2015 年 4 月 3 日受理 連絡責任者：築山拓司（[email protected]）
イネユビキチン様タンパク質遺伝子
Rurm1
がメチルビオロゲンによって
誘導される酸化ストレス応答におよぼす効果
河西 恵
1）・築山拓司
1）・寺石政義
1）・奥本 裕
1）・谷坂隆俊
1, 2） 1） 京都大学大学院農学研究科 2） 吉備国際大学地域創成農学部 要旨：イネ品種銀坊主の種子にガンマ線照射して得られた細粒突然変異系統 IM294 は，イネユビキチン様タンパ ク質遺伝子 Rurm1 （Rice ubiquitin-related modi¿ er-1）の機能を喪失している． RURM1 と高い相同性を示す酵母の Urm1p は，酸化ストレス応答タンパク質 Ahp1p の機能を修飾することで酸化ストレス応答に関与することから， Rurm1 もイネの酸化ストレス応答に関与している可能性があるがその詳細は未解明である．本研究は，イネの酸 化ストレス応答における Rurm1 の役割を明らかにするために，酸化ストレス誘導薬剤であるメチルビオロゲン （MV）に対する銀坊主および IM294 の耐性を調査した．MV 処理によるクロロフィル a，b 含量の減少程度を調べ たところ，処理濃度が高くなるにつれて銀坊主および IM294 いずれにおいてもクロロフィル含量は大きく低下し た．しかし，クロロフィル含量の減少程度に関しては，銀坊主・IM294 間に有意差はなかった．このことから， イネにおいて，Rurm1 は MV によって誘導される酸化ストレスに対する防御機構には関与しないことが示唆された． キーワード：イネ，ユビキチン様タンパク質，メチルビオロゲン，酸化ストレス緒 言
水稲品種銀坊主のガンマ線種子照射によって得られた細 粒突然変異系統 IM294 は，非自律性トランスポゾン mPing の挿入によってイネユビキチン様タンパク質遺伝子 Rurm1 （Rice ubiquitin-related modi¿ er-1） の 機 能 を 喪 失 し て い る （Nakazaki et al. 2003）．IM294 は，細粒化に加えて，出穂 遅延，稔性低下，発芽率低下など種々の生育異常を示すこ と（Tsukiyama et al. 2013）から，Rurm1 はイネの正常な生 育に不可欠であることが示唆される．ユビキチン様タンパク質は，ユビキチンと構造的に類似 したタンパク質群の総称である．一般的にユビキチン様タ ンパク質は，標的タンパク質に共有結合することによって その機能を修飾する （Hochstrasser 2009）．RURM1 は，酵 母のユビキチン様タンパク質 Urm1p （Furukawa et al. 2000） と推定アミノ酸配列において 41 % の相同性を示す．酵母 において，Urm1p は活性化タンパク質 Uba4p と共有結合 した後，抗酸化タンパク質の一つであるペルオキシレドキ シ ン Ahp1p （Alkyl hydroperoxide reductase） に 結 合 し， そ の機能を修飾する（Goehring et al. 2003a）．urm1 欠損株は， 酸化ストレス応答性の低下だけでなく，出芽や栄養検出な ど 様 々 な 表 現 型 に お い て 異 常 を 示 す（Goehring et al. 2003b）．また，イネにおいても Ahp1p ホモログの存在が 確 認 さ れ て い る こ と か ら（ 未 発 表 デ ー タ ），Rurm1 は， URM1 と同様に，酸化ストレス応答に関与している可能性 がある． 本研究では，イネの酸化ストレス応答における Rurm1 の役割を明らかにするために，銀坊主および IM294 を酸 化ストレス誘導薬剤であるメチルビオロゲン（MV）で処 理し，クロロフィル含量を測定することで MV によって 誘導される酸化ストレスに対する耐性を調査した．
材料および方法
MV に対する感受性を調べるために，葉片を種々の濃度 の MV 水溶液で処理した．木村氏水耕液を用いて 3.5 葉期 まで育苗した銀坊主および IM294 の植物体から展開中の 第 4 葉を 2 cm 切り出し，新鮮重を測定した後，5 mm の葉 片に細断した．葉片を 1 mL の蒸留水（コントロール区） あるいは MV 水溶液（1，10，50，100 および 250 μM）に 浮かべ，デシケーターを用いて 10 分間真空状態にした後， 30°C で 12 時間静置した．処理後の葉片を 3 mL のジメチ ルホルムアミド（DMF）に浸し，冷暗所で 12 時間静置し， クロロフィルを抽出した．分光光度計を用いて抽出液の 646.8 nm および 663.8 nm における吸光度を測定した．ク ロロフィル a および b の濃度は，Porra ら（1989）の方法 に従って算出した．以下に算出式を示す． Chlorophyll a (μM) = 13.43 A663.8 – 3.47 A646.8 Chlorophyll b (μM) = 22.9 A646.8 – 5.38 A663.8 Chlorophyll a+b (μM) = 19.43 A646.8 + 8.05 A663.8 MV 処理によるクロロフィル含量の経時変化を調査した． 上記と同様に第 4 葉の葉片を 1 mL の蒸留水（コントロー ル区）あるいは 10 μM MV 水溶液で処理した．処理 3，6，9， 12，15，18，21 および 24 時間後に葉片をサンプリングし， 上記と同様の方法でクロロフィルを抽出・測定した．結果および考察
