末梢血単核球（

秋 田 医 学

Akita J Med 36 : 81

^-

89, 2009

（9）

末梢血単核球（PBMC）を用いた微小変化型ネフローゼ症候群

（MCNS）および全身性エリテマトーデス（SLE）の病因の解析*

小松田   敦

秋田大学大学院医学系研究科血液・腎臓・膠原病内科学講座

（平成

21

年

5

月

1

日掲載決定）

Analysis of mRNA in peripheral blood mononuclear cells from patients with minimal change nephrotic syndrome and systemic lupus erythematosus

Atsushi Komatsuda

Department of Hematology, Nephrology, and Rheumatology, Akita University Graduate School of Medicine, Akita 010

^-

8543, Japan

キーワード

: CCL13, HSPC159, MCNS, realtime PCR, SLE, TRAIL

1.

 は じ め に

 ネフローゼ症候群は，大量の蛋白尿により低蛋白血 症となり，その結果浮腫や高脂血症を生じる病態であ る．その原因は多彩で，原因が明らかでない原発性ネ フローゼ症候群と，他の全身性疾患から引き起こされ る続発性ネフローゼ症候群に大別される．近年，分子 生物学的手法により原発性ネフローゼ症候群の中の先 天性ネフローゼ症候群で，糸球体上皮細胞や足突起間 のスリット膜に発現している

nephrin，podocin，ac- tinin

^-

4

や

CD2

関連蛋白などの遺伝子異常がネフロー ゼ症候群の原因になることが次々と報告され，これら の蛋白質が糸球体濾過バリアの維持に重要であること が明らかとなってきている．一方，後天性の微小変化 型ネフローゼ症候群（MCNS）は，腎臓病理学的に糸 球体の変化が微小であり，ステロイド薬が奏功する疾 患である．その病因として，末梢血リンパ球が糸球体 基底膜透過性亢進因子を産生し糸球体濾過バリアを破

綻するためと考えられているが，その因子は未だ不明 である（図

1） ^1,2）

．

 全身性エリテマトーデス（SLE）は，皮膚病変がオ オカミに噛まれた痕のような紅斑であることから紅斑 性狼瘡

: lupus erythematosus

と呼ばれていた．

1851年 ,

フランスの皮膚科医

Kaposi

が，皮膚だけでなく全身 の臓器を侵す全身性の疾患として

systemic lupus ery- thematosus

を報告した．1948年，Hargravesらにより

SLE

患者の血中に

LE

細胞が見だされ，1957年には

Friou

らにより抗核抗体が発見された

^3）

．それ以来，

免疫異常が病態形成に重要な役割を持つと考えられ，

病態・病因の解明のため免疫学的検討が続けられてい る．現在まで報告されている病因は多岐にわたり，末 梢トレランスの破綻やリンパ球のアポトーシス不全に より自己抗体が産生され，免疫複合体（IC）の沈着や 排除障害で組織が障害されるが，それらの詳細はなお 不明である

^4,5）

．

 我々は，MCNSと

SLE

の病因・病態の背景に患者 末梢血単核球（PBMC）の異常があることを想定し，

患者

PBMC

を用いて

MCNS

や

SLE

の病因の検討を 行っている．本稿では，秋田医学会学術賞講演での講 演内容を中心に，これまで我々が見だした

MCNS

と

SLE

の病因に関する知見について概説する

^6-8）

．

Correspondence : Atsushi Komatsuda

Department of Hematology, Nephrology, and Rheumato- logy, Akita University Graduate School of Medicine, 1

^-

1

^-

1 Hondo, Akita 010

^-

8543, Japan

Tel : 81

^-

18

^-

884

^-

6116 Fax : 81

^-

18

^-

836

^-

2613

E

^-

mail : [email protected]

