飼料添加物の効果安全性について
アルカリ性プロテアーゼ
平成３０年１月２９日
農林水産省 消費・安全局 畜水産安全管理課
資料１１－２
1 目 次 １ 名称等……… 2 ２ 起源又は発見の経緯、外国での飼料添加物としての許可状況及び使用状況等 2 ３ 効果に関する事項……… 3 ３－１ 効果を裏付ける基礎的試験（in vivo 試験）……… 3 ３－１－１ 鶏……… 3 ３－２ 効果を裏付ける野外応用による試験……… 3 ３－２－１ 鶏……… 3 ３－２－２ 鶏……… 4 ３－２－３ 鶏……… 4 ３－２－４ 鶏……… 5 ３－２－５ 鶏……… 6 ３－２－６ 鶏……… 7 ３－２－７ 鶏……… 8 ４ 安全性に関する事項……… 9 ４－１ 毒性試験……… 9 ４－１－１ 一般毒性試験……… 9 ４－１－１－１ 反復投与毒性試験（短期、ラット）……… 9 ４－１－２ 特殊毒性試験……… 10 ４－１－２－１ 変異原性試験……… 10 ４－２ 対象家畜等を用いた飼養試験……… 10 ４－２－１ 鶏……… 10 ５ 審議結果……… 11 ６ 参照（参考文献及び参考資料）……… 12
2 アルカリ性プロテアーゼに関する効果安全性について １ 名称等 一般名：アルカリ性プロテアーゼ 化学名：Chymotrypsin CAS 番号：37259-58-8 用途：飼料が含有している栄養成分の有効な利用の促進 対象家畜及び推奨添加量：鶏用飼料 24,000 単位/kg 飼料 ※単位…タンパク消化力単位を示す ２ 起源又は発見の経緯、外国での飼料添加物としての許可状況及び使用状況等 プロテアーゼは、ペプチド結合を加水分解する酵素の総称である。飼料に添加するこ とで、消化管でタンパク質・アミノ酸の消化率を向上させ、生体内での利用を促進する。
国内においては、1990 年に Aspergillus melleus、Bacillus licheniformis 又は Streptomyces caespitosus 由来のアルカリ性プロテアーゼが飼料添加物として指定さ れ、1998 年にBacillus subtilis 由来のアルカリ性プロテアーゼが追加された。
今回追加が要望されたアルカリ性プロテアーゼは、Bacillus licheniformis Si3 株を宿 主とし、遺伝子組換え技術により、Nocardiopsis prasina 由来のアルカリ性プロテアー ゼ遺伝子を合成して得たDNA を挿入させて、アルカリ性プロテアーゼ産生能を向上さ せた組換え生産菌 Bacillus licheniformis JPBL001 株から産生される単一アルカリ性 プロテアーゼ製剤である。 本物質は、海外では、米国、EU 等で飼料添加物として、鶏用飼料等への使用が認め られている。
3 ３ 効果に関する事項 ３－１ 効果を裏付ける基礎的試験（in vivo 試験） ３－１－１ 鶏（採卵鶏） 採卵鶏（ジュリア、400 日齢）を用いて、基礎飼料（対照群）又は基礎飼料にプロテ アーゼを 24,000 単位/kg（960～1,280 単位/kg 体重/日）添加した飼料をそれぞれ 10 日間給与した（1 群 6 羽）。 乾物、粗タンパク質、粗脂肪、粗繊維、可溶無窒素物及び総エネルギーの消化率、可 消化エネルギー、可消化養分総量を算出するため、期間後半5 日間に糞便を採取した。 なお、基礎飼料に含まれる粗タンパク質は21.2％であった。 乾物、粗タンパク質、粗繊維及び総エネルギーの消化率、可消化エネルギー、可消化 養分総量については、プロテアーゼ添加群は対照群よりも有意に高かった（p<0.05）（表 1 参照）。[参照 1] 表1 鶏用飼料に添加したときのプロテアーゼの給与効果 対照群 プロテアーゼ添加群（24,000 単位/kg） 消化率（%） 乾物 75.8±2.2 78.9*±1.6 粗タンパク質 84.1±2.6 86.8*±1.2 粗脂肪 68.1±5.7 74.0±6.1 粗繊維 1.6±2.0 12.7*±4.3 可溶無窒素物 81.7±2.3 83.0±2.2 総エネルギー 77.1±2.2 80.1*±1.4 可消化エネルギー（Mcal/kg） 3.06±0.09 3.18*±0.06 可消化養分総量（%） 71.6±1.7 73.6*±1.21 各値は平均値±SD *：対照群との間に有意差あり（one-way ANOVA, p<0.05） ３－２ 効果を裏付ける野外応用による試験 ３－２－１ 鶏（ブロイラー） ブロイラー（Ross PM3、雄、1 日齢）を用いて、基礎飼料（対照群）又は基礎飼料 にプロテアーゼを24,000 単位/kg（2,080～5,280 単位/kg 体重/日）添加した飼料をそれ ぞれ35 日間給与した（1 群 20 羽、12 反復）。 なお、飼料に含まれる粗タンパク質は1～21 日齢では 21.1％、22～35 日齢では 20.0％ であった。 飼料要求率については、プロテアーゼ添加群は対照群よりも有意に低かった（p<0.05） （表2 参照）。[参照 2]
