ア ニ ジ ノ 化 合 物,
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(2) 788. 福. 一過 性 に著 明 に増 加 す るこ と. ,及. 島. び 投 与24〜48. 時 間 後 に は 一 旦 正 常 値 に 回 復 す る が,投. 与2ヶ. 正. 登. 1.1ml/min;フ. ェナ ンス レ ンキ ノ ン 溶 液 の 流 速,. 0.5ml/min;水. 酸 化 ナ トリウ ム溶 液 の 流 速, 0.5ml/. 月 後 に は 再 び 増 加 して い る こ と を観 察 し た.従. min:恒. っ て,さ. m;検. 出 器,蛍. nm,. Em495nm);試. ら に脳 内GAAとMGの. 明 ら か に す る た め,ラ. 生 成経過 を. ッ ト脳 ホ モ ジ エ ネ ー トに. 鉄 塩 と過 酸 化 水 素 を加 え て イ ン キ ュ ベ ー ト し,. 0.4Nク. in vitroに. 3.50,. お け る グ ア ニ ジ ノ化 合 物 と ラ ジ カ ル. 温 槽, 70℃:反. 光 光 度 計(Jasco. (3) pH 5.25, (2.4分)(4). 第1節. 法. 0.4Nク. は,オ. 度55%で. 料. 第3節. は給. 1)試. 飼 育 した.飼 使 用 し,水. ラ ッ トを エ チ ル エ ー テ ル麻 酔 下 で 固 定 後,大 感 覚 運 動 領 野 に0.1M塩 マ イ ク ロ シ リ ン ジ で,. 速 さで 注 入 し た.対. in vitroの. 実験. 化 第二 鉄溶. 1分 間 に1μlの. 照 群 に は 生 理 食 塩 水5μlを. 19,. pH. フ. ロ ン棒 付 ガ ラ ス 管 で ホ モ ジ ェ ナ イ ズ した.次. い. で ホ モ ジ ェ ネ ー ト0.5mlに0.1M塩 液 を5μl,過 〜90分. 酸 化 水 素 を50μl加. を0.5ml加. 30, 60分,. 月 後 に,ラ. 24時. 条 体,視. 方 法 に 従 い,大. 床 下 部,中. 脳,橋. 脳 皮 質,海. and. 馬,線. 延 髄 及 び小 脳 に部位. 別 し,分 析 開 始 まで 試 料 を‑30℃ 2)グ. 間,. ッ トを 断 頭 し た.次. い で 直 ち に 全 脳 を 氷 上 で 摘 出 後, Glowinski Iversen40)の. に 保 存 し た.. 析 開 始 まで‑30℃ 分 析 に は,試 2). 凍 結 試 料 を解 凍 後,試. ,反. いで ホモ ジ. (日本 電 子JEOL. 加 え,ピ. られた上 清 にDowex. ク リ ン 酸 を除 去 後,ろ. そ の ろ 過 液 を 減 圧 乾 固 し,残 溶 解 後,そ. の50μlを. 酸. フ ェナ ンス. 後 よりESR. ラ ジ カ ル 量 は,内. アニ. ジ ノ化 合 物 の 分 析 を 行 な っ た.. を使 用 し,酸. 化 マ ン ガ ン の 信 号 強 度 と各 ラ ジ カ. ル の 信 号 強 度 と の 比 を 求 め,つ. ラム, Guanidino. 2, 6,. の 比 に よ り,ス. アニ ジノ化 合物 の分 析 条 件 は次 の 通 pak(4.2×125mm,. 京);カ ラム 温 度, 70℃;溶. 用 い てOH. 部 標 準 物 質 に酸 化 マ ンガ ン. piperidine‑1‑oxyl(TEMPOL)の. り で あ る:カ. キサ. spectrometer. JES‑FE1×G)を. 数 の2,. Jasco,東. れ. 応 液 を特 殊 偏 平 水 溶 液 セ ル に 移 加60秒. グ ラ フ(Jasco. 京)を 用 い て,グ. り,こ. え た の ち,ミ. レ ン キ ノ ン反 応 を繰 み 込 ん だ 高 速 液 体 ク ロ マ ト G‑520,東. に 凍 結 し た.. ラ ジ カ ル 及 び 過 酸 化 中 間 体 ラ ジ カル を分 析 した.. 過 した.. 査 を0.01N塩. た ラ ジ カルの. 料 を200μlと. 1‑oxide(DMPO)を20μl加. ガ ラ ス 管 で ホ モ ジ ェ ナ イ ズ し た.つ ェ ネ ー ト を遠 心 分 離 し,得. に保 存 した.ま. に トラ ッピン グ剤, 5, 5‑dimethyl‑1‑pyrroline‑. フ ロ ン棒 付. な お,グ. 遠 心 した.得. よ る ラ ジカ ル の分 析. ク リ ン酸 を加 え,テ. 組 織 に1%ピ. 2.2)で. で0. リク ロ ル酢酸. 転 で15分. 料 を 直 ち に‑80℃. ESRに. し, DMPO添. (pH. 料 に30%ト. え, 3,000回. ーで攪 拌 後. ア ニ ジ ノ化 合 物 の 分 析. 2×8を. え, 37℃. い で グ アニ ジ ノ. ら れ た 上 清 を グ アニ ジノ化 合 物 分 析 試 料 と し,分. 塩 化 第 二 鉄 溶 液 注 入15, 48時 間 及 び2ヶ. 化 第 二鉄 溶. イ ンキ ュ ベ ー ト した .次. 化 合 物 の 分 析 に は,試. 料 の採 取. 化. 量 加 え,テ. 第3節. グア ニ ジノ化 合 物 の分 析. リス 塩 酸/0.1M塩. 7.4)を5倍. 同 様 に して 注 入 した,. 1)試. メチ ル ホ ル ム ア ミ ド. 料の作成. カ リウム(1:. て ん か ん原性 焦 点 の作 成. 液5μlを. 酸 化 ナ トリウム(10分);. 酸 化 ナ ト リ ウ ム, (2) 9, 10‑. ラ ット脳 組 織 に0.03Mト. 