胆 汁 色 素 に 関 す る 研 究
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(2) 6390. 物. 合 成 さ れ る と な し,肝. のmicrosome中. diphosphate. acidか. glucuronic. 接bilirubinに. 部. 大. 成. にuridine. らglucuron酸. Table. 1.. を間. 移 転 す る 酵 素 系 が 有 る と 発 表 した.. そ こ て 以 上 を 参 考 に し て 小 坂 を 始 め と す る教 室 の 業 績 とBillingそ. の 他 のbilirubin. glucuronidelこ. す る一 連 の 文 献 を 参 照 し比 較 す る と き,直 binの. 関. 接biliru. 本 態 に 関 して 両 者 の 間 に 大 き な 見 解 の 相 違 を. 見 る の で あ る.即. ちBilling等. は 直 接bilirubinは. 1/10規 定 の 苛 性 曹 達 に て 速 や か に 加 水 分 解 さ れ て 間 接bilirubinと. な る と す る に 反 し て,小. bilirubinは5%のmethanol性 通 気 の も と に4分 bilirubinと coholで. 坂 等 は直 接. 加 里 中 で炭酸瓦斯. 間 煮 沸 し て 始 め て鹸 化 され 間 接. な り,鹸. 化 に 用 い た 苛 性 加 里 及 びal. の 単 独 作 用 で は 斯 る変 化 は 起 らな い と し,. 又 同 じ 肝 組 織 培 養 実 験 に 於 い て もSchmid等 接bilirubin し,早. glucuronideが. は間. 合 成 さ れ た とす る に反. くか ら小 坂 は 所 謂ester型bilirubinを. る と 述 べ て い る.そ. こで 両 者 の 見 解 の 相 違 を 明 らか. に す る 一 端 と し て,先. ずBilling等. 生 体 内 に は た し てbilirubin る か ど うか,又. 生 ず. の報 告 の如 く. glucuronideが. 直 接bilirubinは. 存在す. 悉 くglucuronide. で あ るか ど うか を検 討 す るた め に機 械 性黄 疸 患 者 尿 を 用 い 従 来 教 室 で 発 表 さ れ た 直 接bilirubin分 に よ り 得 られ たester型 に 就 きglucuron酸. 離法. 並 び に 塩 型 直 接bilrubin. と の 関 係 を 検 討 し た.. 実. 験. 方. 粗 天 然bilirubin調. と に 分 れ 黄 褐 色 色 素 は 水 層 に 移 行 す る.こ. 法. 1.. 製 法 製剤 の 投 与 を 中 止 した. 機 械 性 黄 疸 患 者 尿 を 用 い,岩. 田18)並. び に 坂 本 の方. 法19)に 倣 い 調 製8)し た. 塩 型 直 接bilirubin調. 製法. 岩 田 の 方 法 並 び に 坂 本 のion交 graphy法5)を 1.. petroleum混. 液層. の黄褐 色. 水 溶 液 を 試 料 に 用 い た.. 1週 間 以 上glucuron酸. 1. 2.. に 含 ま れ て い る飽 和. 水 は 離 れ て 水 層 とbutanol‑light. 1. 実 験 材 料 1. 1.. と共 に 振 盪 す る と, butanol中. 換chromato. 用 い て 分 離 した.. 3. ester型. 上 記 のion交. 直 接bilirubin調. び に小. butanol抽. 出 に よ る 直 接bilirubin調. Table. Ｉ に 示 す 如 き 操 作 に よ り 調 製 した.即 水 に 溶 解 し,次. び15mlの. の 水 に 溶 解 し た も の を Ｉ液 と し, 0.5%亜 液 を Ⅱ 液 と し,用. に 臨 み Ｉ液10mlに. 0.3mlを. 液 は 調 製 後5分. 混 じ,混. 2.. 実 験 方法. 2.. 1. 直 接bilirubinの. 1/10規 定 塩 酸 を 加 え,こ. 製法 ち. い でchloroform. 2.. 2.. 溶 液 に 同量 の 加えて. 溶 液 に倍. 量 の5%のmethanol性. 加 里 を 加 え,炭. 酸瓦 斯 を通. 間 熱 し,次. じ な が ら 重 湯 煎 上 で4分. 褐色 色 素. の1/5量. のbutanol層. 容 量 のlight. petroleum. 鹸化 接bilirubin水. 部の水層. 加 え て 振 盪 す る と,黄. を 数 回 軽 く水 洗 し, 8〜10倍. 対 しⅡ液. 以 内 に 使 用 し た.. れ にchloroformを. 小 坂 の 方 法2)に 従 い,直. に 小 量 のbutanolを. に 移 行 す.こ. 硝 酸水 溶. 加水分解. 直 接bilirubinの. で 色 素 の 抽 出 を 認 め な くな る迄 洗 滌 し,残. の 大 部 分 がbutanol層. 濃 塩 酸 を1000ml. 振 盪 抽 出 を 行 つ た.. 用 い て 分 離 し た.. 1. 4.. 粗 天 然bilirubinを. sulfanil酸1g及. 薬. 原 の 方 法3)に 従 い 直 接bilirubin水. 製法. 換chromatography法5)並. 牟 田 の 沈 澱 法19)を. 5. Ehrlich氏diazo試. formを. い で 冷却 後試料. の 氷 醋 酸 を 加 え て 中 和 し,更 加 え て 振 盪 抽 出 を 行 つ た.. にchloro.
