骨髄体外組織培養に於ける生体染色の研究第1編
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(2) 2630. 田. 村. 私 は 教室 に於 け る骨 髄 組織 培 養 研 究 の一 環 と し て,. 甫. 「グ レー フ ェ」 の 「カ タ ラク トメ ス」 を使 用 した.. 家 兎 及 び人 の骨髄 培 養 に於 け る生 体 染 色 を研 究 し聊. 而 し て之 に使 用 す る 「デ ッキ グ ラス 」は 縦 ×横 ×厚. か 知 見 を得 た ので 以 下名編 に 於 て報 告 す る.. =22×27×0. さて 色素 を動 物 体 内 に注 入 す る に当 り其 の 量過 度 に過 ぐれ ば 其 の 動 物 体に 有 毒 に作 用 し,少 きに 失 す れ ば何 等 反 応 を 見 な い もの で あ るが,組 織 培 養 法 に 色 素 を応 用 す る に 当つ て も之 と同 様 の事 を考 慮 す. .15粍 の もの を用 い,「 オブ ェ ク トグラ. ス」 は 凹窩 載物 硝 子 を 使 用 した.之 に依 れ ば顕微鏡 の拡 大 は1500倍 にす る事 が 出来 る. さて以 上 の被 覆培 養 に次 の各 色 素 を添加 す る.即 ち 塩 基性 色 素 と しては 中 性 紅,「 メチ レン」青,「 ゲ. る必 要 が あ る.即 ち先 づ 色 素 が培 養 基 並 び に培 養 組. ンチ ア ナ」 紫,「 トル イ ジ ン」 青,酸 性 色 素 として. 織 細 胞 に対 し て如 何 な る影 響 を及 に ます か を究 明 しな. は 「リチ オ ン カル ミン」,「 ト リパ ン」 青,「 トリジ. け れ ば な らぬ.こ の点 既 にRussel55)(1914)は. 「グ. は 中 性 紅, Roffo57)u. ジ ン,加 門28)(1928)は 部15)(1929)は. Villanueva(1925)は 中性 紅外6種. エ オ. の 色 素,服. 中 性 紅等100余 種 の色 素 に 就 き報 告. して い る が,そ れ らは何 れ も心,肺,肝,腎. ン」 青 を用 い,服 部15)にな らい各 色 素 は培 地に対 し て0.01%及. ンチ アナ 」 紫, Pollitzer53)及 びRoffo56)(1924). 等に 就. いて で あ つ て,骨 髄 に関 す る色 素 の影 響 に 就 き報 告. び0.001%の. 濃度 とな る如 く何 れ も蒸溜. 水 に て溶 解 稀 釈 し,対 照 に も蒸 溜 水 を用 い た.色 素 液 は作 製 後 長時 日を 経過 す れ ば 毒 力 が一般 に高 まる 故,使 用 に 際 して は な るべ く度 々 調製 す る方 が理 想 的 で あ る.且 つ使 用 に 際 し て濾 過 し蒸 気 消 毒を施す 必 要 が あ る. 次 に培 養 基 に色 素 液 を 添加 す る方 法に,培 養直 後. し てい る ものは 内 外 に 見 当 ら ない. 茲 に 於 て私 は 先 づ塩 基 性 及 び酸 性 色 素 中 よ り数種. に添 加 す る方 法 と一定 時 間 培 養 して 後添加 す る方法. を選 択 し,家 兎 大 腿骨 の骨髄 体 外培 養 を 行 い,細 胞. と二 つ あ る.若 し培 養直 後 に添 加 す る とす るならば. 増 生 と偽好 酸 球 遊 走 速度 に 及 ぼ す これ 等 色 素 の影 響. 先 づ 「デ ッキ グ ラス 」 の 中央 に 血漿2滴 を滴 下 し,. に就 い て観 察 し,更 に骨 髄 組織 培 養 を応 用 した 本研. 之 を細 い 硝 子棒 で 直 径約1.5cmの. 究 に 適 応す る色 素 の 濃渡 を知 らん と した.本 編 に 於. 中 え組 織 片 を入 れ,次 に 発 育促 進 物 質で あ る鶏胎圧. ては 此 の成 績 に就 い て 述べ る.. 搾 液 を2滴 々下 し て よ く混和 し,更 に色 素液 を1滴. 円形 に拡 げ其の. 々下 す る.か くす れ ば血 漿 対 発 育促 進 物質 対色素液 第2章. 実 験 材料 並 びに 実 験 方 法. 実 験 材料:す べ て体 重1.5kg内 実 験 前 約7〜10日. の比 が2:2:1と. 外 の成 熟 家 兎 を. 以上 一 定 の 環境 の下 に 一定 の食餌. を一定 時間 に与 え て飼 育 し,実 験 に 際 しては 耳 静 脈. な り,色 素 液 は予 め所 要 の濃度の. 5倍 の濃 度 に 調製 して おけ ば よい事 にな る. 又 この 際滴 下 に 使 用す る器 具 とし て,私 は 「ツベ ル ク リン」注 射 器(1cc)に1/3静. 脈 針 を装 置 して用. よ りの空 気 栓 塞 に依 り致 死 せ しめ,直 ち に大 腿 骨 々. い,滴 下 に 際 して は 垂直 に把 持 し可 及的 添加量を等. 髄 を 無 菌的 に取 出 し実 験 に 供 した.又 人 に於 ては胸. 量 とす る様 に努 め た.服 部15)は圧 搾 液 と色 素液を加. 骨 穿刺 に依 り得 た骨 髄 を用 い た.. え速 か に混 ず る述 べ てい るが,培 養直 後 に色 素液を Fischer9). 添 加 す る場 合は よいが,一 定 時 間 培養 後 に色 素液を. の 原法 を教 室 で 改良 した 被 覆培 養 法 に よつ た,即 ち. 実 験 方 法:組 織 体 外 培養 法 はCarrel5),. 