道衛研所報Rep． Hokkaido Inst． Pub． Health，54，81−84（2004）
多包虫エキノコックスのantigen BサブユニットのcDNA解析
Analysis of cDNA CIones for Antigen B Subunits from Eo勿η06000πs鱗釘〃oo認砺ε
山野 公明 澤田 幸治
Kimiaki YAMANo and Yukiharu SAwADA
当所では現在，ヒトの学究性エキノコックス症（E症）
血清診断用として，実験的にコトンラットに感染増殖させ たE6伽ooo66鷹吻％♂認。α 画廊（Em）の幼虫組織（シス ト）から調製した粗抗原を用いている．そのため，ロット ごとの抗原性の変動は避けられない．そこで，感度や特異 性に優れ，E症の診断に有用な抗原の安定供給を目的とし て，Em組織から作製したcDNAファージライブラリー より抗原タンパク質を含む各種遺伝子のクローニングを 行った．また，組換え抗原タンパク質発現系を用いて組換
え抗原タンパク質の生産を試みているレ4）．このクローニ ングにより，E症患者血清（約40％）と反応し ），かつ単 包虫（Eg名α朋Zo∫％s：Eg）感染による病巣の包内液中にも 含まれる主要な抗原6）antigen BをコードするcDNAが得 られた．antigen Bは，分子量120 kDaのリポタンパク 質7＞で，その構造は8kDaの小さなサブユニットのポリ マーからなっている8）．今回，我々は2種類のantigen B サブユニットをコードするクローンcDNAの解析を行っ たので，その結果について報告する．
方 法
λTrip1EX 2ファージベクター（Clontech社）を用いて 作製したEmシスト（emc）由来のcDNAライブラリー
からランダムに192個のプラークを分離した1，4）．Cre発現 大腸菌BM 25．8（Clontech社）を用いてこれらのファー
ジクローンをpTriplEX 2プラスミドに変換した．さらに 大腸菌XL 1−Blueに導入してクローニングを行い，各ク ローンのプラスミドDNAをDNA自動分離装置PI−50 a
（クラボウ社）により調製した1）．なお，組換えられた cDNAの大きさは制限酵素E60RI及びX加1で切断した 後，アガロース・ゲル電気泳動により確認した．塩基配列 データの解析には，BigDye Terminator Cycle Sequenc−
ing Ready Reaction Prelnix（Applied Biosystems社）
を用いてGeneAmp PCR 2400（PerkinElmer社）で反応 させた．反応条件は，95℃10秒間の前処理後，95℃10秒 間，50QC 5秒間，60℃4分間とし，この反応を25サイク ル行った．サイクルシーケンス反応産物は，ABI PRISM
377シーケンサ（Applied Biosystems社）を用いて解析 した．得られた塩基配列データについて，ホモロジー検索 プログラムBLASTN 2．0．119）によりDDBJ／EMBL／
GeneBankに登録されているDNA塩基配列データと照合 した．塩基配列とアミノ酸配列データの解析にはGene
Works V 2．5．1（lnte／liGenetic社）を使用した．
結果及び考察
elncライブラリーからランダムに分離した192個のク ローンの塩基配列を比較・検索したところ，antigen Bの サブユニットタンパク質に関連する5個のクローンを確認 することができた10）．これらのクローンは塩基配列ホモロ ジーの比較から2種類に分けられた．その内訳は，クロー ン番号emc 100，114，124，143からなる4個のantigen Bsubunit−1（85アミノ酸残基）と， emc lO6のantigen Bsubunit−2（89アミノ酸残基）であった． antigen Bに はサブユニットが3種類あるとされているので11），そのう ちの2種類のサブユニットが得られたことになる．
4クローンのantigen B subunit−1塩基配列をFig．1に 示した．これらのクローンのDNAは5■末端付近の1塩 基と3〆末端の1〜4塩基に違いが認められるだけである
ことから，同じ遺伝子からの転写産物と考えられた．3 末端近傍にはポリA付加シグナル配列．（AATAAA）が認 められた．また，DNAデータバンク検索の結果， Egの antigen Bサブユニットをコードするゲノム遺伝子 AF I4381312）とcDNAクローンZ2633613）などと相同性 が高いことが明らかになった．Fig．2にはAF 143813，
Z26336， emc 124の塩基配列を示した．この図から，
emc 124とZ26336は5 末端及び3 末端領域の塩基配列 に高い相同性が認められた．また，emc 124とゲノム遺伝 子のクローンAF 143813との比較により，多包虫と単包 虫のantigen Bサブユニット遺伝子のエキソン・イントロ ン構造は同じであることが示された．さらに，これら3ク ローンのエキソン領域のアミノ酸配列を比較した．Fig．3 に示したように，AF 143813， Z 26336， emc 124のアミ ノ酸配列は高い相同性を示した．しかし，emc l24は他の