^-

u.ac.jp

*第 19

回秋田医学会学術賞

Akita University

2. MCNS

の病因について

 MCNSの病因は未だ明らかでないが，MCNS患者 の

PBMC

と

T

細胞のハイブリドーマを作製し，その 分泌物をラットに投与したところ蛋白尿を来したこ と

^9）

，MCNS患者の血清をラットの糸球体上皮細胞の 単層培養に添加したところ，アルブミンの透過性が亢 進したこと

^10）

，難治性

MCNS

患者の死体腎臓

2

個を

2

人のレシピエントに移植したところいずれのレシピエ ントでも蛋白尿が改善した症例報告

^11）

などから，末 梢血単核球，特に

T

リンパ球から糸球体基底膜透過 性亢進因子が産生され糸球体濾過バリアを破綻すると 考えられている．

 この未知の因子を同定するため，2例の

MCNS

患 者のネフローゼ期と寛解期の

PBMC

を採取し，それ ぞれの遺伝子発現を

24,446

遺伝子が含まれる

cDNA microarray

を用いて比較検討した．その結果ネフロー ゼ期に

2

倍以上過剰発現している遺伝子が

171

個認め られた． それらは主に転写因子，サイトカインや炎 症に関連する遺伝子であった（表

1）．それらの中から，

血清中に分泌されると予想される

chemokine ligand 13

（CCL13）と ガレクチン関連蛋白質（HSPC159また

は

GRP）を選択した．

 MCNS 24例のネフローゼ期と寛解期，ネフローゼ 期の膜性腎症（MN）10例，正常コントロール群

24

人から

PBMC

を分離し，各々

mRNA

を抽出し

cDNA

を作成した．CCL13と

HSPC159

特異的プライマーを それぞれ作成後，それらを用いて

real

^-

time PCR

法で

CCL13

と

HSPC159 mRNA

を 定 量 化 し た．CCL13と

HSPC159 mRNA

値 と 正 常 コ ン ト ロ ー ル 群 の 差 を

Mann

^-

Whitney U

^-

test

で検討した．

CCL13

と

HSPC159

はともに，MCNSのネフローゼ期で寛解期より有意 に発現が亢進していた（図

2, 3）．次にネフローゼ期

の

MCNS

群 と，MN群， 正 常 コ ン ト ロ ー ル 群 で の

PBMC

における

CCL13

と

HSPC159

の発現量を比較 検討した．ネフローゼ期の

MCNS

患者群で，MN群，

正常コントロール群に比較して

CCL13

と

HSPC159

の有意な発現亢進が認められた（図

4， 5）． 以上より，

CCL13

と

HSPC159

はネフローゼ期

MCNS

の

PBMC

に特異的に発現が亢進していることが明らかになっ た

^5）

．

 CCL13遺伝子は，染色体

17q11.2

にあり，monocyte

chemoattractant protein

^-

4（MCP

^-

4）とも呼ばれてい

る

^12,13）

．樹状細胞，内皮細胞，気道上皮細胞に発現し，

図

1. 微小変化型ネフローゼ症候群（MCNS）の病因

秋 田 医 学 （11）

アトピー性皮膚炎や気管支喘息などのアレルギー性疾 患との関連が報告されている

^14,15）

．以前から

MCNS

の 発症にアレルギーが関連することが報告されており，

MCNS

における

CCL13

の発現亢進もアレルギー反応 に関連している可能性を示唆していると考えられる．

 HSPC159の機能は明らかでないが，新規のガレク チンファミリーの一つである

^16）

．ガレクチンファミ リーは免疫調節や

Th1/Th2

バランスに関連すること が報告されている

^17）

．ガレクチンファミリーは

3

つの グループに分類されている．第

1

のグループは，糖鎖 と結合する部分（糖鎖結合ドメイン

: carbohydrate recognition domain, CRD）を 1

つ持っているプロトタ イプ（proto^-

type），2

番目は

1

個の糖鎖結合ドメイン に糖鎖とは結合しない別のドメインが繋がった構造を 持つキメラタイプ（chimera^-

type），3

番目は

2

つの糖 鎖結合ドメインから成るタンデムリピートタイプ

（tandem^-

repeat

^-

type）である．HSPC159

は第

1

グルー

プに属する．第

1

グループの機能として，活性化

T

細胞のアポトーシス誘導，細胞増殖，mRNAスプラ イシング神経軸索の再生（酸化型

Galectin

^-

1），アレ

ルギー反応の関与が報告されている．

 今後は，CCL13と

HSPC159

の遺伝子発現亢進と

MCNS

発症との直接的な因果関係を明らかにするた め，蛋白質レベルで

CCL13

や

HSPC159

が直接糸球 体上皮細胞を障害するのか，免疫反応にいかに関連す るのか，検討を進める予定である．

3.

