A b s f r a c t :   E l e c t r o p h y s i o l o g i c a l  and m e c h a n i c a l  e f f e c t s  and a l t e r a t i o n  o f  i n t r a c e l l u l a r   Ca 2 +  c o n c e n t r a t i o n  i n  c a n i n e  v e n t r i c u l a r  mus c 1 e  by a m i

奈医誌. ( J .   N  a r a  M e d .  A s s . )   4 4 ，  203~210 ， 1 9 9 3   ( 2 0 3 )   CARDIOPROTECTIVE ACTION OF  AMILORIDE ，  A POTASSIUM SPARING 

DIURETIC DRUG ，  IN CANINE VENTRICULAR MUSCLE  HIROYASU SATOH ，  KAZUHIKO NARIO 

ITARU NARUSHIMA and TOSHIKATSU NAKASHIMA  De ρa r t m e n t  0 1  P h a r m a c o l o g y .  Nara M e d i c a l  U n i v e r s i 固 か

R e c e i v e d  J u n e  1 8 ，  1 9 9 3  

A b s f r a c t :   E l e c t r o p h y s i o l o g i c a l  and m e c h a n i c a l  e f f e c t s  and a l t e r a t i o n  o f  i n t r a c e l l u l a r   Ca ² +  c o n c e n t r a t i o n  i n  c a n i n e  v e n t r i c u l a r  mus c 1 e  by a m i l o r i d e ，  a  p o t a s s i u m  s p a r i n g  d i u r e t i c   d r u g ，  were examined ，  u s i n g  c o n v e n t i o n a l  m i c r o e l e c t r o d e  t e c h n i q u e  and f u r a ‑ 2  Ca ²

s e n s i . t i v e  f 1 u o r e s c e n t  d y e .   Am i 1 0 r i d e  (50μM) d e p r e s s e d  t h e  a c t i o n  p o t e n t i a l  a m p l i t u d e  by 8 . 2   d :   1 .   4  %  ( n  = 8 ，  P  <  0 . 0 5 )  and t h e  maximum r a t e  o f  d e p o l a r i z a t i o n  by 1 6 . 2 士 2 . 0 %  (n= 8 ，  P  <  0 . 0 1 ) .   I n  a d d i t i o n .   t h e  a c t i o n  p o t e n t i a l  d u r a t i o n  was p r o l o n g e d  by 2 6 . 7 土 3 . 4 %  ( n ^ニ 6 ， P<0.05) a t  30μM ，  and t h e  r e s t i n g  p o t e n t i a l  was d e p o l a r i z e d  by 1 1 . 8 : t   1 .  7  %  ( n  = 6  ，  P  < 

0 . 0 5 )  a t  0 . 5  m M   a m i l o r i d e .   I n  c o n t r a s t ，  a m i l o r i d e  ( 0 . 5  t o  1  mM) s i g n i f i c a n t l y  i n c r e a s e d  t h e   c o n t r a c t i l e  f o r c e  by 8  t o  3 0   %  ( n ニ 8   ， ) b u t  t e n d e d  t o  d e c r e a s e  i t   a t  l o w e r  c o n c e n t r a t i o n s  ( 3 0   μ M   t o  0 . 1  mM).  The p o s i t i v e  i n o t r o p i c  e f f e c t  was n o t  a f f e c t e d  by p r o p r a n o l o l  (0.1μM) ，  a β ‑ a d r e n o c e p t o r  b l o c k e r .   I n   f u r a ‑ 2   l o a d e d  v e n t r i c u l a r   myocytes ，  a m i l o r i d e   c 1   mM)  i n i t i a l l y  e l e v a t e d  c e l l u l a r  Ca ² +  l e v e l  ( [ C a ] l )  by 2 4 . 5 : t 2 . 9   %  (n= 6 ，  P<O.0 1 ) ，   and d u r i n g   t h e  a p p l i c a t i o n ，  t h e   [Cal l e v e l  d e c 1 i n e d .   These r e s u l t s  i n d i c a t e  t h a t  a m i l o r i d e  p o s s e s s e s   complex c a r d i a c   ( p r o t e c t i v e )   a c t i o n s :   e l e c t r i c a l   i n h i b i t o r y  and m e c h a n i c a l  s t i m u l a t o r y   a c t i o n s ，  accompanied w i t h  t h e  e l e v a t i o n  o f  c e l l u l a r  Ca ²⁺  c o n c e n t r a t i o n .  