水 ビ ン で 自 由 に 摂 水 さ せ た.. 脳 皮 質,左. 1N水. エ ン酸 ナ トリ ウ ム. フ ェ ナ ン ス レ ンキ ノ ン/ジ. リエ ン タ ル 酵 母MFを. 第2節. 0.4Nク. (500mg/ml).. ラット(Sprague‑Dawley,雄)を. 使 用 し,室 温24℃,湿. pH. エ ン酸 ナ トリ ウ ム緩 衡 液. pH 10.0,. 蛍 光 試 薬, (1) 2N水. 実験 動 物. 体 重 約250gの. Ex365. エ ン酸 ナ トリ ウ ム 緩 衡 液(2.8分). 緩 衡 液(3.0分)(5) 方. FP‑110,. エ ン酸 ナ トリウム緩 衡 液(9.5分)(2). 焦 点 形 成 メ カ ニ ズ ム の 一 面 を と ら え た. 験. I.D.×5. 料, 50μl;溶 出 液, (1)pH 3.00,. 0.4Nク. の 生 成 に つ い て 検 討 し,鉄 塩 誘 導 て ん か ん 原 性. 実. 応 コイル, 0.5mm. 出 液 の 流 速,. な お,用. いで 既知 ス ピ ン. 6‑tetramethyl‑4‑hydroxyl 信 号 強度 と. ピ ン数 で 表 示 し た.. い た ラ ジ カ ル の 分 析 条 件 は,次. お りで あ る: power, sec; modulation,. 8.0mW; 0.2mT;温. response, 度,室. の と 0.3. 温; ampli.
(3) 鉄塩 誘 導 て ん か ん原性 焦 点 組織 に お け る グア ニ ジ ノ化合 物 の 変 動 に関 す る研 究 tude, sweep. 3.2×1,000;. 第4節. time,. magnetic. field, 335±5mT;. propionic. 実験 試 薬 acid,. acid(Sigma),. stman),. 10μM),. acid(第. 山 化 学),. acid(和. dmoethanesulfonic. 光 純 薬)及. acid(小. 井 化 学), びguani. 野 薬 品)を. 使 用 し. acidはMori. et. al.38). two‑tailed. Student's. t‑test. 験. 結. ラ ッ ト脳 内 グ ア ニ ジ ノ 化 合 物 1Aは,. 12種. の グ ア ニ ジ ノ化 合 物 標 品 混. 合 液 の ク ロ マ ト グ ラ ム で あ る.左 noethanesulfonic dinosuccinic. Fig. 1. 照 ラ ッ ト大 脳 皮 質 の グ ア ニ ジ. 脳,橋. 条 体,視. 2,. HArg及 Table. 床 下 部,中. れ ぞ れGAA,. NAA,. びMGが. acid(GES, acid(GSA,. よ りguanidi 10μM),. 5μM),. guani. α‑guanidi. 延 髄 及 び小 CRN,. GBA,. 検 出 定 量 され た(Fig.. 1〜5). アニ ジノ化 合物 の うちGAA. 時 間 経 過 に従 って,い. ず れ も一 過 性 の. 著 し い 変 動 を示 した の ち, 2ヶ 月 後 に お い て は. ち, GAAは,鉄. 果. びMG(20μM). 出 現 し た.. 有 意 の 増 加 が 認 め ら れ た(Fig.. 実. 第1節. 20μM)及. 鉄 塩 投 与 後 に は,グ. を 用 い て 行 な っ た.. 20μM),. homoarginine(HArg,. 海 馬,線. 脳 か ら,そ. とMGが. 有 意 差 検 定 は,. creatinine(CRN, acid(GBA,. ッ トの 大 脳 皮 質,. に よ っ て 合 成 さ れ た も の を 使 用 し た. 第5節. Fig.. 1Bは,対. guanidino. ノ化 合 物 の 分 析 例 で あ る.ラ. Arg,. た. α‑Guanidinoglutaric. 20μM),. guanidine(G,. Fig.. guanidino. 一 薬 品), creatinine(半. guanidinoacetic. 3μM),. の 順 に そ れ らのpeakが. びmethylguanidine・HCl arginine(片. GAA(3μM),. 3μM),. acid(GPA,. arginine(Arg,. N‑acetylarginine・H2O(Ea. guanidine・HCl及. butyric. 20μM),. 50μM), guanidinobutyric. guanidinopropi. homoarginine・HCl(Calbiochem),. (東 京 化 成),. acid(GGA,. N‑acetylarginine(NAA,. 0.5分.. Guanidinosuccinic onic. noglutaric. 789. 2〜7).す. 塩 投 与15分 後 に,海. なわ. 馬,視. 下 部,中. 脳 及 び 小 脳 で 有 意 に増 加 し(Fig.. 投 与30分. 後 に は 線 条 体,視. 意 に 増 加 して い た(Fig. に は 逆 に, GAAは 中 脳,橋. 床 2),. 床 下 部 及び小 脳 で有. 3).し. か し,投 与60分. 大 脳 皮 質,海. 馬,視. 後. 床 下 部,. 延 髄 及 び小 脳 で 有 意 に低 下 し(Fig. 4),海. 馬 におい ては投 与24時 間 後 にも低 下 して いた(Fig. 5).. Chromatogram of guanidino compounds.. A. Standard substances,B. rat cortex..
