National Agriculture and Food Research Organization
農業・食品産業技術総合研究機構
農研機構は食料・農業・農村に関する研究開発などを総合的に行う我が国最大の機関です
高精度なＰＣＲ法による
鳥インフルエンザウイルス の迅速な亜型判定
動物衛生研究所 ウイルス・疫学研究領域 上席研究員 塚本 健司
•
1996年以降、H5N1亜型の鳥インフルエンザウイルスによる 鶏、アヒルの感染が中国、東南アジアで継続•
これが汚染源となって、野鳥が感染が起こる？•
H22/H23年の冬、日本で野鳥、鶏の感染が多発し、H5N1ウ イルスが野鳥に定着する懸念。今後はこれまで以上に野鳥 の警戒が必要。•
日本では環境省が中心で、野鳥調査が実施。カモ糞便のラ ンプ法が陽性の場合は専門機関へ材料が送付し、ウイルス 分離と亜型判定•
迅速性、感度の向上、亜型判定精度の向上が必要。•
特異性、感度、迅速性に優れ、一般検査室で利用可能な亜 型判定法が必要 → 導入によって、野鳥調査の精度向上、野鳥におけるH5N1ウイルス感染の実態解明が可能。
研究背景
2011年の国内発生
農林水産省
新技術の基となる研究成果・技術
•
PCRによるHA亜型判定法の開発H1～H15の遺伝子亜型の判定(J Clin Microbiol 2009)
•
PCRによるNA亜型判定法の開発N1～N9の遺伝子亜型の判定(J Clin Microbiol 2010)
•
多様なH5, N7遺伝子を幅広く検出できるリアルタイムPCR 法の開発（J Clin Micribiol 2011）プライマーの設計ガイドラインが確立
↓
•
RT-PCR法、リアルタイムPCR法による迅速亜型判定法 プライマーの改良、反応の最適化によって、精度向上HA, NA 遺伝子の多様性
N1 N3
N2
N4 N5 N6
N7
N8 N9
HA
NA
H1 H6 H5 H2
H11
H13 H16
H9 H8
H12
H10 H7
H15 H3 H4 H14
PCR の標的部位
Tsukamoto, K. et al. 2008.
J. Clin. Microbiol. 46:3048-3055
NA 1 2 3 4 5 6 7 8 9
NA
Tsukamoto, K. et al. 2009.
J. Clin. Microbiol. 47:2301-2303
鶏病原性の分子マーカー
低病原性
RETR*GLF
高病原性RRKKR*GLF HA HA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Lee, M. S.. et al. 2001.
J. Virol. Methods. 97:13-22
鶏馴化の分子マーカー
ＰＣＲによる亜型判定法
①
A/duck/Niigata/10/2007 (H4N6)
②
A/duck/Tsukuba/189/2008 (H5N2)
③
A/duck/Shiga/66/2007 (H6N5)
④
A/duck/Chiba/13/2008
(H7N7)
H5 遺伝子の系統樹
ck/Nongkhai/NIAH400802/07 ck/TH/NP172/06
Guangzhou/1/06JapaneseWhiteEye/HK/1038/06 Anhui/1/05dk/Laos/3295/06ck/Malaysia/935/06commonmagpie/HK/645/06
Zhejiang/16/06gs/Guangxi/3017/05Guangxi/1/05gs/Yunnan/4494/05gs/Guiyang/3422/05ck/Guiyang3/055/05dk/Guiyang/3009/05JapaneseWhiteEye/HongKong/73720/07WhiteBackedMunia/HongKong/82820/07dk/Guiyang/3242/05
gs/Guangxi/345/05dk/Hunan/127/05dk/Hunan/149/05dk/Hunan/152/05dk/Hunan/139/05Barhdgs/Qinghai12/05gs/Guangxi/3316/05Barhdgs/Qinghai1A/05ck/Liaoning/23/05WhooperSwan/Mongolia/244/05ck/Nigeria/641/06swan/Iran/754/06ck/Krasnodar/01/06Turkey/15/06Iraq/207NAMRU3/06Azerbaijan/001161/06turkey/Turkey1//05Egret/Egypt/1162NAMRU3/06dk/Egypt/22533/06Nigeria/6e20/07Egypt/14724NAMRU320/06Egypt/0636NAMRU320/07
