Gillies‑Govan法とDarrell‑Wahba法による ピオシン型別の完全比較と改良型別法の提唱
仲宗根恵俊
長崎大学熱帯医学研究所病原細菌学部門
A Comparative Study of Two Pyocine Typing Methods and the Proposal on an Improved Typing Method
Keishun NAKASONE (Department of Bacteriology, Institute for Tropical Medicine, Nagasaki University)
Abstract: Two pyocine typing techniques, Darrell-Wahba's and Gillies-Govan's methods, were tested to compare their dependability using 20 strains of the indicators for both methods, 14 of our type strain for G-G method including Type 1 and 16 received from Prof. Gillies, and 174 strains isolated in 1973/74 and typed by Yamaguchi. Twenty strains of the first group were also applied as the indicator throughout this study. All typing for appropriate number of test strains were conducted in the same day, and then repeated two more times at an interval of approximately four weeks. The results of pyocine typing of three groups were shown in Tables 1-4, 5-8 and 9-12 respectively.
According to the checker board experiment of 20 indicator strains, there was found no same pattern of sensitivity but a certain similarity in pyocinogeny was confirmed among
them. After checking all 4,160 combinations, there were found failures of reproduction in 5.2 per cent by G-G method and 13.3 per cent by D-W method. As shown in Tables 3 and 7, the cases in which inhibition observed only in G-G method were more frequent the cases in which it was found by D-W method alone. Table 11 and 12 show that wider inhibition patterns were detected by G-G method than D-W method, when the same indicator sets were used. The frequency of unclassifiable results consisting three different inhibition patterns was lesser in the order of original G-G method, G-G method with W1-W8, D-W method with G1-G8 and modified D-W method as shown in Tables 4 and 8-10. All these findings indicate that G-G method is more reproducible and more sensitive to detect pyocines than D-W method. Also it is possible to subtype pyocine types of two methods by using some other indicator strains. Finally, six strains, G3, G4, G6, G8, W4 and W8, were selected for G-G method, and applied to the results of Table 1, 5 and 9. As shown in Table 14, fairly good typing results were obtained without maldistribution which was observed in Tables 9-12, and most of these sero-types were divided into some groups of the pyocine types. This finding suggests that there is
本研究の一部ほ九州微生物研究会からの研究費によって行われた 長崎大学熱帯医学研究所業績第1 ,010号
Received for publication, October 16, 1980
a possibility for the use of our proposed type or sero-pyocine type as an epidemiological tool. Following are the main points of proposed pyocine typing method; the use of
1) culture of a selected la colony in nutrient broth containing 0.4 per cent KNO3 for test strain and indicator, 2) Gillies-Govan's procedure applying six indicators mentioned above, 3) reproducible patterns based on two or three tests at an interval of one week, and 4) recording by Farmer's proposal shown in Table 13.
T
ropical Medicine, 22(3), 189-207, October, 1980
緒 言
緑膿菌を遺伝学的性状によって標識する方法とし ては,酵素活性を中L八とした生物化学的性状,化学 療法剤,バクテリオファージまたはピオシソに対す る感受性,溶原性またほピオシソ原性,特異抗血清 に対する凝集性などを利用したものがある･これら のうち血清型,ピオシソ型,ファージ型は比較的安 定したものと考えられ,緑膿菌の疫学的研究の面に 利用されたものもある･
ピオシソを利用した型別法のうち,被検株が固型 培地上で産生したピオシソの特定指示菌群に対する 作用域による型別法は,まずBarrel! and Wahba (1964),ついでGi①①ies and Govan (1966)と全 く独自に提唱された･当部門の内藤は1967年両型別 法の指示菌を入手し得たのに伴って,各型別法の基 礎的検討と分離株の型別を開始また指導してきた
(内藤ら, 1971a, b, 1972b, c, 1973;古川, 1970;村上, 1970)･ついで完成の域に達していた 本間ら(1970)の血清型別とピオシソ型別の併用へ と進展してきた(内藤ら, 1972 a, 1977, 1980;村 上, 1976;山口, 1977)･その結果は成績再現性の 面からみると,血清型別, Gillies‐Govan法ピオシ ソ型別, Darre①①‑Wahba法ピオシソ型別の順に再 現率が低下し,いずれの型別法においても特定型へ の偏在が認められ,これを緩和する意味から血清･
ピオシソ型の応用性を提唱してきた･この際ピオシ ソ型別法としてほ再現性で有利なGillies‑Go¥ 法 を推奨してきた･
上記研究においてほ被検株の単一集落からの培養 を用いてそれぞれの型別法を同一日に併行して実施 し,またこれを反復して各方法での成績再現性を主 にした利用価値を検討している･その中にほ2種の ピオシソ型別を比較するた捌こ,それぞれの指示菌 を被型別棟として両型別を行ってはいるが,指示菌
として相互に利用して比較しようとの試みはなされ ていない.本研究でほGillies‑Govan法指示菌8 株とDarrell‑Wahba法指示菌12株の計2o株をそれ ぞれの型別法に対する指示菌としてはじめて利用 し,各棟の指示菌としての特性を比較するととも に,使用培地を含めた両型別法を一群の被検株に対 しては同一日に併行実施して,成績再現性も含めた 型別法の優劣を明らかにじようとした･またその結 果から比較的少数の指示菌を利用して,各型別法で の特定型‑の偏在を緩和できるピオシソ型別法の設 定を試みた･
まず実施した指示菌2o株の完全交差試験成績と教 室保存の Gil①ies｢Govan法型株を型別した一部の 成績については,昭和53年1月第12回線膿菌研究会 に発表し,その後完成した型株型別の最終成績と分 離株への適用成績,さらには指示菌群の選定につい ては,昭和53年11月第31匝旧本細菌学会九州支部総 会,昭和54年4月日本細菌学会総会に発表した･
材料と方法
使用菌株:被検菌株としては,後述の指示菌2o 秩, Gillies･Govan の型標準株(1型, 16型)と分 離株のうち成績再現性の良好なものから他の型株と して教室で常用してきた12株の計14株,さらに山口 (1977)が昭和48年5月より49年10月の問に,長崎 労災病院において,入院患者材料より分離同定し, 血清型別と両型別法を行った緑膿菌2ol株のうち, 保存されていた174株を使用した.
指示菌: Gillies‑Govan法の指示菌8株(順にG 1‑G 8)とBarrelトWahba法の指示菌12株(脂 にW 1 ‑W12)を合わせた2o株を両型別法に使用し た.
被検菌と指示菌の培養:緑膿菌ほ平板分離に際し て1a型とsm型‑解離することが知られており, 集落型によりピオシソ産生性または感受性が異なる
ことが報告されている(塩野谷･本間, 1968;内頼 ら 1972c, 1973)･本実験でほ被検菌,指示菌 ともに①a稚集落を選定じ ①a f.ま快打のために Sakamoto et al. (1975)を参考にじて0‑4%
KNO3加ブイヨソに培養して各型別用の培地に塗 抹した･
Gillies‑Govan のピオシン型別法: Gillies Govan (1966)に準じて以下のように行った.内径 8･5cmのシャーレにトリプトソイ寒天培地(栄研) に5%の割に馬脱線維血液を添加したものを40ml 注いで平板どする･ 3枚の平板の直径上に被検菌の KNOa加ブイヨンー夜培養を塗抹し, 32｡C 14時間培養後,シャーレの蓋にクロロホルムを浸し た円形膿紙をおいて30分間処理,スライドグラスの 一端で発育菌苔を除去,さらに3o分間クロロホルム 処理を続ける･ついで滴紙をとり出し 1‑1･5時
間シャーレの蓋をやや開いてクロロホルムの蒸散を 待ち, 20株の指示菌の).4% KNO③加ブイヨソ4 時間培養を被検菌の塗抹部と直角方向に両線塗抹, 37｡C一夜培養後,指示菌の発育阻止を記録した.