(4) 790. 福. Fig.. 2. Levels ferric. Fig.. 3. Levels ferric. of methylguanidine chloride. injection.. of methylguanidine chloride. injection.. 島. and The. and Values. 正. 登. guanidinoacetic values. are. acid. guanidinoacetic are. in the. means•}SEM. means•}SEM. acid. rat. of. in of. the 6. brain. 15min. after. 5 determinations.. to. rat. brain. 30min. 7 determinations.. after.
(5) 鉄塩 誘 導 て んか ん原 性 焦 点組織 にお け る グアニ ジ ノ化 合 物 の 変動 に関 す る研 究. Fig.. 4. Levels ferric. Fig.. 5. of. methylguanidine. chloride. and. injection.. The. Levels. of methylguanidine. hours. after. 5. to. 6. ferric. determinations.. chloride. guanidinoacetic values. and. are. acid. in the. means•}SEM. of. guanidinoacetic. injection.. The. acid values. rat 5. brain. in the are. 60min. after. determinations.. rat. means•}SEM. brain. 24 of. 791.
(6) 792. 福. Fig.. 6. Levels. of. hours. after. 7. to. 10. methylguanidine ferric. and. chloride. 正. 登. guanidinoacetic. injection.. acid. The. values. 与48時. 間 後 に は, GAAは. 線 条 体,小. 脳 で 増 加 し(Fig. 6),さ 大 脳 皮 質,海. 大 脳 皮 質,. 与30分. 馬,線. 馬 及 び 視 床 下 部 で低 下 し て い た.投. 条体. 投 与24時 与15分 後 に 海 馬,視. 中 脳 及 び 小 脳 で 有 意 に 増 加 し(Fig.. 3).つ. は,大. 脳 皮 質,海. 床 下 部,. 2),投. 与30. 床 下部 及 び小 脳 で増 加 し い で 投 与60分. 馬,線. 条 体,視. 間 後 に は, MGは,大. 時 間 後 には,対 そ の後,投 海 馬,線. 与2ヶ 月 後 に はMGは,大. GBA,. Arg及. 4),投 脳及 び. か し投 与48 6).. 脳 皮 質,. 7).. その 他 の グ アニ ジノ化 合 物,す びCRNは,. GAA及. 脳 皮 質,海. 馬,線. 条 体,. 下 して い た.な. お投 与2ヶ. 月 後 に は,大. 脳皮質. に お い て の み 有 意 の 低 下 が 認 め られ た(Table. 1).. お け る未 同 定 の ピ ー ク と重 な っ た た め に 定 量 分. 脳 及 び 小 脳 で 著 明 に増 加 して. い る こ と が 観 察 さ れ た(Fig.. 間 後 に は,大. 視 床 下 部 及 び 小 脳 で 増 加 し,中 脳 と橋 延 髄 で 低. な お, 48時 間 後 のNAAは,ク. 照 群 の 値 に一 旦 回復 した(Fig.. 条 体,中. 与60分 後 に. 大 脳 皮 質 と小 脳 で 低 下 していたが. 床 下 部,中 脳,. 脳 皮 質,中. 小 脳 で まだ 低 下 して い た(Fig. 5).し. 後 に は 線 条 体 で 有 意 に 増 加 し,海. 後 に は, MG. 橋 延 髄 及 び 小 脳 で 逆 に 低 下 した の ち(Fig. 与24時. of. 与15分 後 に視 床 下 部 と小 脳 で 有 意 に 増 加. 7).. て い た(Fig.. 48. し,投. た(Fig.. 条 体,視. brain. は,投. は, NAAは. 分 後 に は,線. rat. means±SEM. ら に 投 与2. 及 び小 脳 で著 明 に増加 してい るこ とが観 察 され. 他 方, MGは,投. in the are. determinations.. しか し,投. ヶ月後 に は, GAAは. 島. 析 不 可 能 で あ っ た. GBAは,投. びMGほ. 大 き な 変 動 は 認 め ら れ な か っ た.す なわち, NAA. ど. 与30分. 脳 皮 質 で 有 意 に 増 加 して い た が,投 は 中 脳 と小 脳 で 増 加 し て い た.し ヶ 月 後 に は,小 Argは,海. 馬 で 鉄 塩 投 与30分. か し,投. 与48時. 橋 延 髄 で 低 下 し,投. 与2ヶ 3).. (Table. 後 に 与2 2).. 後 に減 少 し, 60. か し,投. 変 動 は 認 め ら れ な か っ た(Table 投 与30分. 後 に大. 与60分. 脳 で 逆 に 低 下 して い た(Table. 分 後 に 増 加 して い た.し はArgは. な わ ちNAA,. ロ マ トグ ラ ム に. 間後 に. 月後 には HArgは. 後 に大 脳 皮 質 で の み 増 加 が 認 め ら れ た. 4).. CRNは,鉄. 塩 投 与後 の早 期 に は変.
(7) 鉄 塩 誘 導 て ん か ん原性 焦 点組 織 に おけ る グア ニ ジ ノ化 合 物 の 変動 に関 す る研 究. Fig.. 7. Levels. of. months of. Table 1. The ap<0. values .05,. to. 6. ferric. the cp<0.001. and chloride. guanidinoacetic injection.. acid. The. values. in. the. are. rat. brain. 2. means±SEM. determinations.. N‑Acetylarginine. represent bp<0.01,. 5. methylguanidine after. 793. means±S. vs. level in the rat brain after ferric chloride injection. E. M.. with. experimental. numbers. in. parentheses.. control.. 動 が 認 め られ なか っ たが 投 与48時 間 後 に海 馬. が 認 め ら れ た(Table. 線 条 体,視 床 下 部 及び 橋 延髄 で低 下 して い た.. 第2節. また投 与2ヶ 月後 にはCRNは. 化 水 素 添 加 に よ るMG及. 大脳 皮 質 で有 意. に増 加 し,視 床 下部 で著 明 に低 下 してい るこ と. 5).. ラ ッ ト脳 ホ モ ジ ェ ネ ー トへ 鉄 塩 と過 酸. in vivoの. びGAAの. 実 験 成 績 に お い て,鉄. 生成 塩 投 与後 の.