ck/Kyoto/3/04 crow/Kyoto/53/04ck/Yamaguchi/7/04
ck/Korea/ES/03 dk/Guangxi/13/04
ck/YN/115/04ck/YN/374/04Indonesia/5/05Indonesia/546bH/06Indonesia/596/06Indonesia/599/06Indonesia/283H/06Indonesia/326N/06Indonesia/370E/06Indonesia/625/06Indonesia/CDC1047/07Indonesia/CDC940/06Indonesia/CDC742/06Indonesia/CDC887/06Indonesia/CDC938/06Indonesia/CDC103220/07Indonesia/CDC1046/07
dk/Indonesia/MS/04ck/Indonesia/11/03ck/Indonesia/4/04VN/JP14/05ck/Cambodia/013LC1b/05ck/Indonesia/7/03 VN/1194/04
VN/1203/04 VN/HN3/0408/05 TH/16/04HK/213/03VN/JPHN30321/05TH/676/05 ck/Henan/16/04 ck/Henan/01/04
ck/Henan/13/04 ck/Henan/12/04
dk/Guangxi/50/01treesparrow/Henan/4/04ck/HK/YU777/02ck/HK/8911/01sw/Anhui/ca/04blbird/Hunan1/04dk/Hubei/wg/02migdk/Jiangxi1653/05ck/Hunan/41/04dk/Guangxi/2775/05gs/Guiyang/1325/06ck/Guiyang441/06ck/Guiyang1218/06ck/Guiyang846/06ck/Guiyang237/06ck/HK/YU22/02dk/Guiyang/504/06gs/Guiyang/337/06dk/Guangxi/1681/04dk/Guangxi/1311/04ck/Myanmar/06010011B/06dk/Guangxi/1378/04dk/Guangxi/2396/04ck/Shanxi/2/06ck/Hunan/2292/06
ck/HK/SF219/01ck/HK/8791/01gs/Guangdong/1/96HK/156/97gs/VNGZ3/05 0.005
西日本
2006
年4,5
月2007
年6
月2008
年1
月 東日本2008
年5,7
月2011
病原性と鶏馴化の推定
株名 亜型 病原性マーカー 病原性
H5
A/tk/MN/3689-1551/81 H5N2 PQRETR / GLF A/ck/Ibaraki/1/05 H5N2 PQRETR / GLF
低
A/duck/Tsukuba/419/2005 H5N3 PQRETR / GLF A/duck/Tsukuba/394/2005 H5N3 PQRETR / GLF A/duck/Niigata/514/06 H5N3 PQRETR / GLF A/duck/Chiba/1/06 H5N3 PQRETR / GLF
A/duck/Yokohama/aq10/03 H5N1 PQRERRRKKR / GLF
高
A/ck/Yamaguchi/7/2004 H5N1 PQRERRKKR / GLF A/duck/Angthong/72/04 H5N1 PQRERRRKKR / GLF A/ck/Miyazaki/S749/2007 H5N1 PQGERRRKKR / GLF A/ck/Pennsylvania/21525/83 H5N2 PQKKKR / GLF
A/ck/Italy/330/97 H5N2 PQRRRKKR / GLF A/tern/South Africa/61 H5N3 PQRETRRQKR / GLF
HA
産物 塩基配列↓
病原性推定 迅速化
N1 N2 N3
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
NA
産物 小さな産物↓
鶏馴化推定
リアルタイム PCR 法 (SYBR 法 )
Taq poly.
Taq poly. SYBR
Taq poly.
Taq poly.