Gillies‑Govan法の型判定ほ指示菌8株の発育阻止 パターンをGillies‑Govan法の判定表(1 ‑36型:
Gillies and Govan, 1966, 37型: Govan and Gillies, 1969)に従い, Darre①トWahba 法の型判 定ほ同法の第1 ‑第8指示菌に対する発育阻止パタ ーンを山口(1977)提示の表に従って判定した･な お,成績再現性を検討するため,各被検菌につき日 をかえて3回の型別を行った(以下G‑G法と略 記)･
DarrelトWahbaのピオシン型別法 Darrell‑
Wahba(1964)の記載に従った･トl)プトソイ寒天 培地にヨード酢酸を10すモル,リン酸水素2 カリ
ウムとクエン酸ソーダをそれぞれ0‑1%添加したも のを,約40ml内径月.5cmのシャ｣じ,に分注して 平板とするつ 3枚の平板の直径上に被検菌のo･4%
KNOs加ブイヨン培養を塗抹し, 37｡C 24時間培養 後, GーG法と同様に,クロロホルム処理し,20株の 指示菌のo･ ¥% KNO.加ブイヨソ41時間培養を被 検菌の塗抹部と直角方向に塗抹し, 37oC一夜培養 して指示菌の発育阻止を記録した･型判定と型別の 反復は前項と同様に行った(以下D‑W法と略記).
実 験 と 結果 両法指示菌20株の交差試験
G‑G法の指示菌8株とD･W法の指示菌12株を 加えた2o株を産生菌側と指示菌側に用いて,同一日 に両型別法に従った交差試験を行った.交差試験ほ
2日後と3週後に反復し,前後3回の成績を得た.
G‑G法による交差試験: G‑G法で得られた3 回の成績をまとめたのが表1である. 3回の成績が 一致したものほ阻止帯の有無により+またほ･で表 わし,各回の成績間に差があった場合は2回の一致 成績を取り,これに異なった成績を示した回数を付 記した･ 4oo縄の成績のうち42組(10.5%)に成績 の不一致がみられた. tに°ォシソ原性の面で(表を横 にみて)全く不一致の成績がみられなかったのほG 8, W2, W3の3株であり, G2, G3, G4, G5, W9の5株でほそれぞれ1組, G7, Wl, W4, W5, W7, W12の6株で各2縄, Gl, G
6, W8の3株でそれぞれ3組, Wllが4組, WIO ほ5組, W6でほ7組に不一致があった･指示菌2o 株に対する発育阻止パタ‐ンが類似したピオシンを 産生していたのはG4とG8, G6とW2であった･
本研究でほ指示菌の選定を最終目的としているの で,逆に感受性の面で(表を縦に)みると完全に安 定していたのはG5とG6の2株であった･以下感 受性側からみて不一致の少なかった順に列記すると, W8, Wll, W12の3株でほそれぞれ1組の不一
致, G3, G4, G8, Wl, W3, W4, W5, W6, W7, WIOの1o株で2組ずつ, Gl, G7, W9の3株ほ3組, W2でほ4絶と続き, G2でほ
6組に及んでいた･これをG‑G法指示菌としてま とめると16o組のうち18組(H.3%)であるのに対 して, D‑W法指示菌でほ24o組のうち24阻(1o･0 潔)であり,これをWl‑W8の範囲でみても17組
(1o･6%)とほぼ同程度であった･
3回の成績のうち2回以上の一致で指示菌発育阻 止の有無を判定すると,すなわち表1の符号に付記 した数字を無視すると, G 3ほ供試2o株のうち18株 の産生ピオシソに感受性を示し,上述不一致の全く なかったG5が17株の, Gl, Wl, WIOがそれぞ れ16株の, G7が15株の, W6が14株の, G2が13 株の, W2, W5, W7, W9がそれぞれ12株の, G4が11株の産生ピオシソに感受性で,これら13株
Tablel・Checkerrboardexperimentofbothindicator strains byGillies‐Govan，s method
Prod. I n d i c a t o r
Gl G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 Wl W2 W3 W4 W5 W6 W7 W8 W9 W10 Wll W12
G l - -3 + + - - - - - +3 - - - +! - - - + +
G 2 + - + + - - + + + +3 + + - + - - - - +
G 3 - + - - + - - - + -2 - + - - - - - +
G 4 + + + - + - + - + - + -2 + + + - + +
G JC _ _- _- _- _- _- _- _- _- -f- -I _ _ _- _L _-J- _ _ _O _J _
G 6 + + + -2 + - + - + - + - + -2 + -3 + +
G 7 - - + +1 + - - - + +3 - + - - - - - + +
G 8 + + + - + - + - + - + - + + + - + +
W 1 + -3 + + + - + + - + - - + + + - - -2 -
W 2 + + + - + - + - + - + - + - + - + +
W 3 + + + + + + + + + + - + + + + - + + - +
W 4 + + + + + + + + + + -1 - + + + + + + +1 +
W 5 + +2 + + + - +1 + + + - - - + - - + + - +
W 6 +3 +3 +3 - + - +3 - + - + - -2 - -2 - +3 +
W 7 + -3 + + + - + +3 + + - - - + - - + + - +
W 8 + + + + + - + + + + -3 + + + +1 - - + - +1
W 9 + + + + + + + + + + + +2 + + + + - + + +
W10 +3 -1 +3 - + - - - -3 - - - + + + - +3 -
Wll +3 + + - + - +3 - +1 - + - +1 - + + + +
W12 + + + + + - + -2 + + + - + + + - +1 +
Checker-board experiments were repeated three times.
+: -f-H-(inhibition), +3: ++-, +2: +-+, +1: -++
-: (no inhibition), -3: -H, -2: -I-, -1: H-
ほ試験したピオシソの半数以上に阻止を受けていた こととなる･残る7株ではW3が9株の, G8が8 株の, W4とW12がそれぞれ6株の Wllが5株 の, 3回の成績が完全に一致していたG6に加えて W8の2株が3株の産生ピオシソに感受性と,感受 性域が順次狭くなっていた･ 2o株のピオシソに対す る感受性パターンが全く同じであったのはW5とW 7のみであって,これほこの交差試験の範囲内では 指示菌としての価値が等しいことを意味する･残る 18株ではそれぞれ異なった感受性パターンを示し, それぞれ指示菌として独立性があることを意味して いた.