 

SLE

の病因について

 SLEの病因に関しては，遺伝的因子，内分泌的因子，

免疫学的因子および環境因子が複合的に関連し発症す る，多因子疾患と考えられている．免疫学的因子には，

細胞障害性

T

細胞の低下やヘルパー

T

細胞の増加，B 細胞の活性化および自己抗体産生の亢進，アポトーシ

表

1. ネフローゼ期の MCNS

で高発現している遺伝子

Gene Name Symbol Gene expression ratio

（onset or relapse/remission）

Signal transduction

Colony stimulating factor 1

（macrophage）

CSF1 2.75

Cyclin A2 CCNA2 2.58

Cyclin B2 CCNB2 2.84

Cyclin D1 CCND1 2.52

Cyclin K CCNK 2.40

Glucocorticoid receptor NR3C1 2.68

Mitogen

^-

activated protein kinase kinase kinase 12 MAP3K12 2.11

Mitogen

^-

activated protein kinase kinase kinase kinase 1 MAP4K1 2.37

Peptidylprolyl isomerase C

（cyclophilin C）

PPIC 2.80

Phospholipase A2, group IIA PLA2G2A 2.24

Phospholipase C, beta 4 PLCB4 2.62

Protein kinase

（cAMP^-

dependent, catalytic） inhibitor gamma PKIG 2.44

Protein kinase, AMP

^-

activated, gamma 1 PRKAG1 2.34

Protein kinase, cAMP

^-

dependent, regulatory, type II, beta PRKAR2B 2.48

Protein kinase, cGMP

^-

dependent, type I PRKG1 2.20

Rho guanine nucleotide exchange factor 17 ARHGEF17 2.76

Chemokine

（C^-

C motif） ligand 13 CCL13 2.38

Cytokines/inflammmation

Galectin

^-

related protein, HSPC159 HSPC159 2.11

Interleukin 1, alpha IL1A 3.22

Interleukin 6 receptor IL6R 2.30

Platelet

^-

derived growth factor beta polypeptide PDGFB 2.41

Akita University

図

2. MCNS

症 例 に お け る 発 症 期 と 寛 解 期 の

CCL13 mRNA

の発現

図

3. MCNS

症 例 に お け る 発 症 期 と 寛 解 期 の

HSPC159 mRNA

の発現

図

4. MCNS

症例，膜性腎症症例および健常者の

CCL13 mRNA

の発現

図

5. MCNS

症例，膜性腎症症例および健常者の

HSPC159 mRNA

の発現

秋 田 医 学 （13）

ス細胞や細胞の残骸の除去不全などの単球系の機能障 害など，多くの異常が報告されている

^4,5）

（図

6）．

 TNF^-

related apoptosis

^-

inducing ligand

（TRAIL）は癌 細胞には

apoptosis

を来たすが，正常細胞には起こさ ない

^18）

．この性質から，癌治療に有望な薬剤として期 待されている．一方，TRAILと

SLE

との関連として，

SLE

患者の

PBMC

の

TRAIL mRNA

発現が亢進してい

る

^19,20）

，血清中の

TRAIL

濃度が上昇している

^21,22）

，T

cell

の表面に

TRAIL

の発現が亢進している

^23）

，血清中 の

TRAIL

濃度と末梢血好中球数が相関する

^24）

，こと が報告されており，TRAILが

SLE

の病態に関連する と考えられている．

 一方，Toll^-

like receptor

（TLR）は，病原体（細菌，

ウイルス等）の認識に必須の受容体で，細菌の脂質や 蛋白質，ウイルスの

RNA

や

DNA

を認識し，自然免 疫に重要な役割を持つ

^25）

．哺乳動物では

12

種類の

TLRs

がある．また，TLRsを介したシグナルにより，

炎症性サイトカインおよび補助機能分子の発現を誘導

し，自然免疫系活性化から獲得免疫系活性化への橋渡 しをし，後天性免疫や自己免疫疾患にも深く関与する ことが報告されている

^26）

．病原体の構成成分である