Index Terms 

a m i l o r i d e ，  p o t a s s i u m  s p a r i n g  d i u r e t i c  d r u g ，  a c t i o n  p o t e n t i a l s ，  c o n t r a c t i 1 e  f o r c e ，  i n t r a c e l l u l a r   Ca ²⁺  c o n c e n t r a t i o n  

INTRODUCTION 

A m i l o r i d e ，  a  p o t a s s i u m ‑ s p a r i n g  d i u r e t i c  d r u g ，  p o s s e s s e s  many a c t i o n s  on c a r d i a c  and smooth  mus c 1 e s ，  a s  w e l l  a s  on r e n a l  t u b u l e .   I n c a r d i a c  mus c 1 e s ，  a m i l o r i d e  p r o l o n g s  t h e  a c t i o n  p o t e n t i a l   d u r a t i o n  (APD) ，  and r e d u c e s  t h e  a m p l i t u d e  o f  a c t i o n  p o t e n t i a l  (APA) and t h e  max ^討 imumr ^悶 a t ^臼 e  O

ぱ fr i s e  0 ぱ fdepo 叶 l 町 a r i 包 z 此 a t i o n(V m

a x ρ ) ^{1 )} ， 2 

Am i 1 0 r i d e   c a u s e s  a p o s i t i v e   o r   n e g a t i v e  i n o t r o p i c   e f f e c t ，  d e p e n d i n g  on e x t r a c e l l u l a r   Ca 2+ 

c o n c e n t r a t i o n ⁴⁾

) . I n  r a b b i t  s i n o ‑ a t r i a l  (SA) node c e l l s

a m i l o r i d e  i n h i b i t e d  t h e  Ca ²⁺  c u r r e n t   ( I c a   ， ) t h e   d e l a y e d  r e c t i f y i n g  K+ c u r r e n t   ( I K) ，  and t h e   h y p e r p o l a r i z a t i o n ‑ a c t i v a t e d   i n w a r d   c u r r e n t   ( I h)4).  I n  a d d i t i o n ，  i t   h a s  been r e p o r t e d  t h a t  am i 1 0 r i d e  h a s  i n h i b i t o r y  a c t i o n s  on Na ^L  H

andNa ^L Ca ²

exchanges 7 ) ， 8 ) ， 9 )  

The aim o f  t h e  p r e s e n t  s t u d y  i s   t o  examine e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l  and m e c h a n i c a l  e f f e c t s  o f  

a m i l o r i d e  on c a n i n e  v e n t r i c u l a r  mus c 1 e .   The e f f e c t  on t h e  c o n t r a c t i l e  f o r c e  i s   complex and i t s  

mechanism i s   s t i l 1   un c 1 e a r .   Thus ，  t o  e l u c i d a t e  t h e  mechqnismunderlying t h e  p o s i t i v e  i n o t r o p i c  

e f f e c t ，  change i n  i n t r a c e l l u l a r  Ca ² +  c o n c e n t r a t i o n  ([Cal) was measured u s i n g  f u r a ‑ 2  Ca ² + 

( 2 0 4 )   H.  S a t o h ，  e t   a l .   s e n s i t i v e   J l u o r e s c e n t  d y e .  

METHODS  E l e c t r i c a l  and mechanical e x p e r i m e n t s  

Mongrel d o g s  o f  e i t h e r  s e x ，  w e i g h i n g  7 ‑ 1 0  kg ，  were u s e d .   The p r e p a r a t i o n s  were made a s   r e p o r t e d  p r e v i o u s l y 4 ) ， l O ) .   I n  b r i e f ，  r i g h t  v e n t r i c u l a r  m u s c l e s  C 2 ‑ 3  m m   i n  d i a m e t e r )  o b t a i n e d  from  dog h e a r t  were p l a c e d  i n  an o r g a n  b a t h  and s u p e r f u s e d  w i t h  Tyrode s o l u t i o n  a t  a  t e m p e r a t u r e   o f   3 6 ' C .   One end o f  t h e  p r e p a r a t i o n  was f i x e d  on t h e  p a r a f f i n  b a s e  o f  t h e  b a t h ，  and t h e  o t h e r   end was c o n n e c t e d  t o   a  f o r c e  d i s p l a c e m e n t  t r a n s d u c e r  CNihon Kohden SB‑1  T) u s i n g  a  f i n e   n y l o n  t h r e a d .   F i e l d  s t i m u l a t i o n  a t  f r e q u e n c i e s  o f  6 0  beats/min w i t h  p u l s e s  o f  1 ‑ 2  ms d u r a t i o n   and t w i c e  t h e  v o l t a g e  t h r e s h o l d  i n  s t r e n g t h  was u s e d .   The a c t i o n  p o t e n t i a l ，  r e c o r d e d  by u s i n g   a  s t a n d a r d  g l a s s  m i c r o e l e c t r o d e  t e c h n i q u e ，  and t h e  c o n t r a c t i l e  f o r c e  were r e g i s t e r e d  on a n   o s c i 1 l o s c o p e   CNihon Kohden VC‑ l 1 )   ，  and p h o t o g r a p h e d   CNihon Kohden R L G ‑ 6 2 0 1 ) .   The  Tyrode s o l u t i o n  CN  a C l  1 3 7 ，  KCl 4 . 0 ，  MgC1