添 加 す る場 合 は 混ず る事 が 出来 ない 故条 件が 異る事. 培 地 の支 持 体 と しては 同 種 健 康動 物 の 「ヘパ リン」. を 慮 つ て,私 は そ の何 れ の 場 舎 に も混ず る事 をせず. 加 血 漿 を用 い,発 育 促 進 物 質 とし ては孵 化7〜9日. 滴 下 した ま ゝに し て 色 素 液 の 浸透 して行 くま ゝに. の鶏 胎 圧 搾 液 を 用 いた.即 ち この 鶏 胎圧 搾 液 は孵 化. 放 置 した が,多 数 例 に於 て至 適濃 度 に 於 ては平等に. 7〜9日. 浸 透 して色 素 の沈 澱或 は 染 色 の不 平 等 々 の如 き不都. の 鶏 胎児 をFischerの. 圧 搾 器 に て圧 出 し,. 3000回 転20分 間遠 心 沈 澱 した もの ゝ上 清 を 使 用 した.. 合 は 殆 ん ど生 じな か つた.. 而 して この際 圧 搾 液 作 製後4日 を経 れ ば 其 の 発育 促. 次 に此 の方 法 で培 養 した 培養 組 織 の観 察は杉 山考. 進 物 質 とし て の効 力 は半 減 す る との清 水32)の意 見 に. 案教 室 改 良 の 保温 箱 中 に て行 い,そ の増生 面積測定. 基 き,可 及的 作 製 後1〜2日. はAbbe氏. 迄 に使 用 した.. 描 画 器 に依 り行 い,投 影 された面 積 より. 以上 の操 作 は す べ て 無菌 的 且 つ敏 速 に行 い,組 織. 対照 と の比 較成 長 価 及 び成 長 係 数 を求 め,又 遊走速. 片 に対 し ては 器 械 的,化 学 的 刺戟 を 与 え ざ る様 に注. 度 の測 定 は 原 組織 縁 と細胞 増生 帯 の 辺縁 との略 々中. 意 を払 い,培 養組 織 片 は保 温 「リ ンゲ ル」氏 液 中に. 央 に存 す る偽 好 酸球,好 中球 に 就 い て行 い,之 と対照. て 操作 し,器 械 的損 傷 及び 挫 滅 を防 ぐ為 常 に鋭 利 な. の 遊走 速 度 との 比 を仮 りに 速 度係 数 と名 付けて表現.
(3) 骨髄 体外組 織培養に於け る生体染色の研究 した.又 染 色度 も同 位 置 の同 細 胞 の 染色 程度 を家 兎 骨 髄 の場 合 は(‑)(+)(〓)(〓),人 は(‑)(±)(+)(〓)(〓)に. 骨 髄 に於 て. 第1表. 2631. 家兎骨髄細胞 の増生 に及ぼす 中性紅の影響. 分 か ち,次 の例 の. 如 くして そ の平 均 染色 度 を求 め た.即 ち 例 えば100 ケ の偽 好酸 球 を 算 え各(‑)が20ケ,(+)が18ケ, (〓)が35ケ,(〓)が27ケ. を 得 た とす る と次 の式 が. 成立 し,其 の平 均 染色 度 が 求 め られ る.. 而 し て人骨 髄 即 ち 好 中球 算 定 の 場 合 は(±)を 0.5と して 計算 した. 尚 か くして得 た 平均 染色 度 は 全 体 を平 均 して1個 の細 胞の 有す る染 色 価 を示 した もので あ る. (附)染. 色度. (‑):全 (±).. く染 色 顆 粒 を 認 め ない もの. 1〜3ケ. (‑):少. 位 の 染 色顆 粒 を認 め る もの.. 数 の染 色 顆 粒 を 認 め る もの.. (〓):中 等 数以 上 の染 色顆 粒,或 は少 数 の融 合, 第1図. 膨 化 した顆 粒を 認 め る もの.. 実 験1. (〓):多 数 の 染 色顆 粒,或 は 中 等数 以 上 の融 合, 膨 化 した顆 粒 を認 め る もの. 但 し家 兎の 場 合 は(±)の ず,(‑)よ. 程 度 の も のは 認 め られ. り直 ち に.(+)程. 度 に染 色 さ れ るが,. 人 の場合 は 染 色性 が低 い た め(±)を. 設 けた ので あ. る. 第3章. 実 験 成 績(1). 本 章 に於 ては 家 兎六 腿 骨 の骨 髄 体 外 培 養 を行 い, これ に前 記 せ る 数 種 の塩 基 性 及 び酸 性 色 素溶 液 を添 加 し,こ れ 等 色 素 が細 胞 増 生 と偽好 酸 球 遊 走 速 度 に 第2図. 及ぼ す 影響 を 検 討 した 結 果 を 述 べ る. 第1節 1)中. 実 験2. 塩 基性 色 素. 性 紅(第1表,第1,. 中性 紅 の0.001%を. 2図). 含 む培 養 基に 於 ては細 胞増 生. の度 は培 養3時 閥 後は 対 照 よ り稍 ゝ劣 るが12〜24時 間 後に至 れば む しろ対 照 を凌 ぐ.又 遊 走速 度 も対 照 を凌 ぐ例 も認 め られ,培 養 後 相 当 長時 間対 照 と殆 ん ど同等 の 発育 を 為 す.然 し乍 らそ の染 色性 は 甚 だ低 く,培 養 後3〜6時. 間 では 殆 ん ど染 色顆 粒 が 認 め ら. れ ず, 12時 間 前 後 に至 つ て極 く軽度 に染 色 され た顆 粒 を認 め るに過 ぎな い.即 ち0.001%の. 濃度に於て. は 培養 後24時 間 頃迄 は培 養 骨髄 細胞 の増 生 に 対 し之 を推 進 す る も,顆 粒染 色 の点 に於 ては 甚 だ力 が弱 い ことが 判 る.次 に0.01%を. 含 む培 養 基 に 於 て は細 胞. 増 生 の度 は培 養 後早 期 に於 ては 対 照 よ り相 当劣 り,. (表 中 の実験 番 号 は 図 中の 各 成績 と対 照 とか ら算 出 した成 長係 数 に附 け た もの で あ り,従 つ て図 の実 験 番 号 とは 一致 しな い).