(3) 胆 汁 色 素 に 関 す る 研 究. 2.. 3.. bilirubinの. Jendrassik 2.. 4.. &. hexuron酸. 5.. 2.. 同定 法. よ り測 定. 100℃,. 7.. Paperchromatography. 2.. 7.. 1.. Karl. 0.2%. を 用 い,濾. &. Schull会. 紙 は 巾5cm長. 社 製 濾 紙Nr.. 2043. さ40cmのstripと. 7.. 100℃. 2.. し て,或. 所 に 試 料 を0.5cm以. 内. い は帯状 に附 着 させ 予 め 少量 の. 展 開 剤 を 入 れ た 内 径10cm,高. さ45cmの. 硝子 円. 5. 糖 及 びuron酸. い た. glucuron酸. 標 準 液 はglucuronolactoneを. た もの を 用 い た.. 2.. る 程 度 迄 追 加 して 硝. 昇 し た 後 濾 紙 を 取 り 出 し, 温 器 中 で 乾 燥 さ せ,帯. spotの. 恒. 展 開 剤 と して は種 々検 討 した 結 果. n‑butano1‑ethanol‑water(4:1:2)19)並. び に. n‑propanol‑water(4:1)が. 最 も よ く,. に はsec‑butanol‑formic. に はPyridine‑etbyl. acid. water. 5・1・3)24)を. (5. amino酸. 2. 7.. 2.. 7.. 3.. 分別 帯 の 検 出. 2.. 7.. 3.. 1.. bilirubinの. 2.. 7.. 3.. 1.. 1. Ehrlich氏Van. acetate‑acetic‑ 使 用 し た.. 3. 5. 2. anilne hydrogen. を 噴 霧 後105℃. hydrogen. に5分. uron酸. 0.2%. naphthoresorcinol反. naphthoresorcinol. 気 中 で10〜15分. 2.. 8. Column. 薬 を噴 霧 後 赤 紫 色 斑 の 発現. 2.. 8. 1.. Gmelin反. 風 乾 櫨 紙 にgmelin試. den. Bergh氏. にcaffeine. 応. 7.. 3.. 2.. urobilinの. の蒸. chromatography. 試料. ion交 換chromatography法. 2. 8.. 2. Columnの. 粉 末 濾 紙A(東. 検 出. 風 乾 濾 紙 を 紫 外 線 下 に 検 す る とurobilin存. 溶:液 を 用 い,粗. に よ り分 離 したester 天 然bilirubin調. 製. 粉 末 を 作 り使 用 し. た.. 薬 を 噴 霧 す る とbilirubin. 存 在 部 に 紫 青 色 斑 が 発 現 す る. 2.. 液 に1/10容. 間 加 熱 し青 色 又 は 紫 色 斑 を 生 ず る も. 法 に 順 じ てester型bilirubinの 2.. ethanol溶. 応27). の を 陽 性 と し た.. 反 応 と し た. 1.. 薬26). に対 して. 7. 3. 5. 3.. 型bilirubin水. 3.. Phthalate試. 間加 熱 して 褐 色 斑 を生 じた. 混 液 を加 え た後 始 め て斯 る呈 色 を認 め る もの を間 接. 7.. phthalate法. 量 の 正 燐 酸 を 加 え た も の を 噴 霧 し, 70〜80℃. 呈 色. を 認 め る も の を 直 接 反 応 陽 性 と し,更. 2.. 噴 霧 後105℃. も の を 陽 性 と した.. 反応. Ehrlich氏diazo試. 薬25)を. Partridgeのaniline. 2.. acid‑water(15:3:2)23),. 糖 並 び にuron酸. 応. し た.. ethanol水. で 濾 紙 が 乾 燥 し な い 内 に 手 早 く 色 素 の 抽 出 を 行 つ た. 直 接bilirubinの. benzidine反. に15分 間 加 熱 す る と 褐 色 斑 を 生 ず る も の を を 陽 性 と. 場 合 は38℃. 状 の 場 合 は50%. 7. 3. 5. 1.. Horrocksのbenzidine試. 開 は12. 開 前 線 が30〜35cm上. 用. 1/10規 定 苛 性 曹 達 に 溶 解 し後 同 規 定 の 塩 酸 で 中 和 し. 開 剤 を 濾 紙 の 下 端 が 約1cm浸. の 室 温 下 に 行 い,展. 定塩酸を加え. に 濃 縮 してPaperchromatographyに. 糖 一 般 に 対 し て,. 〜14℃. の検 出. 溶 液 に 同 量 の2規. 筒 内 に 数 時 間 展 開 剤 蒸 気 で 濾 紙 を 飽 和 さ せ た 後,展. 子 円 筒 を 気 密 に 保 つ た 儘 暗 所 で 展 開 し た.展. 液 を 噴 霧後. 1時 間 共 栓 付 試 験 管 中 で 加 水 分 解 し た も の を. 脱 塩 し,更. 展開. 