D‑W法による交差試験: D‑W法による3回の 成績は表2に示した･ この場合4oo組の成績のうち 不一致があったのほ26組(6.5%)とG‐G法の場 合に比して少なく,またピオシソ原性の面で(表を 横にみて)完全に一致していたのほG4, G5, W 2, W4, W6, W7, W8の7株とG‑G法の3
株に比して多く,残る13株は, G3, G7, G8, Wl, W3, W5, Wll, W12の8株でほ各1組, GlとG6が2組ずつ, W9が3組, G2ほ4組, Wloでは7組の不一致であった･この場合G4, G
6, G8, W2の4株が類似のピオシソ原性を示し ていた･ →万感受性の面で(表を縦に)みると,全
く不一致がなかったのはGl, G8, W3, W7, W9, Wllの6抹で,これもG‑G法の2株に比し て多かった･同様に感受性面からみて不一致の少な かった順に整理すると, G3, G4, G5, G6, Wl, W2の6株ほそれぞれ1組の不一致, W5, W6, WIO, W12の4株で2組ずつ, G2, G7, W4, W8の4株はそれぞれ3組となっていた･以 上の所見ほすべてD‑W法の安定性を示すものであ った･これを指示菌群別に集計するとG‑G法の8 株にほ16o組のうち1o組(6.3%)に対して, D･W 法の12殊には24o組のうち16組(6･7%) , Wl‑W 8の範囲でみると12組(7･5%)とやや多い傾向で
T
able 2. Checker-board experiment of both indicator strains by Darrell-Wahba's method
p
j Indicator
r° ' GlG2G3G4G5G6G7G8WlW2W3W4W5W6W7W8W9W10WllW12
G l - -3 + + - - - - - -2 - - - - - - - + +
G 2 + - + + -1 - -3 + + + + -3 - + - - - -1 +
G 3 - - - - + - - - - - - - - - - - - -3 -
G 4 + + + - + - + - + - + - + - + - + +
G 5 - - - - - - - - - + - - - - - - -
G 6 + + + - + - + - + - + - +1 - + -3 + +
G 7 - - + + + - - - + + - -3 - - - - - + +
G 8 + + + - + - + - + - + - + -3 + - + +
W 1 + -3 + + + - - + - + - - + - + - -
W 2 + + + - + - + - + - + - + - + - + +
W 3 + + + + + - + + + + - - + + + - + + - -3
W 4 -f + + + + + + + + + - - + + + - + + - +
W 5 + + + + + - - + + + - - - -2 - - + + - +
W 6 + + + - + - + + - - + - + - + - + +
W 7 + + + + + - + + + + - - - + - - + + - +
W 8 + + + + + - + + + + + + + + + - - + - +
W 9 + + + + + + + - + + + -2 + + + +3 - + + -hi
W10 + -3 +1 -3 + -3 -3 - -3 - - - -3 - + - -
Wll + + + - + - + - + - + - + - + +1 + +
W12 + + + + + - +3 + + + + - + + + - - +
Remarks are the same as Table 1.
あった･
蓑1の場合と同様に3成績のうち2回以上の一致 で整理すると, G3, G5, Glは供試2o株のうち それぞれ18, 17, 16株の産生ピオシソに感受性を示 し,しかも表1の!バターソと同一であったが,以下 はWIOが15株の, Wlが14株の, G2とW7が13株 の, G7とW5が12株の, G4とW2が11株の, W 3とW9が1o株の産生ピオシソに感受性と,これら 13株は供試ピオシソの半数またほそれ以上に感受性 を示した.残る7株ではG8が9株の, W6が7株 の, W12が5株の, Wllが4株の, G6とW8が2 株の, W4が1株のと順次狭い感受性域を示してい た･この場合2o株の産生ピオシソに対する感受性パ ターンほG‐G法で全く同じであったW5とW7も 含めて,すべて興った感受性パターンを示してい
た･
両型別法の比較:蓑1と表2について2回以上の 一致成績を指示菌発育阻止の有無とみなし,両型別 法問での比較を行うため‑表にまとめて示したのが
蓑3である･すなわち単→の符号で示したのほ限止 の有無が両法で一致した場合であり,不一致の場合 ほG‑G法とD‑W法での成績をそれぞれ左と右に 併記した･この不一致は4oo組のうち34組(8ン5%)
にみられ,そのうちG‑G法でピオシソの産生ある いほ指示菌の感受性が良いと思われる組(十‑で示 した組)は28組で,逆にD‑W法でピオシソの産生 あるいほ指示菌の感受性が良いと思われる組(‑+
で示した組)は6組であった･従って両法を比較し た場合G〇G法でピオシソ型別法を行った方が, D‑W法で行うよりもより高率に被検株の産生ピオ シソの検出ができるものと思われた･
被検20珠のピオシン型:以上でほ被検株の産生ピ オシソの指示菌個々に対する3回の成績のうち2L0!
以上の一致で論じてきた･しかし型判定のためにピ オシソ型別成績の再現性を考える場合にほ,指示菌 セットに対する発育阻止パターン,すなわち各回の 型判定結果で論じられている.そこで表1と表2の 成績について, G一G法指示菌に対してほその型別
Table3．Comparisonofchecker−board experimentbyboth methods
Prod・GIG2G3G4G5G6G7G8WIW2W3W4W
（Indica亡。r）5W6W7W8W9W10W11W12
G 1 - - + + - - - - - + _ _ +- _ _ _ + +
G 2 + - + + - - +- + + + + H + - - - - +
G 3 - H - + - - - + - H - _ _ _ +- -
G 4 + + + - + - + - + - + - + +- + - + +
G 5 - - - - - - - - - + - - - H
G 6 + + + - + - + - + - + - + - + - + +
G 7 - - + + + - - - + + - +- - - - - - + +
G 8 + + + - + - + - + - + - + +- + - + +
W 1 + - + + + - +- + - + - - + +- + - -
W 2 + + + - + - + - + - + - + - + - -!- +
W 3 + + + + + +- + + + + - +- + + + - + + - +-
W 4 + + + + + + + + + + - - + + + +- + + +- +
W 5 + + + + + - +- + + + - - - +- - - + + - +
W 6 + + + - + - + -+ +- - + - -+ - -+ - + +
W 7 + -+ + + + - + + + + - - - + - - + + - +
W 8 + + + + + - + + + + -+ + + + + - - + - +
W 9 + + + + + + + +- + + + +- + + + + - + + +
W10 + - + - + - - - - - - - +- +- + - +- -
Wll + + + - + - + - + - + - + - + + + +
W12 + + + + + - + -+ + + + - + + + - +- +
+
-: positive by only Gillies-Govan's method, -+: positive by only Darrell-Wahba's method.
表, DたW法指示菌の場合ほWlからW8の範囲で 山口(1977)の型別表に従って型判定した結果を表 4にまとめた.この裏では各回の指示菌発育阻止パ ターンが一致した場合はそれによって判定した型 を,不一致の場合ほ左から1, 2, 3匝I型別時の型 を列記した･なお型別表に合わなかったパターンの 場合ucとしたが,この場合ある株に対するいずれ かの塑別法しかもいずれかの指示菌セットの範囲 (一連の3成績)内のみでパターンの異同を示すた めuc′を使用した･従って菌株,型別法,指示菌 セットが異った場合ucの相互間の一致不一致ほ蓑
1,表2によって確認する必要がある.