(4) 2632. 田. 村. 甫. 12〜24時 間 で は大 分 取 り戻 す が末 だ 対 照 よ り僅 か に. 第3図 実 験1. 劣 つ て お り,又 遊 走 速 度 も対 照 よ り稍 々劣 る.し か しそ の 染色 性 に於 ては 甚 だ良 好 で,色 素 液 添 加 後 短 時 間 で 鮮 明 に 染着 され た顆 粒 を あ らゆ る細 胞 に 認 め る.即 ち0.01%の. 濃 度 に 於 て は培 養骨 髄 細 胞 の 増生. に対 し ては 極 く軽 度 に 抑 制 的 な影 響 を 及ぼ す も,顆 粒 染 色 の点 に 於 ては 著 し く優 れ てお り,染 着 状 態 は 非常 に鮮 明 で 染色 に依 る観 察 に.甚だ 利 点 を有 す る. 2)「. メチ レ ン」 青(第2表,第3,. 「メ チ レン」青 の0.001%を. 4, 5図). 含む 培 養 基 に於 け る. 細 胞 増 生 の度 は 培養 初期 よ り24時間 迄 は 対 照 を凌 ぐ が,遊 走速 度 は 必 ず しも一 致 せ ず対 照 よ り稍 々劣 る. 顆 粒 染 色 の程 度 は 軽 度 に し て僅 か に染 着 され る のみ. 第4図 実 験3. 第2表. 家 兎 骨髄 細 胞 の 増生 に及 ぼ す 「メ チ レ ン」青 の 影 響. 第5図 実 験4. で あ る.次 に0.01%に. 於 け る細 胞増 生 は3〜6時 間. 後 迄 は 対 照 を稍 々凌 駕 す るか 劣 る とも軽度であるが, 12〜24時 間後 に 至れ ば 甚 だ し く低下 す る.遊 走速度 は 培 養 初 期 よ り著 し く劣 つ て い る.顆 粒染色の度は 中性 紅 と同様0.01%に. 於 て は0.001%よ. り稍 々旺盛. に して,生 体 染 色 よ りもむ し ろ死戦 期 染色を患わせ る像 が 稍 ゝ多数 に認 め られ る.而 して24時間後には 両 者共 染 色 像 は 認 め られ ず,遊 走速 度 も著 しく低下 す る.即 ち0.001%の. 濃 度 の もの は培 養 骨髄細胞の.
(5) 骨 髄 体 外 組 織 培養 に於 け る生 体 染 色 の研 究 増 生 に稍 々促 進 的, 0.01%で 3)「. は 抑制 的 影響 を 認 め た.. ゲ ンチ ア ナ 」紫(第3表,第6,. 「ゲ ンチア ナ 」紫0.001%及. 2633. び0.01%に. 第7図. 7図). 実 験2. つ い て実 験. を行 うに両 濃 度共 細 胞 増生 は 著 し く不 良 に て,殊 に 0.01%の. 場合培 養 後3時 間 の増 生 像 が 殆 ん ど認 め ら. れ ず,僅 か の細 胞 が原 組 織 片 よ り押 出 され たか の 如 き状 態 で 認め られ る のみ で あ る.遊 走 速 度 も両 者共 低下 して い る.染 色 像 は殆 ん どが死 後 染色 の像 を呈 し細 胞 は 著明 な変 性 に陥 つ てい る.以 上 の 所 見 よ り 毒性 が相 当強 烈 で あ る事 を 充 分 に察 知 す る事 が 出来 る. 第3表. 家兎 骨 髄 細 胞 の増 生 に 及 ぼす 「ゲ ンチ アナ 」紫 の影 響. 4)「. トル イ シ ン」 青(第4表,第8,. 第4表. 家 兎 骨髄 細 胞 の増 生 に 及ぼ す 「トル イジ ン」 青 の 影響. 第6図. 実 験1. 9図).