4 表2 鶏用飼料に添加したときのプロテアーゼの給与効果 対照群 プロテアーゼ添加群（24,000 単位/kg） 増体量（g） 2,473 a±51 2,504 a±56 飼料摂取量（g） 3,967 a±68 3,954 a±82 飼料要求率 1.605 a±0.029 1.579 b±0.022 各値は平均値±SD
各項目内の異文字間に有意差あり（one-way ANOVA、Newman-Keuls test, p<0.05） ３－２－２ 鶏（ブロイラー） ブロイラー（Ross308、雄、1 日齢）を用い、基礎飼料（対照群）又は基礎飼料にプ ロテアーゼを24,000 単位/kg（2,080～5,280 単位/kg 体重/日）添加した飼料をそれぞれ 36 日間給与した（1 群 64 羽、12 反復）。 なお、基礎飼料に含まれる粗タンパク質は1～20 日齢では 21.0％、21～36 日齢では 19.0％であった。 1 日増体量及び 1 日飼料摂取量については、プロテアーゼ添加群は対照群よりも有意 に高かった（p<0.05）（表 3 参照）。[参照 3] 表3 鶏用飼料に添加したときのプロテアーゼの給与効果 対照群 プロテアーゼ添加群（24,000 単位/kg） 1 日増体量（g/日） 51.4b 52.8a 1 日飼料摂取量（g/日） 81.9b 83.5a 飼料要求率 1.593 1.582 各値は平均値 各項目内の異文字間に有意差あり（two-way ANOVA, p<0.05） ３－２－３ 鶏（ブロイラー） ブロイラー（Ross PM3、雄、1 日齢）を用い、基礎飼料（対照群）又は基礎飼料に プロテアーゼを 19,200、24,000 単位/kg（1,600～4,000、2,080～5,280 単位/kg 体重/ 日）添加した飼料をそれぞれ35 日間給与した（1 群 20 羽、8 反復）。 窒素、脂肪の各消化率及び可消化エネルギーを算出するため、期間後半 14 日間の回 腸内容物を採取した。 なお、基礎飼料に含まれる粗タンパク質は1～21 日齢では 21.1％、22～35 日齢では 19.0％であった。 増体量及び飼料摂取量については、プロテアーゼ添加群は対照群よりも有意に高かっ た（p<0.05）。 窒素消化率、可消化エネルギーについては、プロテアーゼ24,000 単位添加飼料群は、 対照群よりも有意に高かった（p<0.05）（表 4 参照）。[参照 4]
5 表4 鶏用飼料に添加したときのプロテアーゼの給与効果 対照群 プロテアーゼ添加群（単位/kg） 19,200 24,000 増体量（g） 2,286 b±95 2,412 a±63 2,430 a±45 飼料摂取量（g） 3,688 b±136 3,841 a±87 3,848 a±109 飼料要求率 1.605 a±0.019 1.593 a±0.021 1.584 a±0.037 窒素消化率*（％） 81.03 c±0.79 82.13 bc±1.33 84.09 a±0.63 脂肪消化率*（％） 92.62 a±1.52 93.04 a±1.96 93.41 a±0.83 可消化エネルギー*（％） 76.53 b±0.89 76.91 ab±1.70 78.66 a±0.89 各値は平均値±SD