lipopolysaccaroid（LPS）や CpG DNA

などは，樹状細 胞上の

TLRs

を刺激し，炎症性サイトカインおよび補 助機能分子が，提示された抗原とともに

T

細胞を活 性化させ

Th1

細胞への分化を誘導することも報告さ れている．SLEでは

TLRs

の刺激で自己反応性

B

細 胞 や 樹 上 細 胞 が 活 性 化 さ れ， 動 物 モ デ ル で は

TLR

^-

7,

^-

9

の発現亢進で

SLE

が発症すること

^26,27）

，

ヒト SLE

で は

PBMC

の

TLR

^-

9

の 発 現 が 亢 進 し， 血 清

IFN

^-

α

や

γ

の高値が認められる

^28,29）

．

 以上から，TRAILや

TLRs

が

SLE

の病態と関連す る こ と が 示 唆 さ れ て い る が，PBMCの

TRAIL

や

TLRs

の

mRNA発現量と SLE

の臨床症状，活動性，デー タとの関連は明らかでない．そこで，治療前の活動性

SLE

患者の PBMCにおける

TRAIL

と

TLRs

の

mRNA

発現量を

real

^-

time PCR

法で定量化し，SLEの臨床症

図

6. 全身性エリテマトーデス（SLE）の病因

Akita University

状，活動性，データと比較し，SLEとの関連を検討 した ．

  治 療 前 の

SLE

患 者 か ら

PBMC

を 分 離 し， 各 々

mRNA

を 抽 出 し

cDNA

を 作 成 し た．TRAILお よ び

TLRs

特異的プライマーをそれぞれ作成後，それらを 用 い て

real

^-

time PCR

法 で

TRAIL

と

TLRs

の

mRNA

を定量化した．TRAILおよび

TLRs mRNA

値と正常 コントロール群の差を

Mann

^-

Whitney U

^-

test

で検討し た．TRAILおよび

TLRs mRNA

値と

SLE

活動性（SLE

disease activity index, SLEDAI ^30）

）と血清学的データの 相関を

Spearman’s correlation

法で検討した．

 結果として，SLE症例はコントロール群に比較し，

PBMC

の

TRAIL mRNA

の発現亢進が認められた（表

2）．PBMC

の

TRAIL mRNA

発現量と

SLE

活動性およ び血清免疫複合体（IC）値との正相関が認められた（図

7, 8）．

 TRAILは

apoptosis

に関連する分子だが，これまで 活動性

SLE

患者

PBMC

の

TRAIL mRNA

発現量と疾 患活動性（SLEDAI）の関連性の報告はない．我々は，

活 動 性

SLE

患 者

PBMC

の

TRAIL mRNA

発 現 量 が

SLEDAI

や

IC

値と正相関することを初めて見出した．

その機序として，高発現した

TRAIL

が貪食細胞機能 を抑制することにより

IC

の処理を障害し，SLEの病 態の悪化・持続に関連する可能性を示した（図

6）．

 TLRsの検討では，SLE症例はコントロール群に比 較し，

PBMC

の

TLR

^-

2，

^-

7，

^-

9, および IFN

^-

α

の

mRNA

図

7. SLE

症 例 に お け る

TRAIL mRNA

発 現 量 と

SLEDAI

との相関

図

8. SLE

症例における

TRAIL mRNA

発現量と血

清免疫複合体値との相関

表

2. TRAIL

と

TLRs mRNA 発現（control vs SLE patients）

Control SLE P value*

TRAIL 0.143±0.06 0.281±0.13 0.004

TLR2 0.082±0.045 0.119±0.058 0.019

TLR3 1.801±2.137 2.609±2.069 0.089

TLR4 3.035±1.505 4.407±2.239 0.051

TLR5 0.243±0.184 0.269±0.132 0.279

TLR7 1.365±1.171 1.872±0.756 0.011

TLR8 3.658±1.854 3.473±1.985 0.741

TLR9 1.477±1.883 2.791±1.914 0.007

IFN

^-

alpha 0.037±0.045 0.069±0.059 0.033

Abbreviations : TRAIL ; tumor necrosis factor

^-

related apoptosis

^-

inducing ligand, TLR ; toll

^-

like receptors, IFN ; interferon

*P value was estimated by Mann

^-

Whitney U

^-

test.