(6) 2634. 田. 第8図. 村. 実験2. 甫. 第5表. 家 兎骨 髄 細 胞 の増 生 に 及ぼ す 「リチ オ ン カル ミン」 の 影響. 第9図. 実 験3. 「トル イ ジ ン」青0.001%を. 含 む培 養 基 に於 け る. 第10図. 実 験1. 第11図. 実 験3. 骨 髄 細 胞 の 増 生 を窺 うに,細 胞 増生 は対 照 よ り稍 々 劣 るか 或 は 稍 々優 る と云 う程度 で あ る.遊 走速 度 も 同様 の 成 績 を 示す,染 色像 も培 養3時 間 後 に は既 に 著 明 に 認 め られ るが, 12時 間後 に は 軽度,中 等 度, 高 度 に 染 つ た細 胞 各 少 数 を残 して 他 の大 部 分 の細 胞 は 脱 色 し,更 に時 間 を 経過 し て24時 間後 に 至 れば 軽 度 に 染 る細 胞極 く少 数 を残 す の み で他 は 尽 く脱 色 す る. 0.01%に 於 ては 細 胞増 生 は 対照 よ り相 当 劣 り, 中 に は培 養6時 間 以 後 は増 生 を 見 な い例 もあ る.遊 走 速 度 も之 に一 致 して 劣つ てい る.染 色像 は培 養 後 3時 間 で は約10%程. 度 認め られ るが,. 6時 間後 に 至. れ ば 大部 分 が 染 色 され, 12時 間 後 に至 れ ば大 部 分 脱 色 が 認 め られ るが,中 に著 し く高 度 に染 る少 数 の 細 胞 を 見 る. 24時 間 後 に 至れ ば 之 等は 紫 色 に な り死 後 染 色 の像 が多 く認 め られ る.出 現 す る細 胞 の配 列 状 態 を 見 る に,対 照 に比 して 疎 に し て且 つ細 胞が 萎縮 し た感 を呈 す.之 は毒 性 強 き色 素 の場 合特 に著 しい 様 で あ る. 第2節 1)「. 酸性色素. リチ オ ン カル ミソ」(第5表,第10, 12図). 11,.
(7) 骨 髄 体 外 組 織培 養 に 於 け る生 体 染 色 の研 究 第12図. 実 験4. 「リチ オ ン カル ミン」0.001%を. 添 加 せ る培 養 基 に. 2635. 第13図. 実 験1. 第14図. 実 験2. 於 け る骨 髄 細 胞 の増 生 状 態 を見 るに,殆 ん ど の例 に 於 て対照 に劣 り,且 つ 遊 走 速 度 も対 照 に比 して 低下 してい る.そ の染 色 像 は 時 間 が経 過 す るも一 向 に認 め られず,培 養24時 間 後 も全 く認め られ な い.次 に 0.01%添 加 に於 ては 前 者 に比 し て高 濃 度 に もか ゝわ らず発 育 状 態 は旺 盛 で 対 照 を凌 ぐ例 さえ あ る.遊 走 速 度 に於 て も之 に一 致 して比 較的 旺 盛 で之 も対 照 を 凌 ぐ もの もあ る.但 し染 色像 は 前 同 様 殆 ん ど認 め ら れ ない. 2)ト 第6表. リパ ン」 青(第6表,第13,. 14図). 家兎 骨 髄 細 胞 の 増 生 に 及ぼ す 「トリパ ン」 青 の 影響. 「トリパ ン」 青0.001%を. 含む 培 養 基 に於 て は骨. 髄 細 胞 増 生 は全 般 的 に対 照 に比 し良 好 で あ るが,遊 走 速 度 は対 照 に 比 し稍 々劣 る.又 染色 状 態 は低 調 に して染色 せ るや否 や 殆 ん ど不 明 な 程 で あ る.次. に. 0.01%に 於 ては 前者 に比 し細胞 増 生 は不 良 な る も, 約 半 数 例 に於 て対 照 を凌 ぐのを 認 め,又 遊 走 速 度 も 前 者 同様 稍 々劣 る.染 色 状 態 は培 養3時 間後 に して 既 に相 当高 度 に染 色 され た像 を 認め,. 6時 間 後 も同. 様 な像 を 認め る, 12時 間 後 に至 れ ば 漸次 脱 色 し然 ら ざ る もの は死 後 染 色 を呈 す. 24時 間 後 に至 れ ば遊 走 性 も衰 え遊 出 せ る細 胞 は 尽 く脱 色 す るに 至 る. 3)「. トリジ ン 」青(第7表,第15,. 「トリジ ン」 青0.001%を. 16, 17図). 含 む 培養 基 に於 ては 骨. 髄 細 胞 増生 は 対 照 に 劣 り,遊 走 速 度 も之 に伴 い対 照 よ り劣 つ てい る,染 色 像 は認 め られ な い.次 に0.01 %に 於 ては 細胞 増 生知 つ て前者 を凌 ぐ程 促 進 す る時 期 があ る.遊 走 速 度 も之 に 伴 い促 進 され る.染 色 像 は 之 もあ ま り著 明 で な く,只 培 養 後6時 間 頃 に於 て 僅 か に染 色 された 細 胞 を認 め るに過 ぎぬ ..
