌に関しては，アクチビ ン28）やプロスタグラソジソ，エピネフリソ29）など の関与が報告されているが，これらとhCG，性ス テロイドホルモンとの関係は不明である． 今まで述べてきた，胎盤内のGnRH調節系を他 の研究者の報告も交えて図9に総括した．すなわ ち，胎盤のGnRHはcytotrophoblastに限局し， 胎盤内のアクチビソ，プロスタグランジソ．エピ ネフリソなどにより産生が前進する．このGnRH がsyncytiotrophoblastのGnRHレセプターに 作用し，syncytiotrophoblastよりhCG分泌を促 進する．分泌されたhCGは，． autocrine機構によ り同じくsyncytiotrophoblastからのエストラジ オール，プロゲステロンの分泌を促す．一方，プ ロゲステロンはhCGの基礎分泌ならびにGnRH によるhCG分泌に対し，ネガティブフィードバッ ク機構を持ち，hCG分泌を抑制すると共に胎盤の GnRHの産生も抑制する．本研究では明確な結果 は得られなかったが，他の研究者の報告ではエス トラジオールはhCGの分泌およびGnRHの産生 Activln Prostaglandin 「 EρiRθPhr響肥 畢 Estradio■ Progesterone → 促進 一・・レ 抑制 →未確認 図9 胎盤におけるGnRH−hCG一性ステロイドホル 1モンの調節機構に関してポジティブフィードバック機構を有する とざれるが，プロゲステロンに比べ生理学的意義 は少ないと考えられる． 以上より，胎盤性GnRHは生体内において hCGの分泌を調節していると考えられるが， GnRHの他にいくつものホルモンが胎盤からの hCG分泌を促進30）または抑制23）31）することが知．ら れており，GnRHだけがhCGのregulatorとは考 えにくいという指摘がある．これら未解決の問題 は将来の研究に待たなけれぽならない． 結 論 ．1．胎盤組織中のGnRHの濃度は妊娠初期に高 く，以後減少した． 2．免疫組織染色においてGnRHはcytotro・ phobiastに局在した． 3．妊娠初期ヒト絨毛培養細胞．からGnRHは濃 度依存性にhCG分泌を促進し， GnRHアンタゴ ニストはその作用を濃度依存性に抑制した．
4．プロゲステロンはhCGの基礎分泌も
GnRHによるhCG分泌も濃度依存性に抑制し
た． 5．エストラジ．オールはhCGの基礎分泌も GnRHによるhCG分泌に対しても有意な作用を 示さなかったが，高濃度においてのみ両者の分泌 を促進した． 6．GnRHは絨毛培養細胞からのプロゲステロ ンの分泌を直接抑制するが，エストラジオールに 対しては直接作用．はなく，hCGを介した分泌促進 作用のみであった． 稿を終えるにあたり，ご指導を賜りました武田佳彦 教授に心より深甚の謝意を表します．また，直接ご指 導くださいました岩下光利助教授にも謝意を表しま す． 本論文の要旨は第17回日本内分泌学会神経内分泌 分科会および第1回国際周産期学会において発表し た． 文 献 1）岩下光利，安達知子，渡辺正子ほか：胎盤の内分 泌調節．臨床婦人科産科 43：1063−1069，1989 2）Gibbons JM，］Mlitllick M， Chieffo B二 In vitro biosynthesis of TSH−and LH・releasing factors by the human placenta． Am J Obstet Gynecol 121 ：127−131， 1975 3）Siler−Khodr TM［， Kbodr GS： Content of luteinizing horrnone・releasing factor in the human placenta． Am J Obstet Gynecol 130： 216−219， 1978 4） I」ee J， SepPala M， Chard T： Characterization of placental luteinizing hormone releasing factor・董ike material． Acta Endocrinol 96： 394−397， 1981 5）Khodr GS， Siler．Khodr TM： The effect of luteinizing hormone・releasing factor on human chorionic gonadotropin secretion． Fertil Steril 30 ：301−304， 1978． 6）Takemori M， Nishimura R， Tojo S et ai： Release of human chorionic gonadotropin ．（hCG）and its alpha・subunit（hCG一．α）from per・ ifused human placenta． Endocrinol Jpn 28： 757−768， 1981 7）Butzow R：Luteinizing ho㎜one−releasing factor increases release of human chorionic gonadotropin in isolated cell columns of nor− m．al and malignant trophoblasts． Int J Cancer 29：9−11， 1982 8）SileトKnodr TM， Khodr GS：Dose response analysis of GnRH stimulation of hCG release from human亡erm placenta． Biol Reprod 25： 353−358， 1981 9）Bradford MM：Arapid and sensitive methQd for the quantita㌻ion of microgram quantities of prote董n utilizing the pr董nciple of protein・dye binding． Anal Biochem 72：248−254，1976 10）Matialagan N， Rao J；Gonadotrop三n relea− sing hormone（GnRH）stimulates both secretion and synthesis of human chorionic gonadotropin （hCG）by first trimester human placental minces in vivo． Biochem Int 13：757−765，1986 11）Iwaskita M， Evans MI， Catt KJ：Characteri・ zation of gonadotroP加一re】easing hormone rece− ptor site．in term placenta and chorionic viUil J CIin Endocrinol Metab 62：127−133，1986 1乞）Curr三e AJ， Fraser HM， Shape RM：Human Placenta1．receptσrs for luteinizing hormone releasing hormone． Biochem Biophys Res Com− mun 99：332−338，1981 13）αayton R］M， Catt KJ： Gonadotropin・ relea…虹ng hormone receptors：Characterization， physio互ogical regulation， and relationship to reproductive function， Endocrinol Rev 2： 186∼209， 1981 14）Siler・Khodr TM， Khodr GS， Rhode J et a監： Gonadotropin・releasing hormone effects onplacental horrr}ones during gestation ; I. human chorionic gonadotropin, human