濾 紙 の 下 縁 か ら5cmの のspotと. 7. 3.. 直 接bilirubin水. し. て 使 用 し た.. acetone溶. 前 後 に 数 分 間 加 熱 す る と 青 色 斑 を 生 ず る.. 2.. a. 応. ninhydrinの80%. 80℃. 濾紙. Schleicher. に 濃 縮 してPaperchromatographyに. ninhydrin反. 記 分 光 光 度 計 を 用 い た.. 2.. 溶 液 に 同 量 の 濃 塩 酸 を 加 え. 用 い た.. 吸 収 曲線 測 定法. D. K型Beckman自. の検 出. 16時 間 共 栓 付 試 験 管 中 で 加 水 分 解 し た も の. を 脱 塩 し,更 6.. 検 出. 薬 を 噴霧 す ると赤 色 斑 を. 4. amino酸. 直 接bilirubin水. の定 量. し た. 2.. urobilinogenの. 生 ず る. 2. 7. 3.. Fishmanのnaphthoresorcinol法21)に. 2.. 7. 3. 3.. Ehrlich氏alclehyde試. 応21),. よ り 同 定 し た.. glucuron酸. の 部 にSchleainger. 氏 試 薬 を 噴 霧 す る と 前 証 螢 光 が 増 強 さ れ る.. よ り 測 定 し た.. に 対 し て はmannose‑H2SO4‑thioglycol. 応22)に. 2.. Cleghon法20)に. に 対 し て はnaphthoresorcinol反. glucuron酸 ‑late反. 位 に 淡 緑 黄 色 の 螢 光 を 発 し,こ. 定量. glucuron酸. 6391. ethanol‑water 在 部. 作 り 方28) 洋 濾 紙 会 社 製)をn‑butanol‑. (4:1:2)に. 懸 濁 しFig.. と き 吸 着 管 に 吸 引 し な が ら流 し込 み, glass棒. 1の. ご. で均.
(4) 6392. 物. Fig.. 部. 1.. 大. 成. 紫 色 を 呈 し, Ehrlich氏diazo試 以 内 に 赤 紫 色 を 呈 し,こ 色 と な つ た.本. 薬 を 加 え る と1分. れ に 濃 塩 酸 を 加 え る と青 紫. 水 溶 液 に 亜 硝 酸 曹 達,次. い で氷 醋酸. を 混 ず る と 緑 色 を 呈 した. Ehrlich氏aldehyde試 薬 を 混 ず る も色 調 に 変 化 な く,又Schlesinger氏 薬 を 混 ず る も 螢 光 は 認 め られ な か つ た. pH 於 い て 可 視 部 に410〜430mμ た.本. 液 に 等 量 の1/10規. chloroformに た が,小. 試 7.0に. に吸 収 の極 大 を 示 し. 定 塩 酸 を 混 じ た もの か ら. 移 行 す る色 素 は 全 く 認 め ら れ な か っ. 坂 の 方 法 で 鹸 化 後 は 殆 ん ど す べ て の色 素 が. chloroformに. 抽 出 さ れ た, chloroform層. にGmelin. 試 薬 を 重 畳 す ると緑 色 よ り赤 紫色 に至 る色 調の 出現 を 認 め た が, Ehrlich氏diazo試. 薬 に 対 し て 何 ら色. 調 の 変 化 な く,倍 量 のethanolの 明 に 赤 紫 色 の 発 現 を 認 め,こ と 青 紫 色 を 呈 し た.更 視 部 に450mμ. れ に濃 塩 酸 を混 和 す る. に こ のchloroform溶. に 吸 収 の 極 大 を 示 し た.以. よ りbutanol抽 Gmelin反. 添 加 後 始め て著. 更 にdiazo反 columnの. 高 さ は 約20cmと. 記 混 液 を 入 れ た ま ま 一 夜 放 置 し て,粉. し,上. 末cellulose. 上 の 固 定 相 と 移 動 相 を 充 分 に 平 衡 化 さ せ 使 用 し た. 2.. 8. 3.. 展開. ester型bilirubinの. 粉 末 を上 記 混 液 の小 量 に 出. 来 る だ け 高 濃 度 に 溶 解 さ せ,次 さ せ,そ. れ をcolumnの. い で粉 末 濾紙 に吸 着. 上 部 に 重 畳 しglass棒. て 圧 し 上 記 混 液 に て 展 開 し,流 collectorに2ml宛 2.. に. 下 液 はfraction. 採 取 した .. 出法 に よ り 得 ら れ た黄 褐 色 色素 は. 応 で 赤 紫 色 を 呈 し, Ehrlich氏aide. bilirubinよ. りmesobilirubinに. 至 るbilirubinoid. で あ り,こ. れ は 明 ら か に 二 塩 基 酸bilirubinと. 的 に も,分. 光 学 的 に も異 つ て い る 事 が 認 め られ,又. 鹸 化 後 のch1oroform移. 行 性 よ り し て教 室 従 来 の 見. 