(8) 2636. 田. 第7表. 村. 甫. 家 兎 骨髄 細 胞 の増 生 に及 ぼ す. 第17図. 実 験3. 「トリジ ン 」青 の影 響. 第4章. 実 験 成 績(2). 私 は第3章 に 於 て骨 髄 体 外 組織 培 養 に於 け る細胞 増 生 と偽 好 酸 球 の遊 走 速 度 に 及 ぼす 各 色素 の影響 に 就 て検 討 した. 本 章 に 於 て は塩 基 性 色 素 並 び に酸 性色 素 の各代表 的 な もの,即 ち従 来 一般 に最 もよ く使用 され ている 中 性 紅及 び 「リチ オ ン カル ミン」 に つ き生 体染色 の 第15図. 実験1. 研 究 に於 て観 察 に最 も適 した濃 度 を 決 定 ぜ ん と し た. 第1節. 中性 紅(塩 基 性色 素). 服 部15)の 心,脾 組 織 培養 に 於 け る報 告 に 依れ ば 「デ ッキ グ ラス 」法 で は10000〜200000倍 が 最 も適 当 で あ る と述 べ てい る.私 は 之 に 基 き培 地 に対す る濃 度 を 各0.05%, 0.001%と. 0.02%,. 0.01%,. 0.005%,. 0.002%,. な る如 く6種 の濃 度 を 調製 し,家 兎骨髄. 偽 好 酸 球 に 対す る 中性 紅 の濃 度 と染色 時 間,染 色度, 比 較成 長 価 及 び遊 走 速度 との関 係 を明 らか にし,之 等 を 綜合 し て培 養骨 髄 細 胞 に悪 影響 な く,而 も生体 染 色 の観 察 が充 分 に 行 い得 る至適 濃度 を求 めん とし た. 第16図. 実験2. 0.05%:培. 養 初 期 よ り染 色 度 は高 度 で あ るが6時. 間 後既 に 次第 に変 性 に陥 る像 を認 め,脱 色 の徴 著 し く遊 走性 も認 め得 な い. 0.02%:初. 期 に は0.05%に. 次 ぐ染 色 性 を示すが. 12時 間 に至 れ ば 前者 同様 大 部分 脱 色 し中 には死滅せ る もの もあ り,遊 走 性 も殆 ん ど失 わ れ変 性 に陥つた 細 胞 も中等 度 に 認 め られ る. 24時 間に 至 れば殆 んど 脱 色死 滅 し変性 著明 と な る. 0.01%:前. 章 に も述 べた 如 く染色 液 添 加 後 短 時. 間 に して 細胞 内 に は 既 に 美麗 な染 色顆 粒 を認 め且 つ 遊 走状 態 も極 め て良 好 で あ る.培 養後12時 間 に至 る も尚変 性 の 徴 を見 ない. 24時 間 後 も尚一 部染色像 を.
(9) 骨髄体外組織培養に於ける生体染色の研究 め 旦 つ不 活 発乍 ら も遊走 性 を有 して い る. 0.005%:細. 胞 増 生 の度 は む しろ0.01%よ. 2637. 以上 の見 解 に 基 い て実 験 を行 つ た7種 の色 素 の家 り旺 盛. 兎 骨髄 体 外 組 織培 養 に 於 け る骨 髄 機能 に対 す る影響. で 培 養後 相 当長 時 間 に 至 る も増 生 を つ ゝけ るの を 認. を 通覧 す るに,「 ゲ ンチア ナ]紫 は0.001%及. め るが染 色 度 稍 々前 者 に劣 る.. %の 何れ の濃 度 で も抑 制 的 に,中 性 紅,「 メチ レ ン」. 0.002%:遊. 走性 は 培 養24時 間後 も尚相 当 活 発 に. 認 め られ るが 染 色性 に 於 て 著 し く劣 つ て い る. 0.001%:細. 青 「トリパ ン」.青では 低 濃 度(0.001%)で. び0.01. は 促進. 的 に,中 性 紅,「 メ チ レ ン」青,「 トル イジ ン」 青 で. 胞増 生 の 度 は著 明 で あ り,培 養 後 長. は 高 濃 度(0.01%)で. は 抑 制 的 に,「 リチ オ ン カル. 時 間 経過 す る も遊 走 性 尚 旺 盛 で あ るが 染 色性 は 染 色. ミン」,「トリジ ン」青 で は 両濃 度 共 不定 に作 用 す る. 顆 粒 の全 く認 め られ な い程 不良 で あ る.. 事 を認 め た.. 第2節. 「リチ オ ン カル ミン 」(酸 性 色 素). さ て肺 組織 培 養 に 於て加 門28)は中性 紅 の0.1%及. 服 部15)の 心,脾 組 織 培養 に於 け る 報 告 に 依 れば 「デ ッキグ ラス 」法 で は2000〜20000倍. が最 も適 当. び0.01%水 溶 液 は 細 胞 原形 質 内 の顆 粒を良 く紅 染す るが, 0.001%に. 於 ては 染 色 鮮 明 の度 が前2者 に 劣. で あ る と述 べ てい る.私 は 之 に 基 き培 地 に対 す る濃. ると述 べ,之 に 反 し組織 の 成 長 に及 ぼ す 影響 は 前2. 度 を0.1%,. 者 よ り抑 制 の度 が 低 い と述 べ て い る.