各項目内の異文字間に有意差あり（one-way ANOVA、Newman-Keuls test, p<0.05） *：1 群あたり 64 羽 ３－２－４ 鶏（ブロイラー） ブロイラー（Arbor Acres、雌雄、1 日齢）を用い、基礎飼料、タンパク質低減飼料 のそれぞれについて、プロテアーゼ無添加飼料（対照群）、プロテアーゼを24,000 単位 /kg（2,080～5,280 単位/kg 体重/日）添加した飼料をそれぞれ 42 日間給与した。（試験 ①（1 群 24 羽、4 反復）、試験②（1 群 16 羽、4 反復））。なお、タンパク質低減飼料に 含まれる粗タンパク質は 1～21 日齢では 21.64％、22～35 日齢では 19.24％、36～42 日齢では 17.24％、基礎飼料に含まれる粗タンパク質は、1～21 日齢では 22.62％、22 ～35 日齢では 20.17％、36～42 日齢では 18.16％であった。 試験①では、飼料要求率については、タンパク質低減飼料において、プロテアーゼ添 加群は対照群よりも有意に低かった（p<0.05）。基礎飼料のプロテアーゼ添加群と対照 群では有意差はなかったが、改善傾向がみられた（表5-1 参照）。 試験②では、飼料要求率については、タンパク質低減飼料においてプロテアーゼ添加 群は対照群よりも有意に低かった（p<0.05）。基礎飼料のプロテアーゼ添加群と対照群 では、有意差はなかったが、改善傾向がみられた（表5-2 参照）。[参照 5] 表5-1 鶏用飼料に添加したときのプロテアーゼの給与効果（試験①） タンパク質低減飼料 基礎飼料 対照群 24,000 単位/kg 対照群 24,000 単位/kg 増体量（g） 2,110 2,163 2,193 2,227 飼料摂取量（g） 3,714 3,658 3,726 3,719 飼料要求率 1.762a 1.691b 1.699ab 1.670b 各値は平均値
6 表5-2 鶏用飼料に添加したときのプロテアーゼの給与効果（試験②） タンパク質低減飼料 基礎飼料 対照群 24,000 単位/kg 対照群 24,000 単位/kg 増体量（g） 2,660b 2,753ab 2,768ab 2,827a 飼料摂取量（g） 4,458 4,450 4,493 4,430 飼料要求率 1.676a 1.618b 1.624ab 1.568b 各値は平均値
各項目内の異文字間に有意差あり（ANOVA、Duncan’s multiple range test, p<0.05） ３－２－５ 鶏（ブロイラー） 【試験①】 ブロイラー（RossPM3、雄雌、１日齢）を用い、基礎飼料（対照群）、基礎飼料にプ ロテアーゼを24,000 単位/kg（2,080～5,280 単位/kg 体重/日）添加した飼料をそれぞれ 35 日間給与した（1 群雄雌ともに 12 羽、12 反復）。 タンパク質、脂肪、エネルギーの消化率を算出するため、35 日目の回腸の内容物を 採取した。 なお、基礎飼料に含まれる粗タンパク質は1～21 日齢では 21.0％、22～35 日齢では 20.0％であった。 雄では、プロテアーゼ添加群は対照群よりも、増体量及び飼料摂取量については、有 意に増加し、飼料要求率は有意に減少した（p<0.05）。また、タンパク質、脂肪、エネ ルギーの消化率はプロテアーゼ添加群は対照群よりも有意に増加した（p<0.05）。 雌では全項目で有意差はなかった（表6-1 参照）。 【試験②】 ブロイラー（RossPM3、雄、１日齢）を用い、基礎飼料、タンパク質低減飼料のそ れぞれについて、プロテアーゼ無添加飼料（対照群）、プロテアーゼを 24,000 単位/kg （2,080～5,280 単位/kg 体重/日）添加した飼料をそれぞれ 35 日間給与した。（1 群 12 羽、12 反復）。 タンパク質、脂肪、エネルギーの消化率を算出するため、35 日目の回腸の内容物を 採取した。 なお、基礎飼料に含まれる粗タンパク質は1～21 日齢では 20.0％、22～35 日齢では 19.5％、タンパク質低減飼料に含まれる粗タンパク質は 1～21 日齢では 19.3％、22～ 35 日齢では 17.1％であった。 タンパク低減飼料では、飼料摂取量、飼料要求率については、プロテアーゼ添加群は 対照群よりも有意に減少した（p<0.05）。エネルギーの消化率については有意に増加し た（p<0.05）。 基礎飼料のプロテアーゼ添加群と対照群では、増体量、飼料要求率について有意差は なかったが、改善傾向がみられた（表6-2 参照）。[参照 6]