81一
emc 143 emc 124 emc 100 emc l l4
GG（＝T⊂GTGTG TGGGA（＝AATT TτGGGGA⊂AA（：TTCAATATG⊂GG丁T⊂TGC⊂ 50
■ ● ● ■ ● ● 巳 ■ ● ● ■ ● 6 ● ■ ● ● ● ■ ■ ■ ■ ■ ● 画 o 卿 ， o ■ ● 8 ■ 嘲 ● ● 9 願 ■ ■ ● ● … o ・ ． ■
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emc143
emc l24
emclOO
emc 114
TTCTTCT⊂GC T（：TGGCTCT⊂GTCTCATTCG TGGTGGTTAC TCAGGCTGAT 100
● ● ● 一 ● o ● ● ● ● ● ● ■ ● ● ● o o 暉 賜 ● ■ 6 0 0 ● ■ ■ o ● 幽 o 願 ● ● ● ● ● ● g o ● ● … ． ■ 置 ●
■ o ● o ● ■ ● o ● 曝 ● ● o ● o ● 働 0 8 ● ● ● ■ o ■ ■ ● 9 ● o ● ● o ● o ● o ・ ・ ● 騨 ■ 幽 鰯 ． ■ o o ・ ●
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emc 143 emc l24 emc 100 emc 114
GATGG丁CT⊂A CCTCGA⊂GTC GAGGAGTATG ATGAAAATGC TTGG⊂GAAAT 150
■ ● ■ ● ● ● 唖 ● ■ ● o ● ■ ● ， ● ■ 0 5 ■ ● ● 0 6 6 ● ■ ● ● ● ■ ■ ■ 願 巳 ● ● ● ● ● ● ● ● … ■ o ■ ●
● ● ● ● 願 ■ ● ■ 巳 ● ■ ● ● o ● ● ■ 隔 ● ● ● ● ■ o ■ ● ● ● ● ● o ● ● ● ● ● ● ． ・ 幽 ■ ■ o o 胴 願 ・ o o ・
● ■ 嘲 暉 o ● ● ● ● ■ ● ■ ■ ■ ■ 巳 o ● ● ● ■ ● 9 ■ g o ■ ■ ■ ■ 邑 o ■ ■ ■ ■ 嗣 嗣 ■ o ● ● ● … ■ ■ ■ ■
emc143
emc 124 emc 100 emc 114
GAAG 「ACT丁C TTTGAA（：G丁G AT（：（＝GTTGGG TCAGAAATTG GTTGA⊂⊂TAT 200
0 ● 願 ● ■ ● ■ o ● ● ■ ● 一 圏 o 謄 ● ● ● ● ■ ， ● ● ● ● ■ 嗣 ■ ● ● ● ● ■ ● ■ ■ 胴 願 ■ ■ 9 ● ・ 9 ● o 膠 ■ ●
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e皿c143 emc 124
emclOO emcl14
TAAAGGAAC丁GGAAGAAG丁G TTCCAGATGT TAAGGAAGAA GCTACGCACG 250
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● ● ■ ● o ■ ● ● ● 贋 o ● ● ● ● 暉 ● ■ ● o ■ ● ● ● ● ● o ● ● o ● ● ● ● 願 o ■ ● ■ ● o o ● o o 賢 ● ■ 幽 ●
● ● ■ ■ o 嗣 ■ ● o ■ ● ● ■ ■ 囑 ● o ● o ■ ● ■ 謄 ■ 唖 ■ 噛 ● ● ■ ■ ■ ■ ● ■ ● o ■ ■ ●
emc 143 emc l24 emc 100 emc l l4
G⊂ACTCAAGT⊂（＝⊂ACCT⊂AN AGAGTTGGTT GCTGAAGGTA AATAGAGGTG 300
・… @ 。・・・・・ ・・・・・・… G ・・・・・・・・・・ ・・・・・・・・・・ … 9・・・…
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emc 143 emc l24 emc 100 emc l l4
（：⊂AATACA⊂T GT⊂ATGTGA（＝TAGTCATAGA TTTTGCTCAA TAAACCACCT 350
− o ● ● ● ■ ■ 願 ■ ● o ● 鰯 ● ● 巳 o o 9 曹 ● 幽 ■ 隔 ■ ■ ■ ● o 幽 ■ ● ● ■ ● ● 騨 願 ■ ■ ● ● ● 9 ． 幽 ■ ● o o
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■ o ● 騨 o 巳 ● ・ ● ● 昌 ● 一 曝 5 ● ● ● ● ● ■ o o 畠 o ■ ■ ● ● o ● ■ ● ■ ● ● ■ 口 o ● ● ● ● ● ・ ． ● ■ ● o