服 部15)は心組. 0.05%,. 0.03%,. 0.01%,. 0.005%と. な. る如 く5種 の濃 度 を調 製 し,中 性 紅 の場 合 と同 様 に. 織培 養 に 於 ては0.1%及. して も至適 濃 度 を求 め ん とした.. 抑 制 され るが, 0.001%に. 0.1%:培. 養 後3時 間 に於 ては 遊 走 旺 盛に して染. び0.01%で. は 組織 の成 長 が. 於 ては成 長 は 著明 で あ る. が色 素 摂 取 は著 し くな い と述 べ て い る.又 脾 組織 培. 色 像 を認 め な い. 9時 間 後 も同 様, 12時 間に 至 る も. 養 に つ いて は, 0.1%で. 未 だ染 色 されず, 18時 間 後 も遊 走 性 稍 々緩 慢 な る外. 発 育 を遂 げ るが, 12時 間後 に は 細胞 の発 育停 止 し,. 変 化 を認 め な い.. 24時 間}こて変 性 著明 とな る と述 べ, 0.01%で は12時. 0.05%:前. 者 同様 何 れ の時 期 に於 て も染色 像 を認. め な い. 0.03%:初. 僅 か に淡 紅 色 に染 る顆 粒 の 出現 を認 め る.遊 走 性 も 旺 盛.こ の染色 像 は24時 間 後 も尚認 め られ る. 0.01%:細. 胞 増 生 の度 良 好,遊 走 性 旺 盛 な る も染. 色 像 は認 め られ な い. 0.005%:前. 間 後迄 は 良 好 な 発育 を示す が, 24時 間 後 では 前 者 同 様 で あ り, 0.001%で. 期 には 全 く染色 され ず,培 養9時 間後. は 培 養8時 間 後迄 は 良 好 な. は 発 育状 態 が24時 間 後で 尚対. 照 を凌 ぐと述 べ て い る. 私 の 家兎 骨髄 の実 験 に 於 ては0.01%で. 点に 於 ては 最 も鮮 明 に且 つ早 期 よ り染色 され るた め 観察 に 甚 だ好 都合 で あ る. 0.001%で. 者 と殆 ん ど変 らな い.. は増 生 に 対. し ては或 程 度 郷 制的 な影響 を及 ぼす が,顆 粒染 色 の. は 培 養24時 間. 後頃 迄 は増 生 に 対 し之 を促 進 す るが,顆 粒染 色 の点 で は甚 だ低 い.. 第5章. 総 括 並 び に考 按. 骨髄 組 織 培 養 に於 ては 培養 直 後 よ り各種 細 胞 の原. 「メチ レン 」青 では 服部15)は0.1%に. て は心,脾. 共 細 胞 発生 を見 ず, 0.01%に 於 て は 僅 々8時 間後 迄. 組 織外 え の遊 出 を 多数 に 認 め る故,之 等 遊 出細 胞 に. 増生 を み 以 後次 第 に衰 弱 す る と述 べ, 0.001%に. 対 して培 養 直 後 に 添加 され た色 素は,逐 時滲 透 して. て も両 者共 著 明 な増生 振 りを 認め られ ぬ と述 べ て い. 早 期 よ り比 較 的 著 明に 何 らか の反 応 を示 す もので あ. る.私 の場 合 に於 て も0.001%に. る.. 々促 進 的 で あ る以外 服 部15)と略 々一 致 す る結 果 を得. さて 茲 に於 て 色 素 の骨 髄 細 胞 に対 す る毒性 を比 較 す るに あ た り,巌 密 に言 えば培 地細 胞 増 生 帯 の増 生 面積 の み を以 て 論 ず る と誤 りを 招来 す る恐 れ が あ る.. 於. 於 て約 半 数 例 に 梢. た. 次 に 「ダ ンチ アナ 」紫 に 関 し服 部15)の成 績 をみ る に, 0.001%の. 場 合脾培 養 の 初期 に促 進作 用 を認 め. 即 ち増 生面 積 は 細 胞 の遊 走 速 度 に よつ て も或 程度 影. る が24時 間 後 には 変 性 に陥 ら しめ る と述べ て いる.. 響 され るので,増 生面 積 に細 胞 密度 が 加 味 され て後. 骨髄 に 於 け る私 の 場 合は0.001%に. 初 め て略 々正 確 な細 胞 増 生 の比 較が 可 能 とな る.し. 著明 に増 生 が劣 つ て い る.即 ち 「ゲ ンチ ア ナ」紫 は. か し普 通 の場 合 は特 に細 胞 密度 が高 度 或 は 逆 に疎 と. 家兎 骨髄 体外 組 織培 養 に於 て細 胞 増 生 に強 い毒性 を. な る場 合 は少 い の で,一 応 細 胞密 度 を考 慮 し乍 ら偽. 示 す色 素 と云 い得 る.. 好酸 球 遊走 速 度 と細 胞 増 生面 積 を比 較 検 討す る事 に よつ て概 ね所期 の 目的 を達 す る事 が 出 来 る.. 於 て も初期 よ り. 「トル イ ジ ン」 青 では 服 部15)は低 濃 度 で前 者(「ゲ ンチ ア ナ」 紫)よ. り梢 々良 好 な成績 を得 てい る.私.