(8) 794. 福 Table. The ap<0. values .05,. 2. Guanidinobutyric. represent bp<0.01. Table 3. The ap<0. values .05vs. the vs. represent. acid. means±S.. 島 level. 正. E. M.. with. in the. 登. rat. brain. experimental. after. ferric. numbers. in. chloride. injection. parentheses.. control.. Arginine levelin the rat brain afterferricchlorideinjection. the. means±S.. E. M.. with. experimental. numbers. in. parentheses.. control.. ラ ット脳 内 グ アニ ジノ化 合 物 の 変 動 の うち, GAA. 示 し た も の で あ る. MGの. とMGに. の 濃 度 に 依 存 して 徐 々 に増 加 した.し. にin. 特 に 著 明 な 変 動 が 認 め ら れ た の で,次 vitroに. お い て,脳. ホ モ ジ ェ ネ ー トへ 鉄 塩. と過 酸 化 水 素 添 加 に よるGAAとMGの. 生成 に. つ い て 検 討 を 行 っ た. Fig.. 8は,ラ. 塩 化 第 二 鉄 溶 液5μlと. の 濃 度 の 過 酸 化 水 素 を加 え, 37℃ ンキ ュベ ー トした と きのMGとGAAの. し た が,さ. 酸 化水 素. か し, GAA. 酸 化 水 素 に よ り最 高 値 を 示. らに 濃 度 を加 えて3.5%過. 酸化水素 に. よ っ て は 抑 制 さ れ た.. ッ ト脳 ホ モ ジ ェ ネ ー ト0.5mlに. 一 定 濃 度(0 .1M)の. の 生 成 は, 0.35%過. 生 成 は,過. で5分. 種 々 間イ. 生 成量 を. Fig.. 9,. 10は,ラ. ット脳 ホ モ ジ ェネ ー トに0.1M. 塩 化 第 二 鉄 溶 液(5μl)と35%過 を加 え, 37℃ GAAの. 酸 化 水 素(50μl). で イ ン キ ュベ ー ト した 時 のMGと. 生 成 量 を示 して い る.組. 織 中 のMGは,.
(9) 鉄 塩 誘 導 て ん か ん 原 性 焦 点 組 織 に お け る グ ア ニ ジ ノ 化 合 物 の 変 動 に 関 す る研 究 Table. The ap<0. The ap<0. values .05vs. values .05,. 4. Homoarginine. level. after. chloride. means±S. not. Table 5. Creatininelevelin the rat brain afterferricchlorideinjection. the. に 増 加 し,イ. numbers. in. injection. the. vs. experimental. ferric. N. D.:. represent. with. brain. control.. bp<0.01. E. M.. rat. represent. parentheses.. detected.. means±S.. E. M.. with. experimental. numbers. in. parentheses.. control.. 鉄 塩 と 過 酸 化 水 素 の添 加 に よ り3分 に約2倍. in the. 以 内 に急 激. ン キ ュ ベ ー シ ョ ン60分 後. に は さ ら に 高 値 を示 した.こ. の 高 値 は,さ. らに. た(Fig. 10).な お,鉄 塩 と過 酸 化 水 素 を 加 え た 直 後 のMGは,ク. ロマ トグ ラ ム に お け る グ ア ニ ジ ンの. ピ ー ク と重 な った た め に 定 量 分 析 不 可 能 で あった.. イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン90分 後 に お い て も認 め ら れ. 第3節. た(Fig.. 添 加後 の ラジ カ ルの発 生. 9).他. 795. 方, GAAは,鉄. 塩 と過 酸 化 水 素. を加 え た 直 後 よ り有 意 に 増 加 し,イ. ンキ ュベ ー. シ ョ ン30分 後 に 最 高 値 を 示 し た.こ. の 増 加 は,. イ ンキ ュ ベ ー シ ョン90分 後 に お い て も認 め ら れ. 脳 ホ モ ジ ェ ネ ー トへ 鉄 塩 と 過 酸 化 水 素. Fig. 11は,ラ. ッ ト脳 ホ モ ジ ェ ネ ー トに 鉄 塩 と. 過 酸 化 水 素 を 加 え,イ の ラ ジ カ ル のESRに. ン キ ュ ベ ー シ ョ ン5分 後 よ る分 析 例 を 示 し て い る..
(10) 796. 福. Fig.. Methylguanidine. 9. 6. formation hydrogen. ピ ンア ダ ク トと. グ ナ ル(AN=AHβ=14.7G)を. AHβ=23.9G)を. 検 出 す る.. The. of values. rat are. brain. with. means±S.. ferric E. M.. キ ュ ベ ー シ ョ ン5分. of. 4. 後 ま で 急 激 に 増 加 し た.そ. ジ カル は 一 過 性 に減 少 し た の ち イ ン. キ ュ ベ ー シ ョ ン60分 後 ま で 増 加 した が,イ. ンキ. ュ ベ ー シ ョ ン90分 後 に は 減 少 して い た(Fig. 12). 過 酸 化 中 間 体 ラ ジ カ ル は,鉄. ンキ ュベ ー シ ョン後. ジ カ ル の 発 生 量 を示 して い る. OHラ. カ ル は,鉄. グナ. ッ ト脳 ホ モ ジ ェ ネ ー ト に 鉄 塩. と 過 酸 化 水 素 を 加 え,イ. homogenate. の 後OHラ. ジ カ ル)は. ピ ン ア ダ ク ト と し てhexadシ. Fig. 12は,ラ. in peroxide.. determinations.. 酸 化 中 間 体 ラ ジ カ ル(Xラ. ル(AN=11.9G,. のOHラ. and. ジ カル は, DMPO‑OHス. して, quartetシ. DMPO‑Xス. 登. Effect of hydrogen peroxide on formation of methylguanidineand guanidinoaceticacid in homogenate of rat brain with ferricchloride.. to. 検 出 し,過. 正. Fig. 8. chloride. OHラ. 島. っ て も 増 加 し た が,そ と,さ. 塩 の み の添 加 に よ. れ に過 酸 化 水 素 を加 え る. ら に 急 激 に 増 加 し た.こ. の ラ ジ カル の発. ジ. 生 量 は イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン60分 後 まで は ほ ぼ 一. 塩 と過 酸化 水 素 の添 加 直後 か らイ ン. 定 で あ った が, 90分 後 に は ほ ぼ 組 織 レ ベ ル に ま.