解 に 従 え ば 本 色 素 はester型bilirubinの 徴 を 持 ち, Ehrlich氏diazo試 以 内 にalcoholの. 化学. 総 ての特. 薬 と 水 溶 液 中 で1分. 添 加 を 必 要 と しな いで 反応 す る 性 状 を 有 す る もの. で あ る.. 各 分 割 液 を2分. し 各 々 溶 媒 を 減 圧 蒸 発 さ せ た 後,. 一 方 の 試 料 は2mlのmethanolに 光 度 計 で 濾 光 板S43に 数 を 測 定 し,更. 溶 解 しPulfrich. よ る 各fractionの. に 同 一 試 料2mlに. 吸光度係. 対 して3mlの. 液 を 加 え30分 後S53に よ る 吸 光 係 数 を 測 定 し. てbilirubinの 水3mlを. 素 と考 え られ,. 応 で 全 く色 調 に 変 化 を 認 め な い 点 よ り. 点 よ り 明 ら か に 直 接bilirubinの. 8. 4.. diazo混. hyde反. 上 の成績. 応 で 緑 色 よ り 赤 紫 色 を 呈 し,亜 硝 酸 酸 化. で 緑 色 と な る こ と か らtetrapyrrol色 等 に 圧 し固 め,. 液 は可. 濃 度 を 知 り,更. 加 えFiahmanの. 酸 を 測 定 し,そ. に 他 方 の 試 料 に蒸 溜. 方 法 に よ りglucuron. の 分 配 状 態 を 検 討 し た.. 2.. 直 接bilirubinとglucuron酸. 2. 1.. 塩 型 直 接bilirubin分. との関 係 劃 とglucuron酸. と. の 関係 黄 疸 尿 か ら岩 田 並 び に 坂 本 の 両 分 離 法 に よ り得 ら れ た 塩 型 直 接bilirubinはnaphthoresorcinol反 陰 性 で, glucuran酸 binの 2.. 応. と は 全 く関 係 の な い 直 接biliru. 一 つ で あ る と 考 え られ る. 2. ester型. 直 接bilirubin分. 劃 とglucuron酸. と の関 係 実 験 成 績 並 び に 考 按 1. butanol抽. 出 法 に よ り 得 ら れ た 直 接bilirubin. 換chromatographyに. eater型bilirubin分. よ るesterに. 出 法 に よ り得 られ た 黄 褐 色 水 溶 液 は 紫. 外 線 下 に 螢 光 な く. Gmelin試. 薬 に よ り 緑 色 よ り赤. よる. 離 法 か ら得 られ た 直 接bilirubin. に 就 い て は 坂 本 並 び に 近 藤 か ら,又. の性状 Butanol抽. ion交. ら れ た 直 接bilirnbinに. 沈 澱 法 に よ り得. 就 い て は坂 本 並 び に小牟 田. か ら詳 細 に 発 表 さ れ た 如 く, ester型bilirubinの. 性.
(5) 胆 汁 色 素 に 関 す る 研 究 状 を 悉 く具 え て い る 直 接bilirubinで ion交 換chromatography法,沈. あ る.そ. こで. 澱 法 並 び にbutanol. 抽 出 法 に よ り分 離 さ れ たester型bilirubin(以 次EBＩ,Ⅱ. 並 び に Ⅲ と 記 す)に. resorcinol反. 応 を 検 す る に, EBⅡ. に 陰 性 で あ り, EBＩ 合 陽 性 で,時. 下順. 就 きnaphtho に 於 い て は,常. 並 び に Ⅲ に 於 い て は 多 くの 場. に 陰 性 の こ と も あ つ た. EBⅡ. 直 接bilirubinと. 共 にglucuron酸. な い 直 接bilirubinで い てglucuron酸. あ り,こ. と は 全 く関 係 の の ことは生 体 内 に於. 抱 合 がbilirubinを. 一 のmechanismで. 直 接化 す る唯. あ る と す るBilling等. い を 抱 か せ る もの で あ る.硫 集 め ら れ た 粗bilirubin中. は塩 型. の説に疑. 酸 安 門 に よ る塩 折 法 で に は 尿 中 のbilirubinoid. が 悉 く含 ま れ て い る こ と は 吉 岡29)並 び に 小 牟 田 の 実 験 か ら も 明 らか で あ り,更 にion交 graphyに. 換chromato. よ る分 離 法 は この 粗bilirubin中. な る直 接bilirubinを. 6393. 直 接bilirubinは1/10規. の如 何. に 完 全 に分 離 し得 る理 想 的 な 分 離 法 で あ る.従. つて. 本 分 離 法 に よ り 得 られ たester型bilirubin分. 劃中. 上 の 所 見 は こ れ に 反 してEBⅡ. の す べ て,及. びEBＩ. 並 び に Ⅲ の 殆 ん ど が1/10規. 定苛性曹達で何. ん ら影響 を 受 けず小 坂 の 鹸 化 法 に よ り始 めて 鹸 化 さ れ 間 接bilirubinと た.