表に従ってG ‑G法指示菌に対する各回の発育阻 止パターンを比較してみる, G‑G法型別でほG2,
G3, G4, G5, G8, W2, W3, W4, W8, W9の1o株で3回の型別結果が‑敦,残る10株のう ち各回の型にそれぞれ差がみられたW 5とWloを除 く8株でほ3回のうち2回の型に一致がみられた･
これに対してD‑W法型別にG‑G法指示菌を適用
した場合ほ, G3, G4, G5, G6, G7, G8, W2, W3, W4, W5, W6, W7, W8, W9, Wllの15株で3回の型が一致,残る5株でほG 1, Wl, WIO, W12の4株で2回の型が一致,残る
G2は各回異なった型を示して, G‑G法より良好 な結果であった･しかし,この場合両型別法で全く 同じ結果であったGl, G4, G5, G8, W2, W4, W8の7株を除き,両型別法で差のあった13 株について表1,表2を参照しつつ詳細に比較する
と, G2, G3, G6, G7, Wl, W3, W5, W9の8株ではG‑G法による産生ピオシソがより 広域に作用する傾向が認められ,残るW6, W7, WIO, Wll, W12の5株でほ逆にD‑W法による産 生ピオシソが広域作用性を示していた･
次にD‑W法指示菌に対する各回の発育阻止パタ ーンを比較してみる･ G‑G法型別でほG5, G8, Wl, W2, W3, W5, W7, W12の8株で3回 の型が一致, 3回の型がそれぞれ違ったGl, G6, W8を除く9株では3回のうち2回の型に一致がみ
T
able 4. Typing results of both indicator strains from Tables 1 and
T
est Indicator G 1~G8 Indicator W1~W8
strain G-G method D-W method G-G method D-W method
G 1 uc uc lie' uc uc uc' uc uc' L NT uc NT
G 2 16 uc uc' 16 uc uc uc' uc uc uc'
G 3 29 5 uc uc' uc NT
G 4 3 3 uc uc' uc D
G 5 NT NT uc uc
G 6 3 6 3 3 D uc d uc D d
G 7 uc uc' uc' uc uc uc uc' uc uc uc'
G 8 3 3 uc D D uc
W1 18 18 1 uc uc 4 uc K
W2 3 3 D D
W3 10 1 E F
W4 10 10 b f f F
W5 4 18 1 4 uc uc uc' uc
W6 3 3 5 uc uc D uc uc
W 7 18 18 6 1 uc uc
W8 1 1 uc E a a
W 9 10 33 A b A b A B
W10 uc uc' 5 uc uc 33 uc uc uc' uc uc uc'
Wll 3 3 uc 3 uc d d D d d
W12 6 1 6 1 1 4 B B
When typing results were different in three tests, resulted types were arranged in experimental order.
uc and uc' only mean the difference in individual combination, so uc or uc' for other strains are regulary different each other.
られた･ →方D‑W法型別でほG3, G4, G5, Wl, W2, W3, W4, W6, W7, W8, W12
の11抹で3回の型が一致しており,毎回異なった型 を示したG6, W9の2株を除く7株でほ2回の型 に一致がみられ,この場合もG‑G法より一致率が 良かった･しかし,ここでも両型別法で全く同じ結 果を示したW2, W7, W12の3株を除く17株につ いて蓑1,表2を含めて詳しく比較すると, G｢G 法指示菌8株とWl, W3, W4, W5, W9, W loの計14株でほG‐G法による産生ピオシソの作用 域が広く,残るW6, W8, Wllの3株のみが逆に D‑W法による産生ピオシソの広域な作用性を示し ていた･
教室保存G‑G法型株の型別
教室でG‑G法ピオシソ型別を反復して行い,成 績再現性良好であることを確認し, G‐G法指示菌 の検定用型株として保存してきた14株(1型と16型
は英国由来型標準株)を対象に,前実験と同じく指 示菌を2o保として,同一日に両型別法を実施した･
この場合4週間隔で3回の型別を行った･
G･G法による指示菌発育組止:表5に示したよ うに, 3回の成績に不一致がみられたのは28o組の うち24縄(8･6%)であった･これを供試練のピオ シソ産生性の安定性として表示成績を横にみると, 全く不一致を認めず安定であったのはTy･ 3, Ty･
5, Ty. 24, NT(非産生)の4株であり, Ty. 6, Ty. 10, Ty. 16の3株でほそれぞれ1組, Ty･ 1, Ty･ 22, Ty. 27, Ty･ 29の4株で各2組, Ty. 14
ほ3組, Ty･ 11と Ty･ 33ではそれぞれ5阻に不一一 致があった･一方指示菌側からその安定度として表
を縦にみると, G3, G5, G8, W2, W3, W4, WIOの7株では常に一致,以下不一致がみら れたのほ, Gl, G6, Wl, W5, W8, W9の 6株でほそれぞれ1組の不一致, G2, G4, G
T
able 5. Pyocine typing of the type strains by Gillies-Govan's method
Test I n d i c a t o r
strain Gl G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 Wl W2 W3 W4 W5 W6 W7 W8 W9 W10 Wll W12
Ty. 1 + + + + + - + + + + + - + + + - + + +1 -1
Ty. 3 + + + - + - + - + - + - + - + - + +
Ty. 5 - - - - + - - - + - - + - - - - - +
Ty. 6 + + + +2+ - + - + + + - + - + - + +
Ty.10 + + + + + +1+ + + + + + + + + + + + + +
Ty.ll + +1+ - - - +1- -2 - - - + +3+1 - -
Ty.14 -1- + - + - + - + - - - - - - - - + +1 -1
Ty.16 + - + + - - + + + + + + - + - - -1 -
Ty.22 + + + - + + + - + - + + + + + + + + -1 +1
Ty.24 - - + + + - + + + + - - - + - - + +
Ty.27 + - + - + - +1- + - - - + - +1- - + - -
Ty.29 - +2- - + - - - + - - + - -!- - - +
Ty.33 + + + -1+ + + - + - + + +2+ + +3+ + -1 +1
N T _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ + _ _ _ - _ _
Typings were repeated three times in every four weeks.
Symbols are the same as Table 1.
7, W6, W7の5株で2組ずつに, WllとW12で ほそれぞれ4組に不一致がみられた. G‑G法指示 菌8株の場合は112組のうち8組(7･1%)であった のに対し D‑W法指示菌12抹では168組のうち16 級(9.5%)とやや多い傾向であったがWl‑W8
の範囲でみると7組(6･3%)と少なかった.
3回のうち2回以上の一致で指示菌発育阻止の有 無を判定すると,すなわち表5の符号に付記した数 字を外して考えると, Wlが供試14株のうち12株の 産生ピオシソに感受性を示し, G3, G5, G7, Wloが11抹の, Glが9株の, G2, W3, W5, W7が8株の, W6, W9が7株の産生ピオシソに 感受性で,これら12株ほ非産生を除くと試験したピ
オシソの半数以上の阻止を受けていたこととなる･
残る8株でほW4が6株の, G4, W2が5株の, G8が4株の, G6, W8, Wll, W12が3株の産 生ピオシソに感受性と順次感受性域が狭くなってい た･
D‑W法による指示菌発育阻止:供試14株のD‑
W法による型別結果ほ表6に示した. 3回の成績に 不一致がみられたのは28o組のうち34組(12.1%)
とG‑G法に比して多かった･これを供試株のピオ シソ産生性の安定性として表の成績を横にみると, 不一致が全くなかったのはTy. 3のみで, Ty. 6,
Ty･ 16, Ty･ 24, Ty. 29の4株でほそれぞれ1組, Ty･ 1, Tyン5, Ty･ 27の3株で各2縄, Ty･ 22と Ty･ 33で3組ずつ, Ty. 14とNTでそれぞれ4組, Ty. 10とTy･ 11で各5組と順に不一致が多くなっ ていた･一方表を縦に指示菌側から成績の安定度を みると, G8, W4, W9の3株が完全に一致,以 下Gl, G3, G4, G6, W2, W5, W6, W
7, W8, WIOの1o株でほそれぞれ1組の不一致, W3に2組, G2とW12で各3組, G5, G7, W
1, Wllの4株でほそれぞれ4縄の不一致があっ た･ G･G法指示菌8株については112組のうち15 組(13･4%)であったのに対して, D･W法指示菌 12株では168組に19組(11･3%), Wl‑W8の8株
でみると11組(9･8%)と少ない傾向があった･
表5の場合と同じく3成績のうち2回の一致で指 示菌発育阻止の有無を判定すると, G 3とWloが供 試14株の産生ピオシソのうち11株のそれに感受性を 示し, Gl, G5, G7が1o株の, W5とW7が8 株の, G2, Wl, W9が7株のと,以上1o株が供 試ピオシソの半数以上の作用を受けていた.残る1o 株でほW3とW6が6株の, G4, G8, W2が4 株の, WllとW12が3株の, G6とW8が2株の, W4が1株の産生ピオシソの阻止を受けて,順次に 狭い感受性域となっていた･
T
able 6. Pyocine typing of the type strains by Darrell-Wahba's method
Test 工 n di c a t o r
Strain GIG2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 WIW2 W3 W4 W5 W6 W7 W8 W9 WlO WllW12
Ty. ! + + + + + - + + + + + _ + + + _ + + +1 -1
Ty. 3 + + + - + - + - + - + - + - + - + +
Ty. 5 - - - - +3 - - - - - - - - - - - - +3 -
Ty. 6 + + + -3+ - + - + + + - + - + - + +
Ty.10 + + + + -3 -2 + + +3 + -2 + +3+ + - + + + +
Ty.ll + +1+1 - - - +1 - - - - - + +2 +1 - -
Ty.14 +2 - + - +1 - +1 - - - - - - - - - - + +1 -
Ty.16 + - + + - - -2 + - - - - - - - - -
Ty.22 + + + - + + + - + - + - + + + +1+ + -l +i
Ty.24 - - + + + - + + + +2 - - - + - - + +
Ty.27 + - + - + - +1 - -1 - - - + - + _ _ + _
Ty.29 - -1 - - + - - - - - - - - - - - - + _
Ty.33 + + + - + + + - +3 - + - + + + + + + -1 +1
N T - -1 - - -1 - - - -1 - +2 - - - - - - - - -
Remarks are the same as Table 5.