(11) 鉄塩 誘導 て ん かん原 性 焦 点組 織 に おけ るグ アニ ジノ化 合物 の変 動 に関す る研究. Fig.. 10. Guanidinoacetic ferric of. Fig. 11. で 減 少 し た(Fig. 第4節. 4. acid. chloride to. 6. and. formation. hydrogen. determinations.. Electron. homogenate The. ap<0.001vs. spin resonance. spectrum. of values. tissue,. of DMPO‑X. are bp<0.05. and. rat. brain. with. means±S. vs. E. M. 0min.. DMPO‑OH.. 0.025)が 認 め られた.し か し,過 酸化 中 間体 ラジ. 13).. ラ ジ カ ル 発 生 量 とMG,. GAA生. 成量. カル量 とMG生. 成 量 又 は, OHラ. ジ カル量 と過. 酸 化 中 間体 ラ ジ カル量 あ るい はGAA生. との 関 係 Table. in peroxide.. 6に 示 す よ うに,ラ. ッ ト脳 ホ モ ジ ェ ネ. ー トに 鉄 塩 と過 酸 化 水 素 を加 え シ ョン 中 に 発 生 す るOHラ. 797. ,イ. ンキ ュベ ー. ジ カル 量 は,. 成 量 との 間 に 有 意 な正 の 相 関 関 係(r=0.492,. MG生 p<. 成量 と. の 間 には,有 意 な相 関 関係 は認 め られ なかった. 第5節. CRN添. 加後 のMGの. 生成. 脳 ホ モ ジ ェ ネー トへ 鉄塩 と過 酸 化 水 素添 加 に よるMGの. 著 しい生 成 は,何 に由 来 す るか を調.
(12) 798. 福. Fig.. 12. Generation. of. chloride. and. hydroxyl. Fig.. 13. rat. brain. means±S. vs min,. of. peroxide. with. ferric. E. M.. of 3 to. tissue, fp<0.005. cp<0.05. vs. 0min,. and. 4 determinations. tissue+Fe3+,. 登. homogenate. The. intermediate chloride. vs vs. in. peroxide.. ap<0.005. Generation. 正. radical. hydrogen. d eterminations.. 島. of. values. are. bp<0.05. (X). vs. (s) in. peroxide. ap<0.05. dp<0.05. brain. with E. M.. ferric of. vs vs. homogenate The. tissue,. 0min,. of. values. are. bp<0.005. ep<0,05. vs. べ るた め に , Arg,. GAA及. 3. れ0.1〜10mg/ml添. 加 し, 37℃. びCRNを. ベ ー シ ョン後 のMGとGAAの 果, MGは,. CRNを. 添 加 す る と,濃. は む しろ 逆 に 減 少 した.他 又 はCRNの. で5分. それぞ イ ンキ ュ. 分 析 を行 なつた 結. に 著 明 に増 加 し た が, Arg又. not significant.. 4. 5min.. Table 6 Relationship between generationof radi calsand formationof methylguanidine (MG). (‑):. 3 to. 5min.. radical. hydrogen. rat. means±S.. 方,. はGAAの GAAは,. 度 依存 性 添加 で Arg. 添 加 に よ っ て も生 合 成 に は 影 響 が. 認 め ら れ な か つ た(Fig.. 14)..
(13) 鉄塩 誘導 て ん かん原 性 焦 点組 織 に おけ るグ アニ ジノ化 合物 の変 動 に関す る研 究. Fig.. 14. Formation. of. guanidine. (MG). chloride (Arg), The. 考. and. guanidinoacetic in. hydrogen. guanidinoacetic values. are. acid. homogenate. means±S.. peroxide acid. (GAA). of. rat. after (GAA). E. M.. 4 to. methyl. with. addition and. of. and. brain. of. ferric arginine. creatinine. (CRN).. 5 determinations.. て ん か ん 原 性 焦 点 の 固 定 し て い る 時 期 で あ る投. 察. 与2ヶ. 本報 告 にお いて は,鉄 塩 誘導 て ん かん原 性 焦. 月後 には著 明 に増加 して い る こ とが観察. さ れ た.特. に こ れ ら の 変 動 が 大 き くみ ら れ た の. 点形 成 に脳 内 グ アニ ジ ノ化 合物 が どの よ うに関. は,大 脳 皮 質,海. 与 して い るか につ い て検 索 す るた め,鉄 塩 投 与. に 高 知12)は,塩. 後 の脳 内 グ アニ ジ ノ化 合 物 の変 動 を時 間経 過 に. の 運 動 領 野 に 注 入 す る と,約15分. 従 って観 察 した.そ の 結 果,脳7部. spikeが. GAAは,鉄. 799. 位 のMGと. 塩 投 与15〜30分 後 に一 過性 に増 加. 馬,線. 条 体,小. 脳 で あ った.先. 化 第 二 鉄 溶 液 をラ ッ ト大 脳 皮 質. 初 発 し,つ. い で1分. で 持 続 して 出 現 す る が,注. 後 に焦 点 側 に. 間 に約10回 入30〜40分. した の ち,投 与60分 後 に は減 少 し,投 与24〜48. polyspike. 時 間 後 には ほぼ 対 照 値 に一 旦 回 復 した ものの,. 合 で 比 較 的 規 則 正 し く出 現 し,以. dischargesが1分. の割 合 後 に は,. 間 に約20回 後spikeあ. の割 る.