こ. な るester型bilirubinで. あつ. の こ と は 先 に 小 坂 が5%のmethanol性. 加. 里 に よ る鹸 化 実 験 に 於 い て,鹸 及 びalcoholで. お り,こ の 分 劃 中 に 時 と してnaphthoresorcinol反. の 単 独 で は 直 接bilirubinは. の 存 在 の 見 られ な い こ と が あ. る の は, glucuron酸. 抱 合 がbilirubinの. 致 す る.而. しEBＩ. 並 び に Ⅲ に は1/10規. 定 苛 性 曹達. に よ り 加 水 分 解 さ れ 間 接bilirubinと labileな 直 接bilirubinの. な るalkali. 存 在 が 一 部 見 ら れ た.こ. の 直 接bilirubinはglucuron酸. 反 応 陰 性 のEBⅡ 反 応 陽 性 のEBＩ. 並び. に Ⅲ に の み 見 られ る こ と よ り し てglucuron酸 係 の あ る直 接bilirubinで. も考 え ら れ る.然. 理 後 に生 じ た 間 接bilirubin量 全ester型bilirubinの. のい う. しな が らalkali処 の測 定 か らそ の 量 は. 極 一 部 で あ つ た.. ester型bilirubin分. water. と関. あ り, Billing等. 劃 のPaperchromatogram. 各ester型bilirubin分. 直接化に. 間接. 変 化 しな い と 述 べ て い る こ と と よ く一. 4.. 応 陰 性 でglucuron酸. 化 に用 い た苛 性 加里. bilirubinに. glucuronideと 含まれて. な ると述 べ てい る. が,以. に は 存 在 せ ず, glucuron酸. も殆 ん ど 失 う こ と な く三 分 劃. に は 尿 中 の す べ て のester型bilirtbinが. 定 苛 性 曹 達 で 数分 間 に し. て 加 水 分 解 さ れ 間 接bilirubinと. 劃 をn‑butsaol‑ethanol‑. (4:1:2)を. 展 開 剤 と し てPaperchro‑. 必 ず し も必 要 で な い 証 拠 と も考 え られ る. matographyを. 3. ester型bilirubin分. 行 う と,. Fig.. 2に. 示 す 如 くEBＩ. に. 劃 に 及 ぼ すalkaliの 於 い て はRf. 0.32〜0.41,. 0.2〜0.25及. び0.14に,. 影響 EBⅡ. 各ester型bilirubin水. 溶 液 に1/10規. に 於 い て はRf. 0.12〜0.16に,更. にEBⅢ. 定 苛性 曹 に 於 い て はRf. 0.3〜0.39,及. び0.12〜0.16に. 各 々. 達 を同 量加え 数分 間 放 置後 溶液 を 同 規 定 の塩 酸 で注 意 して 中 和 し, chloroformを chloroformへ. 加 え 振 盪 し,色. 素の. の 移 行 状 態 並 び に移行 した色 素 の 性. Fig.. 2. form Nr. 状 を 検 討 した. EBⅡ. Pa. perch. bilirubin 2043. romatograms paper:. of. 層 へ の 移 行 は 全 く見 ら れ ず,残. 部 の水 層 を 小 坂 の 方. 法 で 鹸 化 す る と 色 素 は 悉 くchloroform層 にEBＩ. a. に 移 行 した が,殆. んど. の 色 素 は小 坂 の 鹸 化 法 に よ り始 め てchluroform層 に 移 行 し た. alkali処. 理 後 にchloroform層. に移 行. した 色 素 の 性 状 を し ら べ て 見 る と, chloroform層 は 淡 黄 色 を 呈 し, Gmelin試 呈 し, Ehrlich氏diazo試 く,倍 量 のethanolの. 薬 で 緑 色 よ り赤 紫 色 を 薬 に 対 して色 調 の変 化 な. 添 加 後 始 め て 赤 紫 色 を 呈 し,. 可 視 部 吸 収 曲 線 上450mμ. に 吸 収 の 極 大 を 示 し,明. ら か に 間 接bilirubinの. 性 状 を 具 備 し て い た.. が 直 接bilirubinの. に 求 め, alkali. labileを. 本 態 をglucuronide. そ の 特 性 の 一 つ に か か げ,. 12-14•Ž. Run:. に移 行 し. 並 び に Ⅲ に 於 い て は 多 くの 場 合 色 素. の 極 一 部 がchloroform層. Billing等. &. に 於 い て は 色 素 のchloroform Temperature:. た.次. each. Schleicher. 20-25cm Dereloping. n-butanol,. ethanol, (4:1:2). Solvent water. mixture. ester Schull.