ionic gonadotropin and human chorionic
somatomammotropin. Biol Reprod 34 I 245-254, 1986
15) Reyes FI, Winter JSD, Faiman C: Pituitary gonadotropin function during human nancy : Serum FSH and LH levels befor and after LHRH administration. J CIin Endocinol Metab 421590'592, 1976
16) Makino T, Iwashita M, Iizuka R: Study on blood levels of luteinizing hormone beta subunit and LH-releasing factor in pregnant women. Keio J Med 29 I 141-151, 1980
17) Miyake A, Sakumoto T, Kurachi K et al:
Changes in luteinizing hormone-releasing tnone in human placenta throughout nancy. Obstet Gynecol 60:444un449, 1982
18) Khodr GS, Siler-Khodr TM : Localization of luteinzing hormone-releasing factor in the human placenta. Fertil Steril 29 : 523-526, 1978
19) Reshef E, Lei ZM, Luborsky JL 'et al: The presence of gonadotropin receptors in pregnant human uterus, human placenta, fetal membranes, and decidua. J CIin Endocrinol Metab 70:421-430, 1990
20) Wilson EA, Jawad MJ, Dickson LR:
presion of human chorionic gonadotropin by progestational steroids. Am J Obstet Gynecol 15:708-713, 1980
21) Branchaud CL, Goodyer CG, Lipowski LS :
Progesterone and estrogen production by
placental monolayer cultures: Effect of droepiandrosterone and luteinizing releasing hormone. J CIin Endocrinol Metab 56:761-766, 1983
22) Siler-Khodr TM, Khodr GS, Rhode 'J et al: Gonadotropin-releasing hormone effects on placental hormones during gestation: II. Progesterone, estorone, estradiol and estriol. Biol Reprod 34:255-264, 1986
23) Petraglia F, Vaughan J, Vale W: Steroid
hormones modulate the release of reactive gonadotropin-releasing hormone from cultured human placental cells. J CIin crinoi Metab 70l1173-l178, 1990
24) Kliman HJ, Nestler JE, Strauss JF: Purification, characterization, and in vitro differentiation of cytotrophoblasts from human term placentae. Endocrinology 118 l 1567-1582, 1986
'25) Malik A,･ Kaul S, Das C : The effect of
'
izing hormone releasing hormone and luteinizing hormone releasing hormone bodies on chorionic gonadotropin and terone secretion by human placental villi in vitro. J Biosci 10:67-74, 1986
26) Wilson EA, Jawad MJ: Luteinizing
hormone-releasing hormone suppression of human placental progesterone production. til Steril 33:91-93, 1980
27) Hsueh AJW, Adashi EY, Welsh TH et al:
Hormonal regulation of the differentiation of cultured ovarian granulosa cells. Endocr Rev 5I76-127, 1984
28) Petragria F, Vaughan J, Vale W: Inhibin and activin modulate release of GnRH, hCG and progesterone from cultured human placental cells. Proc Natl Acad Sci USA 86 l 5114-5117, 1989
29) Petragria F, Lin ATW, Vale W: Adenosine 3',5'-monophosphate, prostaglandins and epinephrine stimulate the secretion of reactive gonadotropin-releasing hormone from cultured human placental cells. J CIin crinol Metab 65l1020-1025, 1987
30) Lai WH, Guyda HJ: Characterization and
regulation of epidermal growth factor ptors in human placental cell cultures. J CIin Endocrinol Metab 58:344-352, 1984
31) Yuen BH: Inhibition of human chorionic
gonadotropin production by prolactin from term human trophoblast. Am J Obstet Gynecol 154 l 336-340, 1986