(14) 800. 福. 島. 正. 登. Fig.15 Possible metabolic pathway of methylguanidine in the rat brain with ferric chlorideinduced seizures.. い はpolyspike. dischargesは. 比較 的 一 定 の周. 期 で 出 現 す るよ うに な り,注 入1〜5ヶ. 月 後 に は,. んマ ウス)は,け. い れ ん 準 備 性 を獲 得 す る と, MG. が 大 脳 皮 質,小. 脳,中. 脳,橋. 延 髄 で 高 く な り,. 発 作 放 電 の 振 幅 や 頻 度 も増 加 す る こ と を 報 告 し. GAAが,橋. 延 髄 で 高 くな る こ と な ど が 知 ら れ. て い る.こ. て い る37).こ. の よ うに,. の よ うに 鉄 塩 投 与15分. か ら30分 の て. GAA並. び にMGは,. ん か ん 様 発 作 波 が 早 期 に 出 現 す る時 期 並 び に 鉄. 発 作 波 が 出現 す る時期 並 び にて ん か ん原 性焦 点. 塩 投 与2ヶ. 形 成 期 に著 明 に 増 加 す る こ と は,こ. 月後 の て んか ん原 性 焦点 が固 定 して. い る時 期 に, MGとGAAが. 脳 内 に著 明 に増 加. びGAAは,ネ. ニ ジ ノ化合 物 が てん かん原 性 焦 点形 成 に何 らか の 形 で 関 与 し て い る こ と を示 唆 し て い る.. し て い る こ と は 非 常 に 興 味 深 い. す で にMG及. コ,ウ サ ギ の 大 槽 内. 他 方,鉄. 塩 投 与60分. 後 にMG及. 投 与 に より発 作 放 電 を誘 発 す るこ とが 知 ら れ て い. 脳 全 域 で 減 少 し,又 投 与24時. る26,27).ま た,鉄 塩 誘 導 て ん か ん 原 性 焦 点 以 外 の. MGは. 大 脳 皮 質,中. 脳,小. て ん か んモ デ ル にお い て も,け い れ ん と グ アニ ジ ノ. で な お も 減 少 してい た が. 化 合 物 の 関係 が す で に報 告 され てい る.す. GAAの. ウ サ ギ のpenylenetetrazolけ. こ と41),あ. る い はElマ. な わ ち,. いれん開始 時 に. は ウ サ ギ 髄 液 中 のGAAとCRNが ウ ス(自. れ らの グ ア. 増加す る 然 発症 て ん か. びGAAが 間後 にお い て も. 脳 で, GAAは この 時 期 に はMG及. 代 謝 が 活 発 に 行 わ れ る一 方 で,そ. の 生 合 成 が 間 に合 わ ず,一. 海馬 び れ ら. 過性 の低 値 を 示 す こ. と が 想 定 さ れ た. 腎 臓 に お い て は, Fig. 15に 示 す よ うに,グ. ア.
(15) 鉄塩 誘 導 てん かん原 性 焦 点組 織 に おけ るグ アニ ジノ化 合物 の変 動 に関 す る研 究 ニ ジ ノ 化 合 物 の 代 謝 経 路 が 明 確 に さ れ て い る.. 増 加 は, Fenton反. ま た 脳 に お い て も,. がMGの. dinotransferaseが. L‑argining‑glycine. glycineと cineか CRNが. ami. 検 出 され て お り42), Argと. のamidine基. らGAAが. 生 成 され,次. る ば か りで な く,酵. い でcreatine,. こ の 時 期 に はL‑arginine‑glycine. 応 に基 づ くGAAの. 生成量. 生 成 量 に 比 べ て ず っ と 少 い こ と か ら,. 鉄 塩 投 与 に よ り発 生 す る ラ ジ カ ル 反 応 に 由 来 す. の 転 移 反 応 によ りgly. 生 成 され る と 考 え られ て い る.従. 801. 素 を介 し た 反 応 に よ る こ と. が 想 定 さ れ た.. っ て,. amidino. MGは. 肝 臓 に お いて は, CRNか. る こ と が 知 ら れ て い る48).そ. ら生合 成 され. こで 本 実 験 に お い. transferase活. 性 が 低 下 して い る こ と が 推 定 さ. て は ラ ジ カ ル 反 応 によ り生 成 す るMGが,. れ る.今 回,鉄. 塩 投 与 後 に脳 内 のMGとGAA. GAA及. びCRNの. い ず れ か ら 生 成 され る か を検. が 全 く同 じ変 動 を示 す こ と が 認 め ら れ た が,こ. 討 し た 結 果, MGはCRNか. れ はMGがGAAを. が 明 ら か に な っ た. MGの. 介 して 生 成 さ れ て い る可 能. 性 を 示 唆 し て い る. 従 来,鉄. Arg,. ら生 成 さ れ る こ と 神 経 化 学 的作 用 に関. して は 現 在 十 分 な 解 明 が な さ れ て い な い が,多. 塩 の 水 溶 液 や 鉄 を 含 む ヘ ム化 合 物 を. くの グ ア ニ ジ ノ 化 合 物 の う ち, MGの. みが ウサ. 