(6) 6394. 物. 黄 色 のspotを spotの. 得 た が, EBＩ. のRf. 部. のRf. 0.2〜. 0.25のspotを. 除 き 他 はEhriich氏diazo試. 噴 霧 す る と1分. 間 以 内 に 赤 紫 色 を 呈 し,又Gmelin. 薬を. 試 薬 の 噴 霧 に よ り 紫 青 色 を 呈 し た が, spotの. 成. 法 も陽 性 を 示. 0.2〜0.25の. み 緑 色 調 を 帯 び て い た. EBＩ. 大. し た.又. 各ester型bilirubinをn‑. propanol‑water(4.. Fig. 3.. 1)で. Developing mixture. 展 開 す る とFig.. Solvent. 3に 示. n-Propanol,. water. (4:1). 黄色. 色 調 が 淡 い と き は 両 反 応 が 不 明 瞭 又 は 陰 性 で あ つ た. benzidine反. 応 は 各 黄 色spotに. 一 致 して 陽 性 で あ. つ た が,無. 処 置 の ま ま105℃. 15分. 色spotは. 黄 褐色 に変 化 す るので 判 定 は不 明確 で あ. つ た. Naphthoresorcinol反. 間 加 熱 して も黄. 応 は 各 黄 色spotに. 致 し て 青 色 を 呈 し陽 性 で あ つ た が,試. 一. 薬 中 に含 ま れ. て い る燐 酸 の み の 使 用 に 於 い て も 同 様 な 発 色 を 呈 す る の で こ れ も 判 定 は 困 難 で あ つ た.燐molybden酸 反 応 は 陰 性 で あ り, ninhydrin反 EBＩ. 及 び Ⅱ に 於 い てRf. あ つ た が,. EBⅢ. 応 は 時 と して. 0.07に 陽 性 を 示 す こ と は. に 於 い て は 常 に 陰.性 で あ つ た.次. に 各ester型bilirubinを. 濾 紙 にband状. せn‑butanol‑ethanol‑water(4.. に附 着 さ. 1. 剤 と し てPaperchromatographyを. 2)を. I:. ethanol水. Form. Bilirubin. isolated. by. II •V. by. のRf. 0.2〜0.25の. 直 接 反 応 を 呈 し,小 ん どchloroform層. で 抽 出 す. 抽 出 液 を 除 きdiazo. に 移 行 し, chloroform層 各 抽 出 液 に1/10規. を 同 量 加 え 数 分 間 放 置 後,同. はdiazo. 定苛性曹達. 規 定 の 塩 酸 で 中和 し. の 色 素 の 移 行 状 態 を 検 す る に, EBＩ. のRf. 0.14,. EBⅡ. のRf. 0.12〜0.16の. chloroformへ. のRf. 0.12〜0.16並. 各 油 出液 に 於 い て は 色 素の. びEBⅢ. のRf. 0.3〜0.39の. 液 に 於 い て は 大 部 分 の 色 素 がchloroformに chloroform層. は 間 接diazo反. す 如 くEBＩ EBⅡ. に 於 い は て 原 点 とRf. に 於 い て は 原 点 の み に, EBⅢ. Ｉ と 同 じ く原 点 とRf た.各spotに. 0.05〜0.1に. 相 当 す る黄 色band抽. 並 び にdiazo直. び にEBⅢ. の 移 行 は 全 く見 られ ず, EBＩ. 0.32〜0.41,及. 黄 色 色 素 は 殆 ん どchloroformに. い て は 色 素 のchloroform層. へ の 移 行 は 見 ら れ ず,. 移 行 し, 抽出. EBＩ. 並 び に Ⅲ のRf. 0.05〜0.1に. Rf. のRf. 0.12〜0.16の. 各. 反 応 は 各ester型bilirubinの. 0.3〜0.39の. に 比 較 的 鋭 い吸 収 び にEBⅡ. 各 抽 出 液 に 於 い て は400〜420mμ. に 比 較 的 偏 平 な 吸 収 の 極 大 を 有 し又EBＩ 〜0.25の. 抽 出 液 に 於 い て は640mμ. 収 の 膨 隆 を 示 し た, Naphthoresorcinol反 のRf. 0.14並. 0.16,. EBⅢ. び に0.2〜0.25, のRf. 0.12〜0.16の. は す べ て 陰 性 で あ つ た が, EBⅢ. のRf. 0.3〜0.39の. に 陽 性 で あ り,且. EBＩ. のRf. と390mμ. EBⅡ. 0.2 に吸. 応 はEBＩ のRf. 0.12〜. 各 油出 液 に 於 い て のRf. 0.32〜0.41,. 各 抽 出液 に 於いては著明. つmannose‑H2SO4‑thio91ycollabe. 移 行 し, chloroform. 原点 に止 ま る ものに於. 色 素 がchloroformに. のRf. 出 液 はGmelin. て は 各ester型bilirubinの. の. 0.32〜0.41並. 得. 各抽 出. EBⅡ. のRf. 黄 色spotを. 接 反 応 を 呈 し た. alkali処. 0.14,. 抽 出 液 に 於 い て は410〜420mμ. に 於 い て はEB. のRf. 応 を 呈 し た.各. び にEBⅢ. 0.05〜0.1に,. 層 はdiazo間. のRf. の 極 大 を 有 し, EBＩ. butanol-extract. 接 反 応 陽 性 で 小 坂 の 方法 で鹸 化 後. 液 の可 視 部 吸 収 曲 線 はEBＩ 0.12〜0.16並. by. methof. 坂 の 方法 で鹸 化 後 黄色 色 素 は殆. 間 接 反 応 を 呈 した.又. chloroformへ. precipitation. method III •V. る と, EBＩ. ionexchage. Chromatography. 行 い,各spot. に 相 当 す る 黄 色bandを50%. Ester. 展 開. べ て 陰 性 で, EBＩ. 於 い ては 大部 分 の. 移 行 し た.. naphthoresorcinol. 原点 に止 ま る ものす. 並 び に Ⅲ のRf. て は 著 明 に 陽 性 で あ つ た,そ 反 応. に の 抽 出 物 に2規. 0.05〜0.1に. てpaper. 定 塩 酸 を 同 量 加 え100℃. (5:5:1:3)を. 反 応 陽 性 のspotを. 見. 0.36にnaphthoresorcinol れ はglucuron酸. 上 の 結 果 か ら してEBⅡ. 於 い て は 全 くester型bilirubinの EBＩ. acetate. 行 う と, Fig. 4に. 得 た,こ. い た 対 照 て 一 致 した.以. 1. 展 開剤とし. chromatographyを. ら れ る 如 くRglucokse. 於い. こ でnaphthoresOrcinol. 時 間 加 水 分 解 し た も の をpyridine‑ethyl acetic acid‑water. 理 に対 し. を用 に. み で あ る が,. 並 び に Ⅲ に 於 い て はester型bilirubin以. 外.