㎝c143
emc 124 emc 100 emc l l4
A⊂TTTATCT⊂T丁
。・・・・… @ T一 一一
・… @ 。・。・⊂一 一一
・・・・・… @ T⊂T一
362 359 359 361
Fig，1 Nucleotide Sequences of cDNA CIones fromεcわ1ηococcσs mσ1オ〃ocω∂rfs Cyst（emc）Homo「ogous to Antigen B Subunit−1
2つの遺伝子に比べてN末端に2残基多いアミノ酸をコー ドしていた．この2残基には翻訳開始に関わるメチオニン が存在していることから，AF143813とZ26336はアミノ 酸2残基分が欠失している可能性が示唆された．従って今 回，我々がクローニングしたemc 124等の4クローンの cDNAは， Em antigen B subunit−1の全長アミノ酸配列
をコードしていると考えられる．
一方，emc 106は塩基配列の比較・検索により単包虫の antigen B subunit−2をコードするU1500114）やAF 252859（未発表データ）と高い相同性を示すことが認めら れた．Fig．4には3クローンのアミノ酸配列を示した．
emc 106のアミノ酸配列はAF 252859に極めてよく類似 していたが，emc 106ではN末端のメチオニンからバリン までの17残基が欠失していた．Kyte−Doolittle法15＞によ りタンパク質の親水性・疎水性解析を行ったところ，この アミノ酸欠失領域は極めて高い疎水性を持つことが明らか になった（Fig．5）．先に示したantigen B subunit−1につ
いてもN末端の17アミノ酸残基は高い疎水性領域であ
る16＞ことが明らかにされている．antigen B subunit−1と 2にとって，N末端の疎水性領域は抗原としての機能発 現に重要な役割を持っていると思われる．つまり，
antigen B subunit−1及び一2はN末端の疎水性領域を利用
一82一
●
AF143813！eggene 一一一一一一一一一一 一一一一一一一一一一 一一一一一一一一一一 一一一一一一一一一一 一一T．TTCTGCA 8 Z26336／eg cDNA 一一一一一一一一一 一一一一一一一一一一 一一一一一一一一一一 一一一一一一一一一一 一一・・・・… 塵 8
emc124 GG（： 「CGTGTG TGGGACAATT TTGGGGACAA⊂TTCAATATG CGG・一・・。・（： 50
AFI43813！eggene TGCTT⊂TCGC TCTGGCT⊂T⊂GTCTCA丁TCG TGGTGGTTAC． TCAGGCGTAG 58
Z26336／eg cDNA ・… 。・・・・・ ・・… 。。・… 。… 一・… 。… 。一一・・・ ・… 。・一一一一 54 emc 124 ・T・・・… 6・ ・・・・・・・・・・ ・・・・・・・・・… 5・・・・・・・ ・・・… 一一一一 96
AFI43813／eggene GT（＝A⊂A⊂TAC C（＝TC（：CTCAT （＝TCCACCTCA T．TCACGCT⊂G CATTTG．CCAC 108
Z26336／eg cDNA 一一一一一一一一一一 一一一一一一一一一一 一一一一一一一一一 一一一一一一一一一一 〒一一一一一一一一一 54 emc 124 一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一 一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一 96
AFI438131egg㎝e T（＝TCTTC（＝T（： TTCTTCTTAT 國「TTTCTTCTT CCATTTAGTG ATGATGGCCT 158
Z26336／eg cDNA 一一一一一一一一一一 一一一一一一一一一一 一一一一一一一一一 一一一一一一一一・・ ・・・・… 。・・ 66 emc124 一一一一一一一一一 一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一一・・。・・・… oT 108
AFI438131eggene CACCT（＝GA（：G T（＝GAGGAG丁G TGATGAAAAT GTTTGGCGAA GTGAAGTACT 208
Z26336／eg cDNA T・・・… 一・ ・・… 一・・・ ・・・・… ロ・ 。A・・・・・… CG・・ ・・ o 116 emc 124 ・・・… 。・… u・・。… A ・・・・・・・… 。C・・・・・… A・・日。・。o 158
AFI43813たgg㎝e TCTTCGAACG TGATC（：GTTG GGTCAGAAAG TGGTTGACCT CTTAAAGGAA 258
Z26336！eg cDNA ・・・・・・・・・・ ・… 。・。・・・ … 一。・・・・ ・・… 。・… 一・・・・・… 166 emc 124 ・… T・・。巳・ ・・… 巳5。・・ ・・・・・・… T 9・・。・邑・… A・・。・・ 邑． 208