7 表6-1 鶏用飼料に添加したときのプロテアーゼの給与効果（試験①） 雄 雌 対照群 24,000 単位/kg 添加群 対照群 24,000 単位/kg 添加群 増体量（g） 2,262b 2,393a 2,162 2,149 飼料摂取量（g） 3,723b 3,835a 3,547 3,535 飼料要求率 1.65a 1.60b 1.64 1.64 消化率* (％) タンパク質 76.9b 82.8a － － 脂肪 88.6b 91.1a － － エネルギー 70.6b 77.8a － － 各値は平均値
各項目内の異文字間に有意差あり（two-way ANOVA、Newman-Keuls test, p<0.05） *：1 群あたり 8 羽 表6-2 鶏用飼料に添加したときのプロテアーゼの給与効果（試験②） タンパク質低減飼料 基礎飼料 対照群 24,000 単位/kg 対照群 24,000 単位/kg 増体量（g） 2,220 2,243 2,353 2,364 飼料摂取量（g） 3,911a 3.838b 3,873 3,830 飼料要求率 1.76a 1.71b 1.65 1.62 消化率 * (％) タンパク質 81.8 82.9 － － 脂肪 95 95.3 － － エネルギー 75.5b 76.6a － － 各値は平均値
各項目内の異文字間に有意差あり（two-way ANOVA、Newman-Keuls test, p<0.05） *：1 群あたり 8 羽 ３－２－６ 鶏（ブロイラー） ブロイラー（Ross708、雄雌、7 日齢）を用い、タンパク質低減飼料について、プロ テアーゼ無添加飼料（陰性対照群）、プロテアーゼを12,000、24,000、48,000、96,000 単位/kg（1,040～2,640、2,080～5,280、4,160～10,560、8,320～21,120 単位/kg 体重/ 日）添加した飼料、基礎飼料（陽性対照群）をそれぞれ15 日間給与した（1 群 5 羽、7 反復）。粗タンパク質及び各種アミノ酸の消化率を算出するため、15 日目に回腸の内容 物を採取した。 なお、タンパク質低減飼料に含まれる粗タンパク質は20.25％、基礎飼料に含まれる 粗タンパク質は22.5％であった。 増体量については、24,000、48,000、96,000 単位/kg 添加群は、対照群よりも有意に 増加した（p<0.05）。 飼料要求率については、48,000、96,000 単位/kg 添加群は、対照群よりも有意に低下 した（p<0.05）（表 7 参照）。[参照 7]
8 表7 鶏用飼料に添加したときのプロテアーゼの給与効果 タンパク質低減飼料（単位/kg） 基礎飼料 （陽性対照群） 陰性対照群 12,000 24,000 48,000 96,000 増体量（g） 661.3b 681.8ab 703.4a 708.1a 708.0a 711.1a 飼料摂取量（g） 1,045 1,050 1,075 1,061 1,062 1,050 飼料要求率 1.580a 1.540ab 1.527abc 1.498bc 1.500bc 1.477c 消 化 率 粗タンパク質 77.9b 82.6a 82.6a 82.7a 83.0a 75.6b アルギニン 86.9b 90.1a 90.4a 91.2a 90.9a 86.3b イソロイシン 79.5ab 82.6a 82.3a 82.9a 83.1a 78.1b リジン 80.6b 85.9a 85.1a 86.4a 86.6a 78.4b メチオニン 78.4b 82.7ab 83.0ab 83.9a 83.2a 76.1b トレオニン 75.9b 82.2a 83.3a 83.9a 83.7a 74.2b バリン 83.6b 86.4ab 88.4a 86.3ab 87.1a 82.2b ヒスチジン 82.1ab 84.2a 85.7a 85.8a 86.1a 80.2b アスパラギン酸 76.1b 82.3a 81.6a 82.5a 82.8a 74.5b システイン 77.7b 81.8a 81.9a 82.1a 82.7a 76.8b セリン 73.6b 78.2a 79.1a 78.7a 78.8a 72.1b 各値は平均値