MV は，酸化ストレス誘導薬剤であり，パラコートとい う名称で農業用非選択性除草剤として広く利用されている． 55 作物研究 60：55 − 57（2015）Copyright 近畿作物・育種研究会 （The Society of Crop Science and Breeding in Kinki, Japan）
植物体内に取り込まれた MV は，光化学系Ⅰにおいて光 化学反応複合体である鉄・硫黄クラスターから電子を奪い，
細胞内でスーパーオキシドアニオン（O2-）や H2O2などの
活性酸素種を生じる （Lewinsohn and Gressel 1984）．MV に よって生じた活性酸素種は葉緑体を攻撃し，植物体の生育 を著しく阻害する．本研究においても，銀坊主および IM294 を播種 1 週間後から水耕液に 10 μM MV を添加し て育苗すると，いずれの系統も生育が阻害された（第 1 図）． MV に対する感受性を明らかにするために，葉片に異な る濃度の MV を 12 時間処理したところ，銀坊主および IM294 いずれにおいてもクロロフィル a および b の含量は 処理濃度の増加に伴い大きく減少した（第 2 図）．しかし， クロロフィル a および b 含量の減少程度に関しては，いず れの濃度においても銀坊主と IM294 間に有意差はなかっ た．また，クロロフィル a および b 含量がそれぞれ 50 % および 25 % 減少する MV 濃度を算出したところ，クロロ フィル a に関しては銀坊主が 4.59 μM，IM294 が 4.87 μM， クロロフィル b に関しては銀坊主が 1.90 μM，IM294 が 1.57 μM であった．これらのことから，MV に対する感受性は， 銀坊主と IM294 間で異ならないことが明らかになった． MV 処理によるクロロフィル含量の経時変化を評価する ために，銀坊主および IM294 の第 4 葉の葉片を 10 μM MV を含む木村氏水耕液で処理した．その結果，コントロー ル区と比較して，MV 処理区ではクロロフィル a および b の含量ともに処理 12 時間後以降に大きく減少した（第 3 図）．しかし，コントロール区および MV 処理区いずれに おいても，クロロフィル含量に関して銀坊主と IM294 の 間に有意差はなかった． 本研究において，銀坊主および IM294 いずれにおいて も MV 処理によるクロロフィル含量の低下が確認された． しかし，MV に対する感受性およびクロロフィルの経時的 減少のいずれに関しても，銀坊主と IM294 間に有意差は なかった．このことは，Rurm1 は MV によって誘導され る酸化ストレスに対する防御機構に関与しないことを示唆 している．酵母において urm1 欠損株は，ジアミドに対し て 感 受 性 に な る こ と が 知 ら れ て い る （Goehring et al. 2003a）．ジアミドはチオール基に作用する酸化剤であり， 生体内に存在するトリペプチドチオールであるグルタチオ ンを酸化する （Kosower and Kosower, 1995）．われわれのこ れまでの研究から，IM294 は，銀坊主と比較して，ジアミ
a. Gimbozu Control b. IM294 Control
c. Gimbozu MV treatment d. IM294 MV treatment
第 1 図 播種後２週間木村氏水耕液で育苗した植物体 （a, b）と播種後１週間から 10 μM MV を添 加した木村氏水耕液で１週間育苗した植物体 （c, d）．図中の白線は 5 cm を表す． 第 2 図 銀坊主と IM294 における MV 濃度に伴うクロ ロフィル含量の変化．3.5 葉期の植物体の第 4 葉を異なる濃度の MV で 12 時間処理した 後，クロロフィル含量を測定した．マーカー およびエラーバーはそれぞれ 3 反復の平均値 および標準誤差を示す． 第 3 図 銀坊主と IM294 における MV 処理時間に伴う クロロフィル含量の変化．3.5 葉期の植物体 の第 4 葉を 10 μM MV 水溶液あるいは蒸留 水で処理し，クロロフィル含量を測定した． マーカーおよびエラーバーはそれぞれ 2 反復 の平均値および標準誤差を示す． 作物研究 60 号（2015） 56
ド処理によって根の伸長が大きく阻害されることが明らか になっている（Tsukiyama et al. paper in preparation）．した がって，イネにおいて Rurm1 は，URM1 と同様に，チオ 基特異的酸化剤に対する防御機構に特異的に関与している と考えられる．Rurm1 を介した酸化ストレス応答機構の解 明は，イネの環境ストレス耐性育種の一助となることが期 待される．
引用文献
Furukawa, K., N. Mizushima, T. Noda and Y. Ohsumi (2000) A protein conjugation system in yeast with homology to biosynthetic enzyme reaction of prokaryotes. J. Biol. Chem. 275: 7462-7465.