(10) 2638. 田. の 場 合 も同 様 低濃 度(0.001%)で. 村. 対照を 凌 ぐ例 を. 認 め て は い るが,強 い て云 え ば 毒性 強 き部 類 に 属す る色 素 と考 え る.. 甫 期 の あ る事 が認 め られ て い る. さ て次 に 色 素 の至 適 濃 度 に関 して上 与那 原71)の組 織 球 の色 素 摂 取 に関 す る所 説 に依 れ ば,成 可 く短 い. 「リチ オン カ ル ミン」 に於 ては 加門28)は0.001%. 時 間 に 於 て 高度 に 色 素摂 取 をみ る最 も適 度 な色素 の. に 於て は 肺 組織 の増 生 に対 し て 対 照 と大 差 な く,. 量 を見 出 す 事 が必 要 で あ る と云 う.即 ち色素 の量少. 0.01%以. き に過 ぐ る時は 生 体 色 素 の摂 取 能 力 あ る も遂 に顆粒. 上 に 於 ては 明 らかに 唯 抑 制作 用 のみ を 呈 す. と述べ,服 部15)は 一 般 に促 進 作 用 著 明,特 に0.001. 染 色 を 現 わ さず して終 り,逆 に 多 きに 失 す る と細 胞. %に 於 ては48時 間 で尚 対 照 を凌 ぐ と述べ てい る.私. に障 害 的 に 働 くか らで あ る.. の成 績 に 於 て は0.001%の. 場合 よ りもむ しろ0.01%. 茲 に於 て私 の実 験 成 績(2)を総 括 すれ ば,中 性 紅に. の 場合 の 方 が増 生 に対 して も又 遊 走 機能 に対 して も. 於 ては 培 地 に対 す る濃 度 は0.01%が,「. よ り著 明 に対 照 を凌 ぐ例 を認 め てい る.こ の 事 は至. ル ミン」 で は0.03%が 至 適 濃 度 と云 う事 にな る.. 適 濃度 の問 題 と関連 して 甚 だ興 味 あ る事 実で あ る. 加門28)は 「トリパ ン」 青 の 稍 々少 量 即 ち0.001%. リチ オンカ. 即 ち 中 性 紅 の場 合 培 地 に対 す る濃 度(以 下同 じ) が0.05〜0.02%の. 如 く濃 厚 に過 ぎる と,顆 粒染色は. は 肺 組織 の増 生 を僅 か に 促 進 す るが,其 の量 を 増 す. 早 期 に 且 つ 高度 に 出現 す るが,細 胞 の機能 は速か に. 時 は(0.01%に. 障害 され て衰 え早 期 に 脱 色乃 至 死 後染 色 を呈 し,且. 於 て は極 め て僅 か に, 0.1%に. 於て. は 著 明 に)之 に 対 し て抑 制 的 影 響 を及 ぼ す と述 べ て. つ 細胞 増 生 も速 か に停 止 し,又 遊 走 も 停 止 し所 謂. い る,服 部15)は0.1%に. 超 生体 染 色 と何 ら異 る所 が 無 くな る.又 之に反 し濃. 於 ては 心,脾 共 に 濃度 濃 厚. に 過 ぎ て血漿 の膠 化 を 妨 げ て成 績 を とる事 を得 ず,. 度0.002〜0.001%の. 心 に於 ては0.01%で. は 細胞 増 生 が 対照 と同 程度 乃至. 遊 走 速度 等 の 機能 は高 度 に現 われ るが,染 色性 に於. 於 ては 対 照 よ り優 れ,脾 に於. て 甚 だ低 値 を示 し,染 色 性 に依 る観 察 であ る本来 の. 稍 々劣 り, 0.001%に て は0.01%で 0.001%で. は培 養24時 間 後迄 は 強 く促 進 せ られ,. はむ し ろ稍 々劣 る と 述 べ て い る.私 の実. 験 に於 ては0.001%に. 於 ては 全 例 に, 0.01%に. 於て. は 半数 例 に 対 照 を凌 ぐ増 生 を示 した. 「トリジ ン」青 に 於 て 服部15)は0.001%は 0.01%に. 使 命 に悖 る事 とな る. 以 上 の 他種 々の 濃度 に於 け る細 胞 機能,染 色性等 を 比 較 観察 す るに,可 及 的 細胞 機 能 旺 盛 な時 期に, そ れ 相応 の染 色 性 を示 し,稍 々長 時 間生 存せ るま ゝ. 勿論,. 於 て も対 照 を凌 ぐもの あ り と述 べ て い るが,. 私 の場 合 も0.01%に 於 て は対 照 を凌 ぐ増 生 を 示す 時. 第8表. 如 く稀 薄 に過 ぎ る と細胞増生,. で 観察 し得 る濃 度 は 第8表 の如 く0.01か0.005%と な る.尚 この両 濃 度 は殆 ん ど同 程 度の 細胞 機能を現 わ し得 るの で0.01%を. 以 て至 適 濃 度 としたわけ であ. 健康家兎骨髄体外組織培養に於ける偽好酸球 に対する中性紅濃度及び 染色時間 と染色度,比 較成長価,遊 走速度 との関係. る.而 して 服部15)は其 の濃 度 の至 適 範 囲は 被 覆 培養. 紅 の夫 の 如 く満 足 す べ き 美麗 な染色 顆 粒の出現を観. 法 で塩 基 性 色 素 に於 ては10000〜100000倍. と述 べ て. 察 し得 なか つ た が, 0.03%で 僅 か 乍 ら染 色顆 粒が現. お り,加 門28)も亦 同 様 の 所説 を述 べ何 れ も私 の 成績. わ れ るの で一 応 この濃 度 を本 色 素 の至適 濃度 と定め. と略 々一 致 して い る.. た.こ の 点肺 臓 組織 に つ い て研 究 した加 門28)も「カ. 次 に 酸 性色 素 であ る 「リチ オ ンカ ル ミン」 に つ い. ル ミン」 に依 り染 色 され る顆 粒 は甚 だ 少数 であると. て私 が 行 つた 実 験 成績 では,塩 基性 色 素 で あ る 中性. 述 べ てお り,又 心 臓 及 び 脾臓 組 織 培 養 につ いて研究.