各項目内の異文字間に有意差あり（one-way ANOVA、Tukey’s HSD test, p<0.05） ３－２－７ 鶏（ブロイラー） ブロイラー（Cobb 400Y、雌雄、1 日齢）を用い、基礎飼料（陽性対照群）、タンパ ク質低減飼料（陰性対照群）、タンパク質低減飼料にプロテアーゼを 24,000 単位/kg （2,080～5,280 単位/kg 体重/日）添加した飼料をそれぞれ 42 日間給与した（1 群 25 羽、6 反復）。 なお、タンパク質低減飼料は、同じ飼料原料を用い、予め酵素によるタンパク質及び エネルギーの消化率改善を考慮して、見かけの飼料中の栄養成分値が基礎飼料と同等と なるように、とうもろこしと大豆かすの配合率を調整した。基礎飼料に含まれる粗タン パク質は1～14 日齢では 22.2％、15～28 日齢では 20.2％、29～42 日齢では 19.5％で あった。 増体量、飼料摂取量、飼料要求率は、全群間で有意差は見られなかったが、タンパク 質低減飼料では、プロテアーゼ添加群は対照群よりも飼料要求率は減少する傾向がみら れた。[参照 8]
9 表8 鶏用飼料に添加したときのプロテアーゼの給与効果 タンパク質低減飼料 基礎飼料 （陽性対照群） 陰性対照群 24,000 単位/kg 増体量（g） 1,956.8 1,972.2 2,023.5 飼料摂取量（g） 3,478.6 3,444.9 3,515.7 飼料要求率 1.778 1.747 1.739 各値は平均値 各項目内の異文字間に有意差なし（one-way ANOVA, p>0.05） ４ 安全性に関する事項 ４－１ 毒性試験 ４－１－１ 一般毒性試験 ４－１－１－１ 反復投与毒性試験（短期、ラット） ラット（SD 系、5 週齢、平均体重：20g）にプロテアーゼを 0、45,955、144,000、 459,950 単位/kg 体重（0、50、165.1、500.1mg/kg 体重）添加した飼料を、90 日間強 制経口投与した（1 群雌雄各 10 匹、各用量 1 群）。 体重、増体量、飼料摂取量、水分摂取量、血液学的検査、血液生化学的検査、眼科鏡 検査及び臓器重量については、投与に起因した影響は認められなかった。 剖検において、肉眼的観察からは投与に起因した影響は認められなかった。病理組織 学検査で観察された所見は、試験実施の研究所の有する同週齢及び同系統のラットにお ける背景データの発生範囲内であった。 以上の結果から、アルカリ性プロテアーゼのNOAEL は 500.1 mg/kg 体重/日（459,950 単位/kg 体重/日）と考えられた。[参照 9]
10 ４－１－２ 特殊毒性試験 ４－１－２－１ 変異原性試験 表 9 変異原性試験結果 試験 対象 用量 結果 参照 復 帰 突 然 変 異 試 験*1 Salmonella typhimurium TA98、TA100、TA1535、 TA1537 Escherichia coli WP2uvrA 156、313、625、1,250、2,500、 5,000 µg/plate（±S9） 陰性 参照10 染 色 体 異 常 試 験 *2 ヒト末梢血リンパ球培養 細胞*3 1,582、2,813、5,000 µg/ml（±S9） 3h 処理後 17h 培養 陰性 参照11 2,048、3,200、5,000 µg/ml（＋S9） 3h 処理後 17h 培養 陰性 参照11 1,311、2,048、4,000µg/ml（－S9） 20h 培養 陰性 参照11 *1 被験物質は脱イオン水に懸濁しろ過滅菌 *2 被験物質は注射用滅菌水に懸濁 *3 健常者（非喫煙・男性）3 名の採血を等量混ぜたものから得たリンパ球 変異原性試験では、in vitro 系において、細菌を用いる復帰突然変異試験とヒトか ら採取した末梢血のリンパ球を培養した細胞を用いた染色体異常試験が実施された。 結果は代謝活性化の有無にかかわらず陰性であった。したがって、アルカリ性プロテ アーゼには生体に影響する変異原性は認められないと判断された（表9 参照）。[参照 10、11] ４－２ 対象家畜等を用いた飼養試験 ４－２－１ 鶏 ブロイラー（Ross308、雌雄、1 日齢、平均体重 43g）を用いて、基礎飼料（対照群） 又は基礎飼料にプロテアーゼを 24,000、120,000、240,000 単位/kg（2,080～5,280、 10,080～26,240、20,320～52,640 単位/kg 体重/日）添加した飼料をそれぞれ 35 日間給 与した（1 群 33 羽、6 反復（雌：3 反復、雄：3 反復））。 1 日増体量は、対照群と比較して、240,000 単位/kg 添加群で有意に高く、飼料要求 率は、120,000 及び 240,000 単位/kg 添加群で有意に低かった（p<0.05）。 血液学的検査、血液生化学的検査及び死亡率については、全群において有意差は認め られなかった。 総消化管重量については、プロテアーゼ 120,000、240,000 単位/kg 添加群で有意に 減少した。これは酵素摂取により、栄養素の消化改善、消化管への吸収促進の結果、消 化管の発達が抑制されたのではないかと考察された（表10 参照）。[参照 12]