多 不飽和 脂 肪 酸 や細 胞 内 オ ルガ ネ ラ浮遊 液 に加. ギ脳 組 織 ミク ロ ゾ ー ム 分 画 のNa+,. え る と,ス. 活 性 を抑 制 す る こ と が 報 告 さ れ て い る49).従. ー パ ー オ キ サ イ ド ラ ジ カ ル(O‑2),一. 重 項 酸 素(1O2),過. て,鉄. 塩 投 与 に より過 剰 に脳 内 で 生 成 さ れたMG. どの 活 性 酸 素 が 生 成 さ れ. は,神. 経 細 胞 膜 で の イ オ ン輸 送 機 構 に 障 害 を も. る こ と が 知 ら れ て い る9,10,43〜45).そ の 他,ヘ グ ロ ビ ン(Fe2+)か. モ. ら メ トヘ モ グ ロ ビ ンへ の 自 己. 酸 化 過 程 や ヘ マ チ ン化 合 物 に よ っ て も 酸 素 の ブ リー ラ ジ カル が発 生 す る こ とが 明 らか に され て い る45〜47).そ. こ で 次 に,ラ. ー トにFenton試. 薬7). っ. ドロ キ. 酸 化 水 素(H2O2),ヒ. シ ラ ジ カ ル(・OH)な. K+‑ATPase. ッ ト脳 ホ モ ジ ェ ネ. た ら し,お. そ ら く は 抑 制 性 ニ ュ ー ロ ン系 の 障 害. を 介 し て,中. 枢 神 経 系 の 過 活 動 の 現 象 を ひ き起. こ す 可 能 性 が 想 定 さ れ る. MGとGAAの. 他 に,鉄. に お い て は, NAA, CRNの. 塩 投 与 後 の ラ ッ ト脳. GBA,. Arg,. HArg及. び. 変 動 が 部 位 によ り異 っ て 認 め ら れ た.け. ,す. な わ ち,鉄 塩 と過 酸 化. 水 素 を 添 加 後 のMGとGAAの. 生 成 を調 べ た.. い れ ん に 伴 う脳 内 の 内 在 性 グ ア ニ ジ ノ化 合 物 の. ジ カ ル は 脳 ホ モ ジ ェ ネ ー ト中. 変 動 につ い ては他 の実験 て ん か んモ デ ル動 物 に. そ の 結 果, OHラ. に は 検 出 さ れ な い が,鉄 す る と,急. 激 にOHラ. 塩 と過 酸 化 水 素 を添 加 ジ カ ル が 発 生 し,イ. ンキ. つ い て も報 告 が な さ れ て い る.す. ュ ベ ー シ ョ ン5分 後 に は 最 高 値 を示 す こ と,過. glutaric. 酸 化 中 間 体 ラ ジ カ ル は,こ. のpentylenetetrazolけ. れ らの添 加 直後 に は. 対 照 脳 ホ モ ジ ェ ネ ー ト中 の3倍. と な り,イ. ンキ. な わ ち,コ. acidが. 著 明 に 増 加 す る こ と38),マ. れ ん 前 期,中. と が わ か っ た.こ. た 電 気 刺 激 け い れ ん に お い て は, GESが. 在 未 同 定 で あ り,・OOH,・OOR又. は ・R(R;ア. ル キ ル基)と 考 え られ て い る. MG及. びGAAも. sive. 及 びGが. running. phaseに. お い て は, NAA,. れ らの反 応 系 で は対 照 脳 ホ モ ジェネー ト. さ ら にElマ. 値 の約2倍. に増 加 した が, GAAの. 獲 得 した マ ウス で は, CRNが. 増 加 は 約20%に びGAAは,イ. で, Argが. ジ カル の発 生 に. ウス に つ いて は,け. 馬,小. 脳,中. 脳,橋. 馬,小. 脳,中. 脳,橋. 方,. い れ ん 中 に はNAAが. in vivoで. 増 加 はOHラ. の 鉄 塩 投 与 に よるGAAの. ジカ. 著明 な. CRN. いれ ん準 備性 を 大 脳 皮 質 と橋 延 髄. 小 脳 で 増 加 し, NAAが. して い る こ と,け. ル の 発 生 量 に依 存 して い る こ と が 示 さ れ た.他. 伴 っ て 増 加 し て お り, MGの. けい れん. 増 加 して い る こ と50)が 見 出 され て い る.. MGは,こ. か し, MG及. けいれ. 前 に 増 加 す るこ と39),聴 原 発 作 ラットのpreconvul. こ れ らの ラ ジ カ ル 発 生 に伴 っ て 増 加 し,イ ン キ ュ. ン キ ュ ベ ー シ ョ ンの 期 間 中,ラ. けい. 期 及 び 後 期 に 増 加 す る こ と39),ま. ん 中 及 び け い れ ん 後 に増 加 し, CRNが. ベ ー シ ョン5分 後 に 最 大 と な る こ と が 示 さ れ た.. 過 ぎ な か っ た.し. ウス. い れ ん に お いて は, GES. が け い れ ん 前 期 及 び後 期 に 増 加 し, CRNが. ュ ベ ー シ ョ ン5分 後 に は や は り 最 高 値 を 示 す こ の過 酸 化 中 間体 ラ ジ カ ルは現. バ. ル トて ん か ん 原 性 焦 点 組 織 に は, α‑guanidino. 中脳 で増加. い れ ん 直 前 期 に はArgが. 海. 延 髄 で 増 加 し, CRNは. 海. 延 髄 で 減 少 して い る こ と,け 小 脳 と 海 馬 で 増 加 し,.
