PCR 法にて診断し得たマラリア重複感染の 2 症例 1）

序 文

マラリアは熱帯，亜熱帯地域ではいまだ流行が 多く重要な感染症である．本邦でも，熱帯地域か らの輸入マラリア症例が増加し，年間 120 例前後 の患者が発生している

．マラリアの診断は， 従来 より，血液塗抹標本の鏡検によってなされている が，予防内服後に発症した例やマラリア原虫の感 染率が低い症例においては，鏡検での原虫の検出 が困難なこともある．また，複数種のマラリア原 虫が重複感染している場合には，その診断に熟練 を要する．近年， 抗原検出キット

や PCR 法

の 開発により，分子生物学的にマラリア診断が可能 となった．

今回，我々は，4 種のマラリア原虫それぞれに特 異的な primer を用いた nested-PCR 法を用い る ことにより診断しえた 4 日熱マラリアと 3 日熱マ ラリアおよび熱帯熱マラリアと卵型マラリアの重 複感染 2 症例を経験したので報告する．

症 例

1 症例：31 歳 男性，沖縄県出身．

主訴：発熱，倦怠感．

既往歴：特になし．

家族歴：特になし．

生活歴：喫煙歴なし，飲酒歴なし．

現 病 歴：2001 年 4 月 か ら 5 月 に か け て カ メ

ルーンに 3 週間，ケニアに 1 週間，インドに 1 日 滞在した．旅行中から帰国後 2 週間までの間はド キシサイクリンを内服していたが，各地で蚊に刺 されたとのことであった．7 月 4 日より微熱が出 現，7 月 7 日より 48 時間おきに 39〜40℃ 台の発 熱を認めたため， 7 月 11 日， 当院救急外来受診，

末梢血薄層塗抹標本で Schu ! ffner 斑点を認めるマ ラリア原虫が認められたため，3 日熱マラリアと 診断され，当科へ入院となった．

入院時現症：身長 171.0cm 体重 73.6kg，脈拍 80

回 " 分，呼吸数 26 回 " 分 血圧 110 " 60mmHg 体温

39.2℃，眼球結膜黄疸なし，眼瞼結膜貧血なし，頸 部リンパ節腫脹なし，呼吸音異常なし，心雑音聴 取せず，腹部は平坦で軟．

入院時検査所見（Table 1） ：CRP の軽度上昇以 外は異常は認められなかった．当医学部寄生虫学 教室での末梢血塗抹標本の検査で，原虫は Plasu- modium vivax と同定された．

入院経過：臨床経過および血液塗抹所見から 3 日熱マラリアと診断し，クロロキンの投与を開始 した．投与後より徐々に解熱していき，24 時間で 原虫も陰性化した．末梢血から抽出した DNA を 用いて nested-PCR を施行した結果 P. vivax およ び P. malariae が陽性となり 3 日熱マラリ ア と 4 日熱マラリアの重複感染と診断した．その後の経 過は良好で，外来でプリマキンの追加投与を行っ た．以後，再発は認めていない．