1 . 0 ，  CaC1

1 . 8 ，  N  aH

P0 4  0 . 4 ，  N  aHC0

1 2 . 0  and  g l u c o s e  5 . 0  i n  mM) was b u b b l e d  w i t h  9 5   %  O 2  and 5  %  CO 2.  The pH wasadjusted t o  7 . 4  w i t h   NaOH. Drug u s e d  was a m i l o r i d e  h y d r o c h l o r i d e  d i h y d r a t e  CMerk ，  Sharp and Dohme R e s e a r c h   L a b . ，  Munich ，  Germany) 

S i n c e  s o l u t i o n s  i n  t h e  b a t h  were exchanged w i t h i n  1 ‑ 2  min and t h e  e f f e c t s  o f  d r u g s  r e a c h e d   a  c o m p l e t e l y  s t e a d y  s t a t e  w i t h i n  5 ‑ 6  min ，  t h e  d a t a  were o b t a i n e d  a b o u t  7 ‑ 8  min a f t e r  c h a n g i n g   t o  t h e  new s o l u t i o n .   V a l u e s  were r e p r e s e n t e d  a s  mean i :  SEM. D i f f e r e n c e s  o f  t h e  mean v a l u e s   were a n a l y s e d  by S t u d e n t   t ‑ t e s t   f o r  p a i r e d  d a t a ，  and P  <  0  .  0 5  was c o n s i d e r e d  s i g n i f i c a n t .   Measurement o f  c e l l u l a r  Ca ² +  c o n c e n t r a t i o n  

I s o l a t e d  s i n g l e  v e n t r i c u l a r  myocytes by c o l l a g e n a s e  CType 1 ，  Sigma C h e m i c a l  C o . ，  MO ，  U .   S .   A . )   were i n c u b a t e d  for30 min w i t h  t h e  a c e t o x y ‑ m e t h y l ‑ e s t e r  o f  0.3μM f u r a ‑ 2  C f u r a ‑ 2 /   AM)  (D o j i n  C h e m i c a l  C o . ，  Kumamoto ，  J  a p a n )  a t   3 0 ' C .   The s h o r t  l o a d i n g  p e r i o d  was t o  r e d u c e   t h e  f l u o r e s c e n c e  c o n t r i b u t i o n  o f  t h e  s a r c o p l a s m i c  r e t i c u l u m  CSR) CW i 1 l iams e t  a   ， . l 1 9 8 7 ) .   The  [ C a J  

i n   c e l l s   l o a d e d  w i t h  f u r a ‑ 2  was m o n i t o r e d  a s   a  c h a n g e  i n   t h e  r a t i o   o f  f l u o r e s c e n t   i n t e n s i t i e s   a t   380‑nm and 340‑nm e x c i t a t i o n s

The f l u o r e s c e n c e  was q u a n t i f i e d  w i t h  a  s i l i c o n

i n t e n s i f i e dt a r g e t  C S I T )  camera and a  d i g i t a l  i m a g i n g  s y s t e m  CHamamatsu P h o t o n i c s   Argus 1 0 0 ，  Hamamatsu ，  J  a p a n ) .  

RESULTS  E f f e c t s  on t h e  a c t i o n  p o t e n t i a l s  and t h e  c o n t r a c t i l e  f o r c e  

E l e c t r o p h y s i o l o g i c a l  and m e c h a n i c a l  e f f e c t s  o f  a m i l o r i d e  were e x a m i n e d .   F i g u r e  1  A shows 

t h e  a c t i o n  p o t e n t i a l s ，  t h e  maximum r a t e  o f  d e p o l a r i z a t i o n  CV  max) ，  and t h e  c o n t r a c t i l e  f o r c e .  