11 表10 鶏用飼料に添加したときのプロテアーゼの安全性 対照群 プロテアーゼ添加群（単位/kg） 24,000 120,000 240,000 1 日増体量（g/日） 49.4b 48.4b 50.4ab 51.7a 1 日飼料摂取量（g/日） 79.9 78.3 80.1 81.0 飼料要求率 1.618a 1.620a 1.588b 1.568c 総消化管重量*（g） 182.8a 175.8ab 167.2b 161.2b 肝臓重量*（g） 58.49 57.16 52.68 55.11 総消化管比重*（％） 9.27 9.02 8.87 8.42 肝比重*（％） 2.96 2.91 2.80 2.86 剖 検 所 見 * 皮下組織の点状出血 0/12 1/12 0/12 1/12 肝臓萎縮 0/12 1/12 1/12 1/12 肝臓腫大 2/12 1/12 1/12 0/12 上大静脈肥厚 0/12 1/12 0/12 0/12 胸腺腫大 0/12 2/12 1/12 1/12 脾臓萎縮 1/12 1/12 0/12 0/12 ファブリキウス嚢腫大 1/12 2/12 1/12 2/12 各値は平均値 各項目内の異文字間に有意差あり（ANOVA、LSD test, p<0.05） *：1 群あたり 12 羽 ５ 審議結果 アルカリ性プロテアーゼ（企業推奨添加量：鶏用飼料に24,000 単位/kg）の効果安全 性について審議した。 「飼料が含有している栄養成分の有効な利用の促進」を本剤の効果とし、飼料へ添加 することは適当であると判断された。 ①本剤の効果：飼料が含有している栄養成分の有効な利用の促進 ②対象家畜：鶏
12 ６ 参照（参考文献及び参考資料）
1. 酵素剤のニワトリにおける消化率向上を確認する試験 (日本科学飼料協会) (2010) 2. The efficacy of Ronozyme ProAct(CT) on growth performance of broiler chickens
fed a based on maize and soybean meal (DSM) (2007)
3. Efficacy of RONOZYME 6246 in broiler chickens (DSM) (2007)
4. The efficacy of graded levels of the liquid formulation of Ronozyme ProAct(L) on performance and, nutrient and energy digestibility of broiler chickens (DSM) (2008)
5. Efficacy of Ronozyme Proact(CT) in Broilers Diets on Live Performance and Carcass Quality (DSM) (2012)
6. A Feed Serine Protease Improves Broiler Performance and Increases Protein and Energy Digestibility (JPSA) (2011)
7. Effects of a monocomponent protease on performance and protein utilization in 7– to 22-day-old-brolier chickens (Poultry Science) (2011)
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9. 10R Protease, PPA 26797: A 13-WEEK ORAL(GAVAGE) TOXICITY STUDY IN RATS (Scantox) (2007)
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