PCR 法にて診断し得たマラリア重複感染の 2 症例

1）琉球大学医学部第一内科，^2）寄生虫学教室

原永 修作

明石 学

屋良さとみ

當山 雅樹

當山 真人

伊志嶺朝彦

宮良 高維

新里 敬

比嘉 太

健山 正男

斎藤 厚

當眞 弘

（平成 14 年 4 月 2 日受付）

（平成 14 年 5 月 1 日受理）

別刷請求先：（〒903―0215）沖縄県西原町上原 207 番地

琉球大学医学部第一内科 原永 修作

Key words： malaria, mixed infection, PCR

Table  1 case1 laboratory data on admission

Serological test Hemogram

 mg/dl 3.38  /µl CRP

4,800 WBC

 mg/dl 1,710 IgG

 % 1.0 stab

 mg/dl 302 IgA

 % 81.0 seg

 mg/dl 275 IgM

 % 1.0 eosin

Blood smear  %

1.0 baso

 Plasmodium vivax positive  %

9.0 lym

Antigen detection test  %

7.0 mon

ICT malaria p.f. negative  /µl

RBC  492 × 10⁴  g/dl 14.6 Hb

 % 42.2 Ht

 /µl Plt     11.6 × 10⁴

 mm/hr 15 ESR

Blood chemistory  g/dl 7.2 TP

 g/dl 4.4 Alb

 mg/dl 1.1 T. bil

 IU/l 19 AST

 IU/l 23 ALT

 IU/l 206 LDH

 IU/l 197 ALP

 IU/l γ-GTP 34

 mg/dl 12 BUN

 mg/dl 0.94 Cre

 mEq/l 139 Na

 mEq/l 3.6 K

 mEq/l 102 Cl

 mg/dl 134 GLU

Table  2 case 2 laboratory data on admission

Serological test Hemogram

 mg/dl 3.38  /µl CRP

4,800 WBC

 mg/dl 2,690 IgG

 % 1.0 stab

 mg/dl 499 IgA

 % 58.0 seg

 mg/dl 247 IgM

 % 0.0 eosin

Blood smear  %

1.0 baso

Plasmodium negative  %

30.0 lym

Antigen detection test  %

11.0 mon

ICT malaria p.f. : positive  /µl

RBC  275 × 10⁴  g/dl 8.9 Hb

 % 27.3 Ht

 /µl Plt     20.5 × 10⁴

 mm/hr 98 ESR

Blood chemistory g/dl 7.8 TP

g/dl 3.9 Alb

mg/dl 1.4 T.bil

 IU/l 53 AST

 IU/l 96 ALT

 IU/l 816 LDH

 IU/l 324 ALP

 IU/l γ-GTP 83

 mg/dl 9 BUN

 mg/dl 0.49 Cre

 mEq/l 132 Na

 mEq/l 4.8 K

 mEq/l 99 Cl

 mg/dl 108 GLU

症 例

2 症例：54 歳 女性，大学講師．

主訴：発熱，倦怠感．

既往歴：平成 5 年 3 日熱マラリア，平成 6 年 3 日熱・熱帯熱マラリア重複感染．

家族歴：特になし．

生活歴：飲酒歴；缶ビール 2 本 ! 日，喫煙歴な し．

現 病 歴：平 成 13 年 8 月 7 日 よ り フ ィ ー ル ド ワークのため，インドネシアを旅行．9 月 1 日頃よ り 38℃−39℃ 台の発熱が出現， 抗菌薬と解熱鎮痛 薬を服用し，翌日一旦解熱したが，再び 39℃ 台の 発熱と血圧低下が出現し，現地の病院へ緊急入院 した．入院時の血液検査にてマラリア原虫が陽性

であり， P. falciparum と同定され，熱帯熱マラリア

と診断された．9 月 4 日よりクロロキンの投与を 開始され （1 日目 600mg，2 日目 600mg，3 日目 300

mg），その後プリマキン（15mg ! 日）の内服を 4 日 間行い，9 月 14 日退院し，帰国した．しかし，倦 怠感が持続するため，当科を受診し，精査加療目 的のため入院となった．

入院時現症：身長 157.2cm 体重 46.2kg，脈拍 68 回 ! 分，呼吸数 32 回 ! 分，血圧 120 ! 64mmHg，体温 36.2℃，眼球結膜黄疸なし，眼瞼結膜貧血軽度，頸 部リンパ節腫脹なし，呼吸音異常なし，心雑音聴 取せず，腹部は平坦で軟．

入院時検査所見（Table 2） ：白血球の上昇はな かったが，赤沈と CRP の上昇が認められた．Hb 8.9g ! dl と低下しており，軽度の肝機能障害を伴っ ていた．血液塗抹検査では原虫陰性であったが，

熱帯熱マラリア抗原検出キット（ICT Malaria p.f.