(7) 胆 汁 色 素 に 関 す る研 究. Fig.. 4.. Ppaerchromatogram of the HCl - Hydrolysate of naphthoresorcinol. Fig.. 5.. labileでglucuron酸. 直 接bilirubinが 5.. Elution. curve. bilirubon. on. Column. positive spots Developing Solvemt: pyridine, ethyl acetate, acetic acid, water mixture (5:5:1:3). にalkali. 6395. of. the. cellulose. 18•~200. ester. form. Column mm. と密接 な関 係 の あ る. 分 離 さ れ た.. ester型bilirubin分. 劃 のcellulose. column. chromatography Naphthoresorcinol反. 応 陽 性 のEBＩ. n‑butanol‑ethanol‑water と し てcellulose い,流. 2つ. を. 見 ら れ る 如 く明. の 分 割 群 を 得 た.こ. び にdiazo直. 展 開 剤. 採 取. らか に区 別. し,各. し得 る 大 小. 坂 の 方法 で鹸 化 後 移 行 し,. 接 反 応 を 呈 し た.. chloroform. alkali処. 理 に対 し. て は 大 分 割 群 に 於 い て は 色 素 のchloroformへ 行 は 見 ら れ ず,小 chloroformに. 接 反 応 を 呈 し た.. られ. glucuron酸. る 如. chloroform層. naphthoresorcinol反. 群 に 於 い て は 陰 性 で,小 見. の 移. 分 割 群 に 於 い ては 大部 分 の色 素 が. 移 行 し,. (2ml.. each). くcolumn. chromatography. bilirubin以. 外 にglucuron酸. bilirubinを. 分 離 し 得 た が,そ. に 於 い て もester型 と 関 係 の あ る 直 接 の 量 はFig.. 5に. 見 ら. 比 して 遙 か に 僅 少 で. あ つ た.. 以 上 総 括 す る と黄 疸 尿 中 の 直 接bilirubinは 直 接bilirubinを bilirnbinで. 塩型. 除 き 殆 ん ど が 教 室 の 所 謂ester型. あ り,極. 一 部 にbilirubin. glucuronide. が 存 在 す る も の と 考 え られ る.. はdiazo間. 結. 応 は 大 分 割. 分 割 群 に 於 い て はFig.. 5に. 機 械 性 黄 疸 患 者 尿 を 用 い,従 ester型. く 明 ら か に 陽 性 で 然 もbilirubinと. 同 じ. 言 来 教 室 で 発 表 され た. 並 び に 塩 型 直 接bilirubin分. られ たester型. 量 と の 間 に 相 関 々 係 が 見 ら れ た.. 以 上 の 所 見 よ りPaperchromatographyと. numbers. れ る 如 くester型bilirubinに. れ ら は す べ てGmelin並. 色 素 の 殆 ん ど がchloroformに. Fraction. 行. し ら べ て 見 る と,. 接 反 応 陽 性 で,小. 層 はdiazo間. 2)を. collectorで. 中 のbilirubin量. 5に. 1.. chromatographyを. 下 液 をfraction. 採 取 液 Fig.. (4 column. を 用 い,. glucuron酸. 離 法 に よ り得. 並 び に 塩 型 直 接bilirubinに. と の 関 係 を 検 討 した.. 就 き.