T
able 7. Comparison of both methods using type strains
Test I n d i c a t o r
strain Gl G2 G3 G4 G5 G6 G7 G8 Wl W2 W3 W4 W5 W6 W7 W8 W9 W10 Wll W12
Ty. l + + + + + - + + + + + - + + + - + + +
Ty. 3 + + + - + - + - + - + - + - + - + +
Ty. 5 - - - - + - - - +- - - + _ _ _ _ +
Ty. 6 + + + +-+ - + - + + + - + - + - + +
Ty.10 + + + + +-+- + + + + +-+ + + + +-+ + + +
Ty.ll + + + - - - + - - - + + + - -
Ty.14 -+- + - + - + - + _ _ _ _ _ _ _ + +
Ty.16 + - + + - - +-+ +-+-+-+- - +- - - -
Ty.22 + + + - + + + - + - + +- + + + + + + - +
Ty.24 - - + + + - + + + + - - - + - - + +
Ty.27 + - + - + - + - +- - - - + - + - - +
Ty.29 - +- - - + - - - + _ +_ _ ., _ _ _ +
Ty.33 + + + - + + + - + - + +- + + + + + + - +
N T - - - _ + _ - - _ - -
Remarks are the same as Table 3.
両型別法の比較:交差試験の場合と同様に表5と 表6の成績で3回のうち2回の一致成績を取り(符 号に併記した数字を外して) , ‑表に整理したのが 表7である･表でほ両型別法の結果が‑一致した場合 ほ単一の符号で,差があった場合左にG‐G法,右 にD‐W法での態度を示した 280組のうち21組
(7.5%)に差があったが,そのうちG‑G法でのみ 阻止があったのが2o組, D‑W法に限って阻止の認 抵られたのはわずか1組であって,ここでもG‑G 法によってD‑W法より高率に被検株の産生ピオシ ソが検出できることが示されていた.
被検14株のピオシン型:交差試験の場合と同様に
表5,表6に基づき各回の型判定結果をまとめたの が表8である･
G‑G法の条件で型別を行い, G‑G法の指示菌 で判定すると,Ty･ 1, Ty. 3, Ty･ 5, Ty･ 16, Ty･ 22, Ty･ 24, NT (非産生)の7株では完全
な再現性を伴って, Ty. 6, Ty･ 10, Ty. ll, Ty･
14, Ty. 27, Tyン29の6株では2回の成績再現で 期待したピオシソ型を示し, Ty･ 33のみほ第1回 は33型を示したが,続く2回の成績により22型と判 定するほかなかった･ D‑W法の条件で型別を行 い, G･G法の指示菌で判定すると, Ty･ 1, Ty･
3,Ty. 5, Ty. ll, Ty. 22, Ty･ 24, Ty･ 27, Ty･ 33,非産生の9株ほG‑G法の判定と同一型
を示したが, Ty･ 6ほ3型, Ty. 16ほuc, Ty.29 ほ5型と判定され, Ty･ 1oとTy･ 14でほ毎回異な った態度を示していた･表7で両条件での指示菌の 作用の不一致点をみると, Ty･ 6対G4, Ty･ lo封
G5およびG6, Ty･ 16対G7, Ty･ 29対G2で ほD‑W法の条件でピオシソ作用が認められなくな っているが, Ty･ 14対Glでほ逆にピオシソ作用が 追加されていた.
D‑W法の指示菌8株で判定すると, Ty･ 1がB 壁, Ty･ 3がD型, Ty･ 6がuc, Ty･ 24がuc,
NTがucと両条件で同一型に型別できたほかは,
両条件でのピオシソ産生に差がみられ,特仁D‑W 法の条件で非産生であった株がG I G法の条件では ピオシソ産生を認める株が4株みられた.また表7 によると両条件での指示菌に対する作用の不一致点 ほすべてG‑G法の条件でピオシソ作用を認めてい
た･
分離保存株の型別
材料と方法の項で述べた佐世保分離の保存株174 株を同じく指示菌を2o株として, 1群の菌について
は同一日にG‑G法とD‑W法の培養条件により, 3‑4週間隔で3回の塑別を行った･
G‑G法による型別成績:表示は省くが174株の 指示菌2o株に対する3,480成績のうち3回の成績が 一致したのは3,330 (95･7%)であったン これを供 試株のピオシソ産生性の安定性としてみると,全く 不一致がなく安定であったのほ76株, 1組の不一致
が6o株, 2組が29株, 3組が6株, 4組が1株, 5 組が2株となっていた,一方指示菌側からの安定度 としてみると,全く不一致がなかった指示菌ほ一つ もなく, Gl, G2, G3, G7,WIOが1組, G 5,W2,W5が2組, G4,W7,Wllが3組, W3が4組,Wlが5組,W6,W9が6組, G8
が7組と続き, G6は22組, W12ほ23組, W8は28 組, W4ほ最も多く29組に達していた･ G‑G法指
T
able 8. Typing results of type strains from Tables 5 and 6
Test Indicator G1- G8 Indicator W1-W8
strain G-G method D-W method G-G method D-W method
Ty. 1 1 1 B B
Ty. 3 3 3 D D
Ty. 5 5 5 5 NT uc NT
Ty. 6 6 3 6 3 3 6 uc uc
Ty.lO 1 10 10 uc uc' 1 A E a uc
Ty.ll uc ll ll uc ll ll uc uc' O uc uc' uc"
Ty.14 uc 14 14 uc 14 27 P NT
Ty.16 16 uc 16 uc uc NT
Ty.22 22 22 uc uc uc' uc'
Ty.24 24 24 uc uc uc' uc
Ty.27 uc 27 27 uc 27 27 uc uc' uc' uc O O
Ty.29 29 5 29 uc 5 5 uc uc' uc' NT
Ty.33 33 22 22 22 uc uc' C uc
NT NT HP NT NTT uc uc NT uc
R
emarks are the same as Table 4.