(16) 802. 福. CRNが. 海 馬,小 脳,橋 延 髄 で 減 少. NAAが. 橋 延 髄 で 減 少 して い る こ と,ま. れ ん 後 に はCRNが. 大 脳 皮 質,海. 正. 中 脳 で 増 加,. 馬,橋. 加 す る と急 激 にOHラ. ず れ も,グ. ジ カ ル の 発 生 が 増 加 し,そ. の ち, 90分 後 に は 消 失 し た. 4.ラ. 上の. ッ ト脳 ホ モ ジ ェ ネ ー トへ 鉄 塩 と 過 酸 化 水. い る こ と を示 す も の で あ る.し. 生 とMGの. か しどの よ うな. グ ア ニ ジ ノ 化 合 物 が け い れ ん の どの 時 期 に どの. 観 点 か ら も,鉄. 塩 と過 酸 化 水 素 に よるOHラ. 6.ラ. 験てんかん の よ うな. の相 関 関 係 が 認. ッ ト脳 ホ モ ジ ェ ネ ー トへ 鉄 塩 と過 酸 化 水. 素 を 添 加 して 生 成 す るMGは,前 のCRN濃. 塩 投 与 後 の脳 内MGとGAAの. 駆 物 質 と して. 度 に 依 存 し, Arg及. びGAAの. 添加. に よ つ て は 影 響 を受 け な か つ た. 7.以. 結. 論. ラ ッ ト脳7部. 塩 投 与 に よ り生 じ たOHラ. 起 因 して, CRNか. 位 に お い て 投 与15. 〜30分 後 に一 過 性 に増 加 し ,つ. 上 よ り,鉄 塩 誘 導 て ん か ん 原 性 焦 点 に お. い て は,鉄. 塩 投 与 後 の脳 内 グ ア ニ ジ ノ 化 合 物 の うち,. GAAとMGが. 生 成 との 間 に は,正. ジ カル の発. め ら れ た.. 変 動 は 特 徴 的 と い え よ う.. 1.鉄. 増 加 し,. 60分 後 に は 最 大 値 に達 し た.. アニジ. 5.鉄. モ デ ル に よ っ て 異 な る よ うで あ る.こ. の 後 一 定 値 を保 っ た. 素 を添 加 す ると 直 ち にMGとGAAが. ノ 化 合 物 が け い れ ん 発 現 機 構 に密 接 に 関 与 し て. 部 位 で どの よ う に 変 化 す る か は,実. ジ カ ル と過 酸 化 中 間 体 ラ. 延髄 で. 回得 られた鉄塩 て ん か ん原性 焦 点. 組 織 で の 変 化 と異 な る が,い. 登. た けい. 減 少 して い る こ と が 観 察 さ れ て い る37).以 諸 知 見 は,今. 島. ュ ー ロ ン に 作 用 し て,て. い で 投 与60分 後. ジ カル に. ら 生 成 す る過 剰 のMGが. ニ. ん か ん 原 性 焦 点 を形 成. す る可 能 性 が 示 唆 さ れ た.. に は 正 常 レベ ル 又 は そ れ 以 下 に減 少 し た が,投 与24〜48時. 間 後 に は ほ ぼ 正 常 レベ ル に回 復 した. 謝. しか し,て ん か ん焦 点の 固定 され た 時期 で あ る 投 与2ヶ. 月 後 に はGAA及. ル の2〜3倍. びMG値. は 正 常 レベ. 稿 を終 るに臨 み,終 始御 懇 篤 な御 指 導 と御 校 閲 を. に増加 して い るこ とが 明 らか に な. 承 りま した,森. っ た. 2.そ. の他 の グアニ ジノ化 合 物,す Arg,. HArg,. な わ ち, NAA,. CRNは,鉄. びMGほ. ま た,実 験 に御協 力下 さい ま した,枝 松. 本研 究 の 要 旨は,第59回 て 発 表 した.. Willmore. LJ,. of ferrous. LJ. Rosen Exp. and. Neurol. in iron-induced. 66, Karler. epileptic. rat. GW:. rat and. epilepsy. NV:. Epilepti-form. activity. cortex.. Brain. of malonaldehyde. isocortex. Munson. 献. cerebral. Formation. into. traumatic. and. on. JJ:. GW. Frumin. (1979) SA. Sypert,. chloride. Sypert. of post. and. Rubin. of FeCl2. LJ,. AD. Turkanis. RW. ferric and. injection. Willmore a model. 5.. Hurd,. and. Willmore pial. 4.. 日本 生 化 学 会 大 会 に お い. ホ モ ジ ェ ネ ー トへ 鉄 塩 と過 酸 化 水 素 を添. 文. 3.. 礼嬢 及. び,教 室 の 皆 様 に厚 くお礼 申 し上 げ ます.. ど顕 著 で は な. か っ た.. 2.. 緑 博 士 に深 く感 謝 の 意 を. 捧 げ ま す.. 塩 投 与 後,. そ れ ぞ れ 時 間 経 過 及 び 部 位 に よ り異 つ た 変 動 が 認 め られ た が, GAA及. 1.. 昭 胤 教授 並 び に,直 接 御 指 導 御協. 力 い た だ き ま した,平 松. GBA,. 3.脳. 辞. Brain JB: Ann. Res. Neurol. Focal. epileptogenesis. Central. properties. Res. and (1982). Recurrent. 4,. (1978). focal. 246,. seizures (1978). initiated. by 152,. brain. pial. iontophoresis. 406-410.. edema. induced. by. sub. 113-119. induced. by. cortical. iron. injection:. 329-336.. following. intracortical. hemoglobin. injection.. 277-284. R: rats.. Neuropharmacology. of •¢9-tetrahydrocannabinol (1982). 21,. 7 -13.. and. its. metabolites.
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