A m i l o r i d e   C O . 1  t o  1  mM) p r o l o n g e d   t h e   a c t i o n   p o t e n t i a l   d u r a t i o n   a t   7 5   %  r e p o l a r i z a t i o n  

CAPD 75)  and d e p r e s s e d  t h e  V  max ，  s i g n i f i c a n t l y  C F i g .   1  B ‑ D ) .   The e f f e c t s  were c o n c e n t r a t i o n ‑

d e p e n d e n t .   The a v e r a g e  v a l u e s   a r e  summarized i n   Table 1 .   The c o n t r a c t i l e   f o r c e   was 

d e c r e a s e d  a t  0 . 1  m M   o r  l o w e r ，  whereas i t   was i n c r e a s e d  a t  0 . 5  and 1  mM. The i n c r e a s e  was 

n o t  m o d i f i e d  by p r o p r a n o l o l  CO.1μM).  The r e s t i n g  p o t e n t i a l  CRP) was s i g n i f i c a n t l y  d e p o l a r ‑

C a r d i o p r o t

c t i o nby a m i l o r i d e   ( 2 0 5 )  

200  msec 

O...‑...J 

Control 

A  0.1 

B 

v  m 

n u  

EM  

︑ ︐

︐

E a a ‑ E E a a J

J ¥ ¥

一 / ¥ ] 0 向

C  0.5  o  ^{1 m M}  

一/大 ノ¥ ー

」一

F i g .   l .   E f f e c t s  o f  a m i l o r i d

ont h e  a c t i o n  p o t e n t i a l s  and t h e  c o n t r a c t i l e  f o r c e  i n  c a n i n e  v

n t r i c u l a r mus c 1 e .   Each p a n e l  shows theaction p o t e n t i a l ，  t h e  c o n t r a c t i l e  f o r c e ，  and t h e  maximum r a t e   o f  d e p o l a r i z a t i o n .   A: Contro l .   B‑D

Amiloridea p p l i c a t i o n s  ( 0 . 1 ，  0 . 5  and 1  mM). B r i e f  l i n e   b e f o r e  t h e  a c t i o n  p o t e n t i a l  t r a c e  r e p r e s e n t s  z e r o  m  V 

Table l .   Amiloride a c t i o n s  on t h e  a c t i o n  p o t e n t i a l  parameters and t h e  c o n t r a c t i l e  f o r c e   i n  c a n i n e  v e n t r i c u l a r  mus c 1 e 

RP  APA  V max  APD 75  T 

日

( r n V )   ( r n V )   (V  / s )   ( r n s )   ( r n g )   C o n t r o l   8  8 3 士 2 1 1 2 : t 5  2 1 0 士 1 2 1 8 5 土 6 5 2 土 3 A r n i l o r i d e  

5μM  6  8 2 士 2 1 0 8 土 3 1 9 9 士 6 2 0 2 士 5 5 2 土 6 30μM  6  8 1 土 1 1 0 6 士 4 1 8 5 土 4* 2 3 5 土 7* 5 0 : t 4   50μM  8  8 2 土 2 1 0 3 土 2* 1 7 6 土 6**  2 3 9 士 7* 4 9 土 6 O.lrnM  8  ‑81 士 2 1 0 0 士 6

1 6 8 士 10**  2 4 6 土 5**  5 1 土 3 0.5rnM  8  7 8 土1* 9 6 土 3* 1 5 3 土 9**  2 6 5 土 8**  *  5 6 士 5*

lrnM  8  7 6 : t l  *  9 2 : t 4  *  *  1 0 9 士 1 1* *  3 8 9 土 14**  6 8 土 4** 

V a l u e s  r e p r e s e n t  r n e a n s 士 SEM. * :  P く 0 . 0 5 ， *  * :  P<O.Ol ，  *  *  * ・ p く 0 . 0 0 1 ， w i t h  r e s p e c t  t o  c o n t r o l  value.RP :  r e s t i n g  

p o t e n t i a l ，  AP  A :  a c t i o n  p o t e n t i a l  a r n p l i t u d e ，  V  max :  r n a x i r n u r n  r a t e  o f  d e p o l a r i z a t i o n ，  APD  7 5   :  a c t i o n  p o t

n t i a ld u r a t i o n  

( 7 5  % r e p o l a r i z a t i o n ) ，  T  :  c o n t r a c t i l e  f o r c e  

( 2 0 6 )  

A  R a t i o   0 . 6  

Ami 刷 de1mM  l 

! ・ . . . b

I ̲ . ‑

H .  S a t o h ，  e t  a l .  