AF143813〆eggene （＝TGGAAGAAG TGTT（＝CAGTT GTTGAGGAAG AAGCTACG⊂A TGGCA⊂丁CAG 308
Z263361eg cDNA ・・・・・・・・・・ ・・・… 。・・・ ・・・・・・・・… 。・・・・・… C・・・… T・A216 emc 124 … 。・・。・・・・・・・・… A・ … A・・・・・・・・・・・・・… ⊂・・・・・… A 258
AF143813！egg㎝e GTCCCA⊂CTC AGAGGGTTGA TTG（＝TGAAGG TGAATAGAGG TG⊂⊂AA丁ACA 358
Z26336！eg cDNA ・・・・・・・・・・ ・… A。… G ・・・・・… 。・ ・A・・。・・・・・ ・・・・・・・… 266 emc124 圏 ・・一・・・・・… A・… G u・・・・・・… A・・・・・・・・ ・・・・… o 308 AFI43813／eggene ⊂TGTCATGTG ACTAGTCATA GATTTTG⊂．丁C 」一一一一一一一一一 一一一一一一一一一一 388 Z263361egcDNA ・・。・・・・・・・ ・・・・・・… 。 。・… 一… AATAAACCAT CTACTTTATC 316 emc124 ・・・・・・・・・・ ・・・・・・・・・・ ・・・・・・・… AATAAACCAC CTACTTTATC 358
AF 1438131eg gene 一一一一一一一一一一 一一一一一一 388 Z26336／egcDNA TC 「AAAAAAA AAAAAD 332
emc124 T一一一一一一一一一 一｝一一一一 359
Fig、2 Alignment of Nucleotide Sequences of Antigen B Subunit−1 Clones
AF143．813：E6屠％oooo6．粥g紹η厩os％s antigen B subunit−1 gene， Z26．336：Ec雇η060c6π3 gπ襯％♂osκs antigen B subunit−1 cDNA
AF143813！aaseq 一一FCMLLALA LVSFVVVTQA DDGLTSTSRS VMKMFGEVKY
emc 124／aa seq MR・。L・・・・・… 。・… 一 ・… 。・・一・・M… L・・M・。
Z26336／aa se（1 一一・・・・・・・・ ・・・・・・・・・・ ・・・・・・・・・・ ・… T・・R・・
AFI438131aaseq VVDLLKELEE VFqLLRKKLR MALRSHLRGL 工AEGE
emc l24／aa seq L・・・・・・・・・… M・… 。。T・・K・… E。V・…
Z26336／aa seq 。・・・・・・・・・ ・・・… 。… T・・K・… E・ V・。・・
FFERDPLGQK 48
… 5・・・… 50 麿9・・・・・… @ 48
83 85 83
Fig．3 Alignment of Deduced Amino Acid Sequences of Antigen B Subunit−1
AF143813＝Eo雇％oooσ6粥g鵤7癩♂o∫麗s antigen B subunit−1 gene， Z26336：E漉初ooocα6∫g昭照Josz4s antigen B subunit−1 cDNA
一83一
U15001／aa seq emc 106／aa seq AF252859／aa seq
MRTYILLSLA LVAFVAVVQA KDEPKAHMGQ VVKKRWGELRDFFRNDPLGQ
一一一一一一一一一一 @一一一一一一一・… A。・ERCKC− L工MRKLS工・・ ・… S・・…
一一・・ o @・・・・・・・・… A・・ER．CKC−LIMRKL・工・・ ・… S・・…
50 32 49
U15001／aa seq emc 106／aa seq AF252859／aa seq
RLVALGNDLT A工CQKLQLK工REVLKKYVKN LVEEKDDDSK
K・巳… R… 。… 5・H・・VH・・・・・… D・L。。DE・・L・
K・・… R・… 巳・… 。・・VH・・・… 。・D ・L・・・・・…
90 72 89
Fig．4 Alignment of Deduced Amino Acid Sequences of Antigen B Subunit−2
U15001＝Eoん勿ooooo％s gηπ％Zo脇s antigen B subunit−2 cDNA， AF2528591 Eσ忽％ooooo％s gπ魏％10sπ∫antigen B subunit−2 cDNA
320−
240−
160−
80−
0一
一80一 一160一 一240一 一320一
A， 320−
240−
160−
80−
0一
一80一 一160『
一240一 一320一
一
B
一 一
一 一 一 一