(8) 6396. 物. 1.. 如 何 な る 分 離 法 に 於 い て. bilirubinはglucuron酸 2.. Ester型. も,塩. 部. 型. 直 接. 直 接bilirubinの. 中,小. 以 上 の 結 果 か ら し てBilling等. 牟 田の 沈澱. 直 接bilirubinはglucuron. ester型. 坂 本 のion交. binは. curonideの. 換chromatography法. の 量 は 全ester. 極 一 部 で あ り 殆 ん どが 教 室 の所 謂. 直 接bilirubinで. あ つ た.. 並 び に. 出 法 に よ り 得 ら れ たester型. 多 く の 場 合glucuron酸. のbilirubingln‑. 存 在 は 認 め る に し て も,そ. 型bilirubinの. 酸 反 応 陰 性 で あ つ た.. butanol抽. 成. の 量 は 極 一 部 に 過 ぎ な か つ た.. 反 応 陰 性 で あ つ た.. 法 に よ り 得 ら れ たester型. 3.. 大. 直 接biliru. 反 応 陽 性 で,時. に陰. 性 の こ と も あ つ た. 4.. Glucuron酸. 反 応 陽 性 のester型. 分 劃 か らPaper並. び にcolumn. よ りglucuron酸 ester型. 直 接bilirubin. chromatographyに. と 関 係 の あ る 直 接bilirubinが. 直 接bilirnbinと. は 別 に 分 離 さ れ た が,そ. 主 1). Van. den. ochem.. Bsrgh, Z.. A. A. H.. 77,. 90. 小 坂. 東 京 医 事 新 誌,. 3). 原:医. 学 研 究,. 4). 島 田. ・医 学 研 究,. 5). Sakamoto, 373. 22,. P.:. Bi. 16). 68,. 14. (1951). 17). (1952) 1894. Yahata,. 坂 本,近. 藤:未. 山 岡:日. 本 消 化 器 病 学 会 雑 誌,. 学 研 究,. 27,. 発 表. ・日 本 内 科 学 会 雑 誌. , 42,. 531. J.. 48,. 1. (1950). (1953). J.. 57,. Clin.. Path.. 226,. B. H... J.. B. H.:. Biochem.. 12) Billing,. B. H.. Clin.. & Lathe,. & Billing,. B. H... path. 8,. G. H.:. XXX.. Biochem.. B. H', Cole,. R.. E.:. P. G. & Lathe,. G. H... 774 (1957). Science Chem.. F.:. J.. 23) Ahrens,. E. H. 195,. V... J.. Biol,. 1270. (1951). K... Acta. Med .. R. H... Biochem.. Smith,. biol.. Invest.. 30, 7 (1951). Chem.. jung & Craig,. 171, 725 (1947) L. C.:. J biol .. 763 (1952) Hoppe-Seyl.. Z.. 224 (1955). 25) Horrocks, R. H.. Nature 26) Patrdge , S. M.: Nature S. M.:. 124, 76 (1956). 28). 日 本 化 学 会 編 ,実. Listy,. 29). 吉 岡:医. 1329 (1956). J.. F. G. & Dorfel , H.:. 27) Partride,. 50,. ,. & Cleghorn,. Clin.. Z. . J.. 301,. J.:. M.. Thompson , D. C. D., Kasdon, S. C. & Hombu. 22) Dische,. J.. ,. (1957). & Komuta,. L.. B., Bonner.. Chem.. Axelod. 11, 81 (1957). W. H.,. 24) Fischer,. &. (1957). 21,. 1 (1937). 126 (1955). J. 56 (1954). 63, 69 (1956). 65,. 449. T.. 285. Carbone. Z. 296,. 6,. 514 (1954). 11) Billing,. J.. Mに&. 21) Fishman,. rger, G. H.. 10) Billing,. 15) Talafant,. G.. 19) Sakamoto,. 99 (1953). 14) Schmid,. Grodsky,. L.. 70,. 20) Jendrassik,. 8) Cole, P. G. & Lathe, G.:. 9) Cole, P. G., Lathe,. Hammerker,. Biochem.. Okayama. 6). Biochem.. R.,. 18) Šâ“c.ˆãŠwŒ¤‹†,. K.:医. 7). 13) Billing,. Schmid,. Chem.. (1954). (1957). Biochem.. 献. Arch.. 536 24,. &. Muller,. 考 文. (1916). 2). T.. &. 要 参. 164, 444 (1949) 153,. 270 (1946). Biochem . J. 42. 験 化 学 講 座:. 学 研 究, 25,. 321. 238 (1949). 2基 礎 技 術 Ⅱ.. (1955).
(9) 胆 汁 色 素 に 関 す る研 究. Studies Part. 1.. Relationship. bins,. Both Urine. on Bile Pigment. between. Ester. 6397. form. Glucuronic. and. of Patients. Acid. Salt form,. with. and. Isolated. Mechanical. Direct from. Biliru the. Jaundice. By Taisei Department of Internal. Monobe. Medicine Okayama University. (Director:. Medical School. Prof. Kiyowo Kosaka). With the urine of the patient with mechanical jaundice the author isolated direct biliru bins, both ester form and salt form, by the toutine techniques employed in our laboratory, and studied the realtionship between glucuronic acid and these bilirubins. 1. Regardless of the techniques used in isolating direct bilins of salt form the glucuronic acid reaction proves to be always negative. 2 Of the direct bilirubins of ester form, the one isolated by Komuta's precipitation method is negative to the glucuronic acid test. 3. Of direct bilirubins of ester form obtained by the ion-exchange chromatography as well as by butanol extraction method, most of them are positive to the glucuronic acid test but some prove to be negative. 4. By paper and column chromatography it has been possible to isolate from the ester form direct bilirubin fractions positive to glucuronic acid the direct bilirubin that is related to glucuronic acid aside from the ester-form direct bilirubins, but the quantity is trivial. From these results the existence of bilirubin glucuronide as contended by Billing et al can be understandable, but its quantity is an extremely small portion of the total ester-form bilirubins, and almost all of them prove to be what we in our laboratory call "ester-form direct bilirubins".
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