蛍光
SYBR
法PCR
法リアルタイムＰＣＲ法の改良点
PCR法よりも感度、特異性、臨床材料検査性が向上 1.プライマーの設計：多数の遺伝子を使用
2.感度の向上
①混合塩基数 ： プライマー当たり5個以内
②プライマー標的： 地域特異的（ユーラシア、アメリカ）
③プライマー濃度： 亜型毎に最適化
3.特異性の向上
④増幅回数 ： 30 回
⑤cDNA ： 1/10量
4.臨床材料の直接検査
⑥40回増幅、cDNA原液 → 亜型判定率70%
増幅回数と交差性
増幅
30回
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1415 16 M
H7
35回
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 1415 16 M
H7
増幅回数 30回 → 特異性が向上
cDNA量と交差性
cDNA
1/10
原液
cDNA量 1/10 → 特異性が向上
H7
H7
SYBR法による亜型判定
N6 H4
同時に判定、明瞭に判定、簡便
越冬カモ類由来株の亜型判定
H/N H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11 H12 H13 H14 H15
計N1 11 11
N2 13* 2 4 5 11 12* 1 2 50
N3 6 3 1 10
N4 6 6
N5 1 10 11
N6 1 2 39 3 45
N7 8 8
N8 11 3 15
N9 1 3 3
計
20 3 15 43 6 27 8 6 12 0 4 15 0 0 0 159
亜型判定の迅速化、簡便化、多検体処理
* Two N2 genes were not detected.
No. of No of samples subtyped successfully for
positive
samples NP gene HA gene NA gene Virus
isolation b 45 38 29 27
(84 %) (64 %) (58 %)
NP gene
40 31 29
(F: >200) c (78%) (73%)
臨床材料の直接検査
cDNAは原液 増幅は40回 → 亜型判定率が向上
Test group No. of HA gene NA gene viruses Eurasia North
America Eurasia North America Gene
detection 304 224 80 198
(N1: -1) 106
Subtyping 159 104 a 86 18 98
(N2: -1) 6
55 b 52 3 54
(N2: -1) 1
Total 463 362 101 350
(-3)
113 使用ウイルス数と遺伝子の系統.
アジア株とアメリカ株の亜型判定が可能
従来の技術とその問題点
H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9 H10 H11 H12 H13 H14 H15 H16
HA 亜型
N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9
赤血球凝集抑制(HI)試験
NA 亜型
ノイラミニダーゼ 活性抑制（NI)試験
抗血清パネル
• 低い検出率
• 交差反応、非特異反応
• 長い検査時間 (NI 2 日 )
• 多献体処理が困難
• 標準化が困難
• 抗血清の供給が限界
• 熟練が必要
• 専門機関で実施
100%
検査精度の比較
n = 104 AIVs
45%
53%
2%
74%
26%
血清学的検査
NA HA
Real-time PCR 99%
1%
新技術の特徴・従来技術との比較
新技術
Real-time PCR 法
• 高い検出率
• 高い特異性
• 迅速
• 多献体処理
• 標準化が容易
• 試薬供給が容易
• 簡便、熟練は不要
• 一般検査室
従来法
HI 試験 , NI 試験
• 低い検出率
• 交差反応、非特異反応
• 長い検査時間 (NI 2 日 )
• 多献体処理が困難
• 標準化が困難
• 抗血清の供給が限界
• 熟練が必要
• 専門機関で実施
想定される用途(1)
• 鳥インフルエンザの診断
プライマーの設計、反応系はほぼ完成
（定期的な更新は最小限）
• 鳥インフルエンザの野鳥調査
アジア系統とアメリカ系統のウイルスが標的
（塩基配列情報が得られれば世界の株を標的）
カモ糞材料中のウイルスの亜型を直接判定
（環境省プロジェクトでの活用）
• 国際的な標準法としての可能性
採 材
HA
A
型抗原＋SYBR
法ランプ法
鶏卵培養 鶏卵培養
(4
日間）4
日間採 材
HI, NI
で亜型判定
HA
A
型抗原＋ 環境省調査
環境研究所 専門機関
大学、家畜保健衛生所など 調査研究
SYBR
法SYBR法
SYBR
法想定される用途(2)
本技術に関する知的財産権
・発明の名称：鳥インフルエンザウイルスのＮＡ亜型 判定用プライマーセット
・出願番号：特願2009-104759
・公開番号：特開2010-252659
・出願人 ：（独）農業・食品産業技術総合研究機構
・発明者 ：塚本健司、真瀬昌司、鈴木耕太郎
お問い合わせ先
所内問い合わせ窓口
（独）農業・食品産業技術総合研究機構 動物衛生研究所 企画管理部業務推進室 企画チーム長 高橋雄治 TEL : 029-838-7895（直通）
E-mail : [email protected]