kit；ICT Diagnostics）で P. falciparum 抗原が陽性 となり，熱帯熱マラリアと診断された．

臨床経過：血液塗抹標本で原虫が認められず，

M  1  2  3  4 1．P. falciparum

2．P. vivax 3．P. malariae 4．P. ovale

M  1  2  3  4

1．P. falciparum 2．P. vivax 3．P. malariae 4．P. ovale

無症状のため，熱帯熱マラリアは治癒したものと 判断した．しかし，同じ検体を用いて施行した PCR 検査にて熱帯熱および卵型マラリアが陽性 となったため （Fig. 2） ，熱帯熱マラリアと卵型マラ リアの重複感染と診断された． その後， 症状は徐々 に改善し，三度施行した塗抹検査で原虫が確認さ れなかったことから，クロロキンが奏効したと判 断し，9 月 22 日退院となった．9 月 29 日頃より発 熱と倦怠感が出現し当科再受診，末梢血塗抹検査 で熱帯熱マラリア原虫が認められたため，熱帯熱 マラリアの再燃と診断した．クロロキンによる治 療後の再然であることから，クロロキン耐性マラ リアと考え，メフロキン 600mg による治療を開始 した．速やかに解熱し，血液塗抹標本での原虫も 認められなくなったため，10 月 10 日軽快退院と なった．その後，再発は認められていない．

考 察

マラリアの流行地ではマラリア複数感染例が比 較的多いが，本邦で報告のある輸入マラリア例の 中では稀である

．

マラリアの診断は末梢血塗抹標本の鏡検でなさ れるのが標準的であるが，医療機関受診前に抗マ ラリア薬を服用している場合や原虫の感染率が低 い場合は，血液塗抹検査の結果が偽陰性となる可 能性がある．本邦においては重複感染例が稀であ るため

，重複感染を意識せずに鏡検される可能 性もある．これらのことから従来の血液塗抹標本 の鏡検のみでのマラリア診断には限界があると思 われる．

熱帯熱マラリアは重症化することが多く，他種 のマラリアとは治療法が異なる．近年では多剤耐 性を示す株も増加してきていることから，熱帯熱 マラリアの感染の有無の診断は極めて重要であ る．特に重複感染症例においては，初診時に熱帯 熱マラリア原虫の感染率が低いために，重複感染 したマラリア原虫のみの感染として治療し，熱帯 熱マラリアに対する治療が遅れる可能性もある．

近年，感度の高い抗原検出キットや PCR 法の開発 によりマラリアの迅速診断が可能になってきてい る．Kimura らは，4 種のマラリア原虫に共通な部

1. The DNAs from whole blood cells were amplified by specific primers forP. vivaxandP. malariae.

Fig. 2 Detection of plasmodium DNA by PCR in case 2. The DNAs were amplified by specific primers for P. falciparumandP. ovale.

分に対応するプライマーと 4 種それぞれに特異的 な 遺 伝 子 配 列 に 対 す る プ ラ イ マ ー を 用 い た nested PCR 法やマイクロタイターハイブリダイ ゼーション法を開発し，4 種類のマラリア原虫す べてに対し感度，特異度ともに優れていたと報告 している

．また，TOMA らはマラリア流行地 域でのマラリア診断を nested-PCR と Gimsa 染色 の塗抹鏡検法で比較検討したところ，前者が後者 に比べ 2〜3 倍効果的であり，nested-PCR で重複 感染と診断されたマラリア症例 27 例のうち鏡検 で診断可能であったのは 2 例のみであったと報告 している

．

このように，PCR を用いた手法は各種マラリア 原虫の鑑別に有用であるだけでなく，原虫数が少 ない場合や 2 種以上のマラリア原虫による感染の 場合の確定診断においても有効である．