(11) 骨髄 体外 組 織 培 養に 於 け る生 体 染 色 の研 究. 2639. した服 部15)は酸 性色 素に 於 ては 被 覆 培 養 法 で は2000. ナ」 紫 は両 濃 度 共 抑 制 的に,中 性 紅,「メ チ レン」 青,. 〜20000倍 が 至 適 範囲 と述 べ て い るが,骨 髄 組織 培. 「トリパ ン」 青 の 低 濃度(0.001%)は. 養 につ い て行 つ た私 の成績 と略 々一 致 す る わ けで あ. 性 紅,「 メチ レン」 春,「 トル イ ジ ン」 青 の 高 濃 度. る.. (0.01%)は. 促 進 的 に,中. 抑 制 的 に,「 リチ オ ン カル ミン」,「トリ. ジ ン」 青 は両 濃 度共 不定 に 作 用す る事 を 認 めた. 第6章. 結. 論. (2)次. に 中性 紅及 び 「リチ オ ン カル ミン」 の 至. Carre15)の組 織 培養 法 の教 室 改 良. 適 濃 度,即 ち培 養 組織 を障 害 せず 而 も観 察 に充 分 な. 法 に 依 つ て骨髄 体 外 組織 培 養 を行 い,生 体 染 色 に 於. 染色 度 の 得 られ る濃 度 を 決定 す るに あた り,そ の濃. け る色 素の 骨髄 組 織 に 対 す る影 響 並 び に そ の至 適 濃. 度 と染色 時 間,染 色 度,培 養 骨髄 組 織 の比 較成 長 価. 私 はFischer9),. 度 に つ いて研 究 した.蓋 し 斯 る研 究 は骨 髄 組 織 に関. 及 び偽 好 酸 球 遊 走速 度 との関 係 を求 め た結 果,中 性. す る限 りこれ ま で誰 も行つ お らな い.. 紅 では 培 地 に対 し0.01%,「 は0.03%を. 而 して塩 基性 色 素 とし ては 中 性 紅,「メ チ レ ン」青,. リチ オ ン カル ミン」 で. 以 て夫 々至 適 濃度 と決定 した.. 「ゲ ンチア ナ」 紫,「 トル イ ジ ン」青 を,酸 性 色素 と. 擱 筆す るに 当 り終 始 御 懇 篤 な る御 脂 導御 校 閲を 賜. しては 「リチ オ ンカ ル ミン」,「 トリパ ン 」青,「 ト. つ た 恩師 平木 教授 並 び に大 藤 助 教授 に深 甚 な る謝 意. リジ ン」 青 を用 いた.そ の結 果 得 られ た成 績 は 次 の. を 表 す.. 通 りで あ る. (1)上. (本 論 文 の要 旨は 昭和31年6月. 記 色 素を0.001%及. び0.01%の. 割 台に培. 養 基 に添 加す るに,骨 髄 細 胞 増 生 に対 し 「ゲ ンチ ア. Studies. on Part. 第470回 岡 山 医学 会. 通常 例去 に 於 て発 表 した.) (文. Vital. Stainings. in the. Bone-Marrow. 1.. Influences. of. Dyes. Functions. of. Normal. on. the. 献. Tissue. 後. 掲). Culture. Bone-Marrow. Rabbits. By Hajime Department. Tamura. of Internal Medicine Okayama University (Director: Prof. Kiyoshi Hiraki). Medical School. By performing a series of bone-marrow tissue culture with Fischer-Carrel's method modi fied somewhat in our laboratory , the author studied influences of dyes on the bone-marrow tissue in vital staining as well as the most appropriate concentration of staining solution. As far as the bone-marrow tissue culture is concerned, no one seems to have as yet carried out investigation on this problem. As for basic dyes, neutral red, methylene blue, gentian violet and toluidine blue were selected; and for acid dyes, litium carmine, tripan blue and tolysin blue were used. The results thus obtained are as follows: 1. When the dyes above mentioned are added to the medium in the concentration of either 0.001 per cent or 0.01 per cent, it has been found that gentian violet in either con centration acts as to inhibit the growth of bone marrow tissue; neutral red, methylene blue and tripan blue in the lower concentration (0.001%) act as to accelerate the growth; neutral red, methylene blue and toluidine blue in a higher concentraion (0.01%) act as to inhibit the growth; and lithium carmine and tolyrin blue act irregualrly in either concentration. 2. lithium. Next, in order to determine the most appropriate concentration carmine solutions so that such a concentration will not interfere. of neutral red and with tissue culture.
(12) 2640. 田. and. at the. the. relationship. in staining, and. the. same. time. it. will. between the. degree. wandering. decided. that. the. lithium. carmine. give. enough. the concentraions of staining,. velocity. of. most. appropriate. 0.03. per. cent.. the. 村. vital of dyes relative. 甫. staining growth. pseudoeosinophils concentration. for observations,. on one hand. on of. rate the. neutral. and of. other. red. the. bone. the lnegth. marrow. As is 0.01. the per. author. studied. of time. required. tissue result cent. in culture it and. has that. been of.
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