示菌8株に対する1,392成績のうちにほ38組(2.7 潔)の不一致がみられ,一方D‑W法指示菌12株で ほ2,(成績のうち112組(5･4%) ,これをWl‑
W8の範囲でみると79組(5.7%)となっていた･
供試174株を各回のG 1‑G8またほWl‑W8 に対する発育阻止域として塑判定し,型として2回 以上一致したもので最終判定,その結果を相関的に 示したのが表9である･本来の方法であるG‑G法 指示菌8殊による型別結果ほ1o型77株, 1型61株,
3型2o株,非産生5株, 5型3株, 3o型と型別不能 (蓑11のuc C)それぞれ2株, 6型と2種の型別 不能(表11のucA, UCB)各1株と173株が10種 の型にわかれ,残る1株は3回の型がそれぞれ異な るvariabletype (VT)であった.これらのうち3 回の型が一致したのほ10型64株, 1型50株, 3型16 樵, 5型2株, 3o型2株,型別不能3株(uc A 2 株 uc B l株,表11参照),非産生5株の計142株
で, VTを除く173株の82.:であった･一方D‐
W法指示菌8株での型別結果ほa型43株, B型4o 樵, b型27株, A型22株,非産生7株, D型5株,
d型3株, P型2株, E型とK型各1株,型別不能 19株(5, 1 1, 1, 1 株 ずつの10種の型,表12参照)と170株が20種の型を 示し,残る4株ほvTであった･この場合3回の 型が一致したのはB型29株, a型26株, b型2o株, A型9株, D型4株, d型3株,非産生3株,型別 不能11株(表12の uc 1 2株 uc 5 5株, uc 6, 7, 8,10 各1株)の計1o5株で,VT 4株
を除く17o株の61.8%であった･また本表の成績は G･G法で多数株の属した1o型, 1型, 3型がD‐
W法指示菌8疎またはその一部の追加使用によって 亜型別できることを示しているともいえる.
D‑W法による型別成緯:この場合も表示はし ないが, 174株を指示菌20株で型別して得た3､480 成績のうち3回の成績が一致したのほ2,i成績 (85.8%)であって, G‑G法の場合に比較して低 率であった･これを供試株のピオシソ産生性の安定 性としてみると,全く不一致がなく安定であったなの は41株, 1組の不一致が47株, 2組が29株, 3担が 12株, 4担が14株, 5組が5株, 6担が3株, 7組 が3株, 8担が4株, 9組が4株, 1o組が1株, ll 担が2株, 13組が1株, 14組が2株, 15縄が5株, 最高17縄の不一致が1株みられ,ピオシソ産生性の 安定度はG･G法に比してかなり劣っていた･一方 指示菌側からの安定度としてみると,ここでも全く 不一致がなかった指示菌ほみられず, W8が3組, G4が14組, Gl,G3,G6,G が16組, G2,
G7が18組,Wl:19,W2 :21,W12:22,W 7:24,W9:25,W6:28,WIO:32,W3:34, G5: 35, W5: 41, W4:45, Wllは最高の47組 に達していた G‑G法指示菌8株に対する1,392 成績のうち153組(ll‑0%)の不一致であったのに 対して, D‑W法指示菌12株で2,088成績のうち341 組(16･3%),これをWl‑W8の範囲でみると215 組(15･4%)となり, G‑G法に比し指示菌の安定 性ほかなり劣っていた.
T
able 9. Pyocine types of 174 isolates by Gillies-Govan's method applying indicators G1-G8 and W1-W8
G
-G D-Wtype obtained by G-G method
type A a B b D d E K P uc VT NT Total
18 33
25
1 12
1 1
T
otal 22 43 40 27 19 174
この成績を表9と同様に,各回のG‑G法またほ D ‑W法指示菌に対する態度で判定した塾の再現性 に基づいて整理したものが表10である. D‑W法指 示菌のうちWl‑W8の8株により型別した結果ほ B型78株, D型18株, a型16株, F型と非産生各 lo株, E型3株, H塑2株,型別不能12株(2,
2, 1, 1, 1, 1, 4株ずつの7種,表12参照) と151株が16種の塾に分散し,残る23株ほvT と なっていた.この場合3回とも同一型を示したのは B型41株, D塑13株,非産生6株, a型4株, F塑 3株, 0塑, P型,塾別不能の2種(表12のuc 6 とuc 10)の各1株と計71株でVTを除く151株 の47･o%であった･一方G‑G法指示菌により判定 した結果ほ, 1型11o株, 3型21株, 1o型11株,非 産生8株, 6型2株, 3o型1株,型別不能9株(1,
3, 2, 3株ずつの4種,表11参照)と162株が1o 種の型となり,残る12株ほVTであった.これら のうち1型75株, 3型2o株, 10型6株,非産生5 秩, 6型と型別不能(表11のuc C)の各2株,型 別不能(表11のuc D) 1株の計111株(vTを除く 162株の68･5%)は3回の型が一致していた･この 表の成績もD‐W法で多数株の属したa型, B型,
D型, F型の細分がG‑G法指示菌またほその一部 の追加使用で亜型別が可能であることを示している といえるが, B型を除いてほ余り明確ではなかっ た.
両型別法の比較:供試174株の型別成績のうち各 型別法でG ‑G法指示菌の部分について両法での結
果を対比させたのが表11である･いずれの型別法で も1o種のピオシソ型に型別され, 2o株以上が所属し たピオシソ型は両法ともに1型, 3型, 1o型であっ た･これら3種の型のうち1o型ほG‑G法では77株 であったが D‑W法でほ11株となり残る66株のう ち61株はG6‑の阻止を欠いた1型‑, 2株ほ6指 示菌を阻止する型別不能, 3株はvT と判定され,
1塑ほG･G法では61株あったものが, D‑W法で は49株で,残る12株は非産生2株を含む指示菌に対 する阻止が少なくなった型,またはvTと判定さ れ, GーG法での3型はD‑W法でも3型であっ た･本表を全体としてみるとD‑W法による1型‑
の偏在とvTの増加が著明であった･
表12はD･W法指示菌のうちW 1 ‑W8の部分を 用いて得た両法でのピオシソ型を対比させたン D‑
W法の条件で型別すると山口の型別表にある9種と 型別不能の7種の計16種に型別されたのに対して, G ‑ G法では型別表の1o種と型別不能の1o種計20種 となっていた. 1o株またはそれ以上が属したピオシ ソ塑はD‑W法によるとB型78株, D型18株, a型 16株, F型と非産生各1o株の5種であったが, G‑
G法ではa型42株, B型4o株, b型27株, A型23株 の4種であり,非産生ほ7株と減じていた･ D‑W 法B型78株のうちG‑G法でもB型と判定されたの
ほ32株であり, 22株ほa型, 14株がb型, A型が8 株と阻止された指示菌数の増加がみられ, D型18株 もうち5株が同型であったほかはd型3株, 5種の 型別不能9株といずれも発育阻止指示菌数が増して
T
able 10. Pyocine types of 174 isolates by Darrell-Wahba's method applying indicators G1~G8 and W1~W8
G
-G
type D D-Wtype
H O P uc VT NT Total
1 15 65 2 9 3 16 110
3 16 4 1 21
6 2 2
10 ll ll
30 1 1
uc l l 1 1 2 1 2 9
VT 1 1 1 2 5 2 12
NT 2 1 5 8
T
otal 16 78 18 10 12 23 10 174
T
able ll. Pyocine types of 174 isolates by both methods using indicators G1~G8
Type and Pattern Type by D-W method
byG-Gmethod 10 1 6 3 30 uc B C D E VTNT Total
10 ++++++++ ll 61 2 3 77
1 +++++-++ 49 1 3 6 2 61
6 +++++-+- 1 1
3 +++-+-+- 20 20
30 -++ 1 1 2
iD . _j_ ^ ^
uc A -+++H h+ 1 1
uc B ++H 1 1
uc C --+ 2 2
VT 1 1
NT 2 3 5
T
otal ll 110 2 21 3 12 8 174
UCD: h+, UCE: +++H h
T
able 12. Pyocine types of 174 isolates by both methods using indicators W1~W8
Type and Pattern Type by D-W method
byG-Gmethod a BE F D0HPuc569101112 13VTNTTotal
A IIIIIIII 6 8 2 1 1 5 23
a IIIIIII- 9 22 1 10 42
b +++-++-H- 14 1 7 3 2 27
B -H4-4-H-- 32 1 1 1 3 2 40
E II MM 1 1
K -H +-+- 1 1
P H 1 1 2
uc 1 IIIII ++ 3 2 5
uc 2 -H-H--+++ 1 1
uc 3 +-+++-++ 2 2
uc 4 -H-H-H- 1 1
uc 5 +-+-H-+- 2 2 1 5
uc 6 -+-+-H-+- 1 1
uc 7 ++-+- 1 1
uc 8 H-+ 1 1
uc 9 -+-H 1 !