我々は各マラリア原虫種で遺伝子配列に変異が 確認されている 18S rRNA をターゲットとする primer を用いた種特異的 nested-PCR 法

を用い て診断を行った．今回，我々が経験した 2 症例は，

初診時の塗抹鏡検ではそれぞれ P. vivax，P. falci-

parum 単独のマラリア原虫による感染と診断され

たが nested PCR を行うことにより， P. vivax と P.

malariae お よ び P. falciparum と P. ovale の 2 種 の マラリア原虫による重複感染であると診断するこ とが可能であった．マラリア原虫の重複感染例は 流行地によって差があるものの P. falciparum と P. vivax ま た は P. malariae に よ る も の が 最 も 多 く

，我々が経験した P. vivax と P. malariae および P. falciparum と P. ovale の重複感染は稀で あり貴重な症例と思われた．

2 種以上のマラリア原虫の重複感染症例では，

単独感染に比べ病期が延長したり，病態が悪化す ることが示唆されており

，重複感染であること を診断するのは重要である．しかし，重複感染例 では一方の原虫が他方に比べ感染率が優位に高く なる傾向があり，また，マラリア原虫の鏡検の熟 練者であっても一方の原虫の確定のみで鏡検を中 止 し て し ま う 傾 向 が あ る こ と が 指 摘 さ れ て い る

．PCR 法を用いた診断法はこのような現象や 検者の主観に左右されることなく重複感染を含め

たマラリアの診断が可能である．

今後， 熱帯地方への旅行者の更なる増加に伴い，

輸入マラリアも増加していくことが予想される．

2 種以上のマラリア原虫が流行している地域や複 数の浸淫地域を訪れた患者に発症したマラリア症 例を診た場合は，その中に複数種の重複感染例も 含まれることを念頭において，血液塗抹の鏡検を 施行するべきであり，更に，可能であるならば積 極的に抗原検出キットや PCR 法を活用し，早期に 適切な治療を開始する必要がある．

文 献

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4）Tham JM, Lee SH, Tan TMC, Ting RCY, Kara UAK ： Detection and Determination of malaria parasites by PCR：comparison with microscopy and with ParaSight-F and ICT Malaria Pf tests in a clinical environment . J Clin Microbiol 1999 ； 37：1269―73.

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8）吉田英樹，阪上賀洋：多臓器不全を合併した熱帯 熱マラリアと三日熱マラリアの混合感染の 1 例．

治療学 1997；31：101―10.

9） 木村幹男，田辺 学，立川夏夫，島田 馨，新井

明治，三宅啓文，他：マイクロタイタープレート

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12）Richie TL：Interactions between malaria para- sites infecting in the same vertebrate host. Para- sitology 1998；96：607―39.

Two Cases of Mixed Infection of Malaria Diagnosed by PCR Method Shusaku HARANAGA

, Manabu AKASHI

, Satomi YARA

, Masaki TOHYAMA

, Masato TOYAMA

, Tomohiko ISHIMINE

,

Takayuki MIYARA

, Takashi SHINZATO

, Futoshi HIGA

, Masao TATEYAMA

, Atsushi SAITO

& Hiromu TOMA

1）

First Department of Internal Medicine,

Department of Parasitology, Faculty of Medicine, University of the Ryukyus

We here reported two Japanese cases of mixed infections of plasmodium species, whose DNAs were detected using the PCR test. One case was a 31 year-old male, who presented fever and fatigue, and had a travel history to Kenya, Cameroon and Indonesia. Smear test of his peripheral blood found the presence of Plasmodium vivax, while nested-PCR diagnosis detected the DNAs both P. vivax and Plasmodium malariae. The other was a 54 year-old female suffering from general fatigue. She had been treated with chloroquine for falciparum malaria in Indonesia two weeks before. Malaria antigen test showed positive although no Plasmoduim organisms were found in the smear test. The nested PCR detected the DNA of Plasmodium ovale in addition to that of Plasmodium falciparum. In conclusion, the PCR test is helpful and useful for detection of mixed infections of Plasmodium species

〔J.J.A. Inf. D. 76：571〜575, 2002〕