秋 田 医 学

の発現亢進が認められた（表

2）．PBMC

の

TLR

^-

3，

-

5，

^-

7，

^-

8，

^-

9

の

mRNA

発現量と

IFN

^-

α

の

mRNA

発 現量に正相関が認められた （表

3）．

 PBMCの

TLR

^-

9

と

IFN

^-

α

の

mRNA

発現量と抗

ds

^-

DNA

抗体価とに負の相関が認められた（図

9, 10）．

以上より，SLE群はコントロール群に比較し，PBMC での

TLR

^-

2，

^-

7，

^-

9

および

IFN

^-

α

の

mRNA

発現が亢 進することを見いだした．また，TLR^-

3，

^-

5，

^-

7，

^-

8，

-

9

と

IFN

^-

α

の

mRNA

発現量が正相関し，SLEでは

TLRs

の刺激が

IFN

^-

α

の発現亢進に寄与し，高発現し た

IFN

^-

α

が

SLE

の自己反応性

B

細胞を活性化し自己 抗体産生を促進する病態に関連すると考えられる．一 方，TLR^-

9

と

IFN

^-

α

の

mRNA

発現量が抗

ds

^-

DNA

抗 体価と負相関することを見出した．この機序として，

SLE

の活動期，自己の細胞から放出された

DNA

の刺

激 で

TLR

^-

9

や

IFN

^-

α

の 発 現 が 亢 進 し， ま た 抗

ds

^-

DNA

抗体価も上昇する．その上昇した抗

ds

^-

DNA

抗 体と

free DNA

が結合し，血中の

free DNA

が減少する ため

TLR

^-

9

と

IFN

^-

α

の

mRNA

発現量が低下すると考 えた．

 以上より，活動性

SLE

症例

PBMC

では

TRAIL

や

TLRs

の

mRNA

の発現亢進が認められ，それらの発現 量が

SLEDAI

や検査値と相関することから，それらが

SLE

の病態に重要な役割を持つことが示唆された．

4. ま と め

 PBMCを用いた

MCNS

および

SLE

の病因について，

我々の研究成果を中心に概説した．MCNSの原因物 質は未だ同定されておらず，また

SLE

の病因も多岐 にわたるが，今後も病因の本質に迫る研究を進めたい と考えている．

5. お わ り に

謝辞

 本研究のご指導とご協力をいただきました血液・腎 臓・膠原病内科学分野の澤田賢一教授，涌井秀樹准教 授，並びにともに診療を行い研究活動に協力いただい た腎臓グループの皆様，検体の処理，real^-

time PCR

の測定等にご協力いただいたバイオセンター岩本恵子 氏，血液・腎臓・膠原病内科学分野研究室職員の方々 に感謝の意を表します．

表

3. SLE

における

IFN

^-

α mRNA

発現量と

TLRs mRNA

の発現量との相関

Result of Spearman’s correlation

P value r

TLR2 0.089 0.381

TLR3 4.45×10

⁻⁵

0.770

TLR4 0.129 0.342

TLR5 0.002 0.626

TLR7 0.014 0.528

TLR8 0.005 0.584

TLR9 0.001 0.645

A b b re v i a t i o n s : T L R ; t o l l

^-

l i ke re c e p t o r s , IFN ; interferon

図

9. SLE

症例における抗^-

ds DNA

抗体値と

TLR9 mRNA

発現量との相関

図

10. SLE

症例における抗^-

ds DNA

抗体値と

IFN

^-

α mRNA

発現量との相関

（15）

Akita University

参 考 文 献

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Akita University