Goehring, A. S., D. M. Rivers and G. F. Sprague, Jr. (2003a) Attachment of the ubiquitin-related protein Urm1p to the antioxidant protein Ahp1p. Eukaryotic Cell 2: 930-936. Goehring, A. S., D. M. Rivers and G. F. Sprague, Jr. (2003b)
Urmylation: A ubiquitin-like pathway that functions during invasive growth and budding in yeast. Mol. Biol. Cell 14: 4329-4341.
Hochstrasser, M. (2009) Origin and function of ubiquitin-like proteins. Nature 458: 422-429.
Kosower, N. S. and E. M. Kosower (1995) Diamide: An oxidant probe for thiols. Method. Enzymol. 251: 123-133.
Lewinsohn, F. and J. Gressel (1984) Benzyl viologen-mediated counteraction of diquat and paraquat phytotoxicities. Plant Physiol. 76: 125-130.
Nakazaki, T., Y. Okumoto, A. Horibata, S. Yamahira, M. Teraishi, H. Nishida, H. Inoue and T. Tanisaka(2003) Mobilization of a transposon in the rice genome. Nature 421: 170-172.
Porra, R., W. Thompson and P. Kriedemann (1989) Determination of accurate extinction coefficients and simultaneous equations for assaying chlorophylls a and b extracted with four different solvents. Biochim. Biophys. Acta-Bioenerg. 975: 384-394.
Tsukiyama, T., S. Teramoto, K. Yasuda, A. Horibata, N. Mori, Y. Okumoto, M. Teraishi, H. Saito, A. Onishi, K. Tamura and T. Tanisaka (2013) Loss-of-function of a ubiquitin-related modi¿ er promotes the mobilization of the active MITE mPing. Mol. Plant 6(3): 790-801.
The effects of ubiquitin-related modi¿ er gene Rurm1 on the oxidative stress
response induced by methylviologen in rice
Megumi Kawanishi1）, Takuji Tsukiyama1）, Masayoshi Teraishi1）, Yutaka Okumoto1）, Takatoshi Tanisaka1, 2） 1）Graduate School of Agriculture, Kyoto University
（Kitashirakawa, Sakyouku, Kyoto 606-8502, Japan）
2）Department of Agricultural Regional Vitalization, Kibi International University
（Minamiawaji, Hyogo 656-0484, Japan）
Summary: A slender glume mutant line IM294, which was induced with gamma irradiation of seeds of Gimbozu, has a
non-functional Rurm1 (Rice ubiquitin-related modifier-1) gene. Yeast Urm1p, which shares about 41% sequence identity with RURM1, involves in oxidative stress response via the posttranscriptional modi¿ cation of antioxidant protein Ahp1p, indicating that Rurm1 may function in the oxidative stress response in rice. In this study, we evaluated sensitivity against methylviologen (MV) to elucidate the role of Rurm1 in oxidative stress response in rice. Although the chlorophyll content largely decreased with the increase of MV concentration, there was no signi¿ cant difference about the degree of decreased chlorophyll content between Gimbozu and IM294. It was therefore indicated that Rurm1 did not involve in the stress defense mechanism against MV in rice.
Keywords: rice, ubiquitin-like proteins, methylviologen, oxidative stress
Journal of Crop Research 60: 55-57（2015） Correspondence: Takuji Tsukiyama（[email protected]）
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