uc 10 -H 1 1
VT 2 1 1 4
NT 1 1 5 7
T。tal 16 78 31018121 2 21111 4 2310 174
uc ll: +++-++-, uc 12: -H-+-+-+-, uc 13: ++-++-,
おり, a型16株の場合9株はa型, 1株は塑別不能 で阻止した指示菌数ほ同じであったが, 6株ほA型 と増加, F型1o株もB型の1株を除いてはA型とa 塑各1株, b塑7株と,また非産生1o株のうち5株 にも阻止された指示菌の増加がみられた･表11の場 合と同様に本表を全体としてみると, G‑G法によ ると特定型への偏りほ著明でないのに対して, D‑
W法でほB型‑の偏在と多数のvT株の存在が目 立った･
総括と 考察
緒言で述べたように本研究では,交差塗抹法によ るピオシソ型別法としてそれぞれ独自に提唱され, 一部でほ応用されてきたD‑W法とG‑G法につい て,各方法に他法の指示菌までを含めての型別を行 ったン その目的ほ従来全く報告のなかった指示菌の 相互利用により,両型別法を比較検討する点にあっ た･成績の部では被検菌群それぞれの成績を記述し てきたが,以下でほ全被検株としてみた両法の比較 を行ってみる･
まず被検株と個々の指示菌の問に得られた3成績 の不一致率としてみると, G‐G法でほ指示菌交差 試験,型株の型別,分離保存株の塑別の順に,既述
のように42/400 (10･5%) , 24/280 ･6%) , 150/3,480 (4･3%)となり,合計すると216/4,160
(5.2%)であった･これに対してD･W法では26/
400 (6.5%) , 34/280 (12･1%) , 494/3,480(14･2 浴) ,合計554/4,160 (13.3%)とG‑G法に比し て約2･5倍の率になっており G‑G法において一 致率が良いとまとめられる･
つぎにピオシソ型別に際してのピオシソ産生その もの,または一旦産生されたピオシソの不括化の抑 制の面についてほ,交差試験と型株の型別の場合そ れぞれ3回のうち2回以上の一致を基準に表3と表 7に示した.両表からG‑G法で産生･ D･W法で 非産生またほ道の場合を集計すると,それぞれ48組 と7組となり, G｢G法のみで検出される場合が D‐W法のみで検出される例に比してほぼ7倍とな る･この成績の基礎である表1と表2および表5と 表6によって,指示菌の感受性にほ問題がなかった
ものとみなして,両法での各回の成績に差があった ものを集計すると,それぞれ120/1,200 (10%) , 75/840 (8･9%)と著差ほなく, うちG‐G法のみ
陽性が82+67‑149, D‐W法のみ陽性が38+8‑46 となる･ G‑G法のみでの検出が逆の場合の約3倍 と上記約7倍に比して低下したが, G‑G法ではD
‑W法よりピオシソ検出率が高いことほ明らかとな った･このような集計ほ分離保存殊については行わ なかったが,この傾向は表11,表12の説明で述べた ように, G‑G法においてD‑W法の場合より広域 作用性のピオシソ型に型別される例が多かった点か らも支持される.
ついで今回得られた成績を産生側に問題がなかっ たものとみなして,各指示菌について考えてみる.
被検各菌群について個々の指示菌が示した既述の不 一致を集計すると, G‑G法で実施した場合G5ほ 分離保存株のみに2株, G 3とWloではそれぞれ計 3株, GlとW5 : 5株, G7, W2, W3:6 秩, G4とW7:7株, WlとWll:8株, G2と G8:9株, W6とW9:1o株 G6:23株, W 12 :28株, W8 :30株,最も多いW4で31株の順と なるのに対して, D‑W法でほ最も少なかったW8 が7株,つづくG4とG8ほ16株, Gl :17株, G 3とG6 :18株, W2 :23株, G2とWl :24株, G7, W7, W9:25株, W12:27株, W6:31 秩, WIO:35株, W3 :36株, G5 :4o株, W5 : 44株, W4 :48株,最高のWllが51株と, G6, W
8, W12を除いてはいずれも多くなっていた･この 結果からみてもG‑G法において成績の安定性がす
ぐれているといえる･
第4として以下では各回の型別に当っての指示菌 発育阻止パターンとして再現性の集計を行ってみ る･この際指示菌2o株としての比較ほ行わず,既述 の範囲であるGl‑G8またはWl‑W8のそれぞ れに対する両法でのパターンとしてまとめることと する. G‑G法によるGl‑G8の場合,交差試験 でほ表4から3回一致が10/20, 2回一致が8/20, 型株の型別でほ表8から同じく7/14, 7/14,分離保 存株の型別でほ既述のように142/174, 31/174} 全 株としてみると159/208, 46/208となる･ G‑G法 によるWl‑W8でほ順に8/20, 9/20, 10/14, 2/14, 105/174, 65/174で計123/208, 76/208, D‑
W法によるG 1‑G8は15/20, 4/20, 5/14, 7/14, 111/174, 51/174,計131/208, 62/208, D･W法に
よるWl‑W8でほ11/20, 7/20, 8/14, 4/14, 71/
174, 80/174,計90/208, 91/208と集計される･こ
れを3回の｢一致でみるとG‑G法原法, G‑G法指 示菌によるD‑W法, D‑W法指示菌によるG‐G 法 D‑W準原法の順に一致率が低下, 2阿以上の 一致としてみた場合わずかの差で2位3位が逆転す るのみであった･これを総合した場合前述と同様型 別方法としてのG‐G法手技の優位が立証されたも のといえる･
Zabransky and Day (1969)ほD‐W法を利用し た際に D‑W法指示菌のうちW5とW7は型別原 義(古川, 1970の表1参照)のとで同一パターンを 示し,指示菌12株の交差試験でもこの2株ほ同一と 判断されたとして, W7を除くWl‑W8の7株に よるMayo ピオシソ型を実施提唱し W9‑W12 ほ亜型別に利用できるとした,この考え方ほ当教 室でのD‐W法の判定に応用されてきたが,古川 (1970)またほ内藤ら(1972a, b, 1973)の分離 株に対する型別結果でほW5とW 7に対する不一致 例もあることからWl‑W8を使用し,適用上の便 宜から山口(1977)の表6に示した型別表を提示す
るに至った･
このW5とW7について今回の結果から以下に整 理を行ってみる D‑W法によった場合,交差試験 においても表2に示したようにG6に対して1回, WIOに2回,蓑6でほTy. 10とTy. 11に各1回
の不一致があり,表12によると分離保存株にもuc llの1株とuc13の4株が含まれており,この2抹 が完全に同じとほいえず,それぞれ感受性面で特異 性を有するものとみられた･この見方ほG‑G法の 成績でも表1でW8とWllに各1回,表5ではTy1 ll, Ty･ 27, Ty. 33 にそれぞれ1回の不一致がみ
られ,表12に示した分離株のうちにも1株ずつでは あるがuc 2と uc 4が存在した所見からも支持さ れている･
改良型別法の提唱
ピオシソCた)産生性またほピオシソに対する感受性 が遺伝的支配によって安定しているとの立場で考え ると,被検株の産生したピオシソが特定の指示菌セ ットにどのような作用域を示すかによる型別と,道 に特定のピオシソ群を設定して被検株の感受性域を 調べる型別とが考えられる･前者としては本研究の 対象であるDarre①トWahba法(1964)とGil①iesー Govan法(1966),後者としてほOsman法(1965)
Ramp①ing et al. (1975)の方法などがある･また
Farmer and Herman (1969), Fa①kiner and
Keane (1977)ほ両者を併用した型別法を提唱し ている.しかしピオシソ型別法の実用性および普及 性を考えた場合,特定ピオシソ群を設定する場合に はピオシソ液調製と作用域検定,さらにはピオシン 液に混在するノバクテリオファージの影響まで加わ り,かなりに煩雑な準備を必要どする点が問題とな る･これに対して特定指示菌に対する被検株産生ピ オシンの作用域による型別,特に固型培地上の交差 塗抹による方法ほ,指示菌群の保存でその目的を達 し得る点極めて有利と考えられ,これが当教室でG
‐G法とD‐W法の比較を続行してきた理由でもあ った･
一般に!バクテ1)オシンまたはファージ塑別法にお いてほ,被験株が型別表に記載のないパタ｣ンを示 した場合unclassifiable (型別不能)として記載さ れてきた･ 1970年Farmerほ表13に示した成績の 記載法を提唱したが,これの利用により型別不能と の記載は皆無になり,成績の記載および比較に極め て便利であることほ明白である･
本研究においてほ従来実施されていなかったG‑
G法とD‑W法‑の指示菌の相互利用を行ったの で,以下では分離保存株に対する成績から可及的少
T
able 13. Mnemonic for reporting bacteriocin and bacteriophage types by Farmer
(1970)
R
esult for 3 tests Representation
+ + +
4- + -
+ - +
~ + +
- - +
E
ach of the subsequent date triplets is assigned its proper number in a similar fashion. Thus,
a test strain which has a pattern (-1
-+--++ -i h -+-)wouldbe
type 564386. If the number of tests is not evenly divisible by three, a second (++=A,
+-=B, -+=C, --=D) and third (+
=E, -=F).
ない指示菌により,特定型への偏在の少ない型別法 の設定を試みる･
固塑培地にほ限定はされないが,ピオシソ産生 と同時に産生されるピオシソ不括化物質の影響ほ Wahba (1963)が考慮に入れ,その検討の結果D‑
W法にはトリプトンソ‑ヤ寒天培地にヨード酢酸 10‐EM,クエン酸ソーダと′)ン酸水素2カリウムを それぞれ0‑1%に添加して解決したとしている･一 方G‐G法でほ5%ウマ血液加トリプトンソ｣ヤ寒 天を用い, 32〇C 14時間の低温短時間培養を推奨し た･またD‑W法指示菌を入手しての比較試験でも 支持されたとしているが, D‑W法培地での比較に ほ触れていないン そこでまず本研究の結果をみる ど,総括と考察において述べたように,今回供試し た2o8株を指示菌2o株に対してG‑G法とD‐W法 の条件で型別した場合,いずれの観点からみてもG
‑G法が優位であった,そこで型別用培地,培養温 皮,培養時間ほG‑G法を採用することとした･
指示菌の選択に当っては,まず型の表現に上述 Farmer (1970)の提唱を利用することを前提に,
2数字で表現するため理論上64種の型が設定できる 6株とし,指示菌群のうちG‑G法から4株, D‑
W法から2株との方針で臨んだ･まず最も高率にピ オシソを検出できる株として表1,表5,表11を通
じて最も感受性域が広かったものとしてみると, 2o8株のうち194株に感受性を示したG 3があげら れ,しかも3回の成績に不一致がみられたのは表1 の2株(W6とWIO)と分離保存株での1株の計3 株と,安定した感受性を示していた･つぎにG‑G 原法で従来からも検出率が高く,また本研究でも同 様であった1型, 3型, 1o型を互に区別するに必要 な株として考えると, 1型と1o型の区別にはG6が 不可欠,さらに3塑を分別するにはG4またほG8 が必要である･ G 6の場合3回の成績に不一致がみ られたのほ,蓑1にほ皆無,表5で1株(Ty. 10) と少なかったが,分離保存株で22殊に達して,指示 菌2o株中17位と成績安定性に問題を残した･しかし G 6は,感受性域が極端に狭いにかかわらずD･W 法指示菌のうちからも代用可能な株ほ見出されず, 改良法指示菌として採用するほかないと考えられ たなに. G4とG8の場合ほ,不一致が合計でそれぞれ 7株と9株で特に良好とはいえないので,両株を採 用して3型の確認を強化するとともに,両殊に対す
る感受性の差による型設定を行うこととした･一方 D‑W法指示菌のうちWl‑W8から2株の選定は 表9の成績としてG‐G法で多い1型と1o型がWl
‑W8を利用したG‐G法でA型, a型, B型, ち 型に細分可能との知見に基づいて行った.すなわち 蓑12のパターンを参照すれば明らかなようにW4と W8を採用することとした･この2株の場合3回の 成績不一致ほ分離株で特に多くそれぞれ合計で31株 30株と最悪であったが,選定理由を考えると他の株 の採用は不可能であった.
分離保存174株のGIG法による成績のうちから 上記で選定した6指示菌に対する部分を各回のパタ ーンとして採用, 3回一致したものと2回一致した ものを供試株のピオシソ型とし,また山口(1977) の記録による血清型も利用,さらに表13で示した Farmer (1970)の成績記載法も併用して整理した のが表14である.これによると174株のうち各回の 指示菌発育阻止パターンに差がありVT と した8 株を除く166株が14種の型に分けられたこととなる･
G‐G法で1o型を示した77株のうちvTへ移行し た2株を除く75株が11型18株, 12型26株, 13型27 樵, 15塑4株と細分されており, G‐G法1型61株 のうちVT ‑移行した5株を除く56株ほ21型5株, 22型19株, 25型32株に分れているが,理論上考えら れる14型はみられなかった･ G‑G法型別での3型 20株は1株がvT となったほかは54型6株, 57塑 3株, 18型1o株と分かれ,残る3o型2株とucBの 1株が共に56型と統合され, 5型3株, uc Cの2 株 uc Aの1株ほそれぞれ88型, 58型, 25型に組
込まれ, 6型1株とvTであった1株ほそれぞれ 26型, 82型となっていた.血清型を確認していなか ったので本表にほ加えなかったが,表1から判るよ うに指示菌Gl‑G ほ順に28, 22, 86, 58, 88, VT, 26, 58の各塑, Wl‑W12も順に25, 58, 12,
13, 25, 58, 25, 22, ll, 58, 57, 28の各型となり, 蓑5より型株も順に25, 58, 86, 28, ll, 58, 58, 22, 34, 25, 58, 86, VT, の各型となった･結 局今回供試の2o8株のうちVT IO株を除く198株が 表14に示した14種のほかに28型, 34型, 86型を加え た17種の型に型別されたこととなる･各型とその所 属株数ほ25型38株を最高に, 13型28株, 12型27株, 22型22株, 58型21株, 11型2o株, 88型1o株, 54型6 樵, 21型5株, 15型と57型各4株, 28, 56, の各