. 

・ ・

B 

i j j l  

O . 3 i . . . .   • ・ . ^d 

o 

o 

. . .

  _a  . ・ ・ ・ . ・ ・ ・ ・ ・ . ・ . . . _{.   . .} . ・

R A T I O  

8 . 5 8   8 . 4 8   8 . 2 9   8 . 1 9   1 8 5  

c 

10 

R A T I O  

8 . 5 8  

日 . 4 8

日 目 2 9 20min  8 . 1 9  

2 日 4 R A T J O  

8 . 5 8 1   8 . 4 8 i   s . 2 9 i  

日 . 1 9 イ 日 中

i 回

b 

d 

F i g .   2 .   C h a n g e  i n   t h

c y t o s o l i cC a ² +  c o n c e n t r a t i o n  i n   a  c a n i n

v e n t r i c u l a rm y o c y t e

R a t i oo f   f l u o r

s c e n c e i n t e n s i t i e s   o f   t h e   c y t o p l a s m  m e a s u r e d  a t   3 8 0 ‑ n m  a n d  3 4 0 ‑ n m

x c i t a t i o n sr e p r e s e n t s  i n   f u r a ‑ 2   ( a   C a ' + ‑ s e n s i t i v e  f l u o r e s c e n t  d y e ) ‑ l o a d e d  s i n g l e  c a r d i o m y o c y t e .  A: R a t i o  o f  3 8 0 / 3 4 0  nm  i n  t h e  a b s e n c e  a n d   p r e s e n c

o fa m i l o r i d

mM).  B:  S t e r e o g r a p h s  o f  i n t r a c

l l u l a rCa

c o n c e n t r a t i o n  b e f o r e  ( a ) ，  d u r i n g   ( b  a n d  c )   a n d  a f t e r  ( d )   a m i l o r i d 巴 a p p l i c a t i o n

mM) ，  a s  i n d i c a t e d  b y  t r i a n g l e s  i n  p a n

lA

i z e d  a t  o v e r  0 . 5  mM. 

E f f e c t s  on c e l l u l a r  Ca  ²

c o n c e n t r a t i o n

Time‑dependent change i n   [ C a ]  

d u r i n g  exposure t o  a m i l o r i d e  was examined u s i n g  f u r a ‑ 2   f l u o r e s c e n t  d y e .   Amiloride (1 mM)  i n i t i a l l y  e l e v a t e d  [ C a ]   1  l e v e l ，  b u t  t h e n  t h e   [ C a ]  j  d e c r e a s e d   a l m o s t  t o  c o n t r o l  v a l u e ，  a s  shown i n  F i g .   2 A .   The average i n c r e a s e d  v a l u e s  were 7 . 4 土 2 . 6% 

(n= 5 ，  P>0.05) a t  0 . 1  m M ，  1 1 . 8 土 3 . 6%(n= 5 ，  P<0.05) a t  0 . 5  m M ，  and 2 4 . 5 士 2 . 9%(n ニ 5 ， P<O.0 1 )   a t   1  mM.  The secondary d e c r e a s e  i n   [ C a ] j  d u r i n g  a m i l o r i d e  a p p l i c a t i o n   ( 1   mM)  was 6 . 1 : t 3 . 2  %(n= 5 ，  P>0.05) ，  a s  compared with c o n t r 叶 v a l u e . A f t e r  washing o u t ，  t h e  

[Cal l e v e l  e l e v a t e d  a g a i n  ( r e b o u n d ) .   The rebound i n c r e a s e  was 5 6 . 6 : t   7 . 1  % ( n  = 4 ，  P  < 

0 . 0 1 ) .   Then ，  t h e   [ C a ]   1  l e v e l  d e c l i n e d  t o  c o n t r o l  v a l u e  a b o u t  1 5  min a f t e r  t h e  s t a r t  o f  wash ou t .   F i g u r e  2B shows t h e  s t e r e o g r a p h s  from a c e l l   o f  d i f f e r e n t  s t a g e s  b e f o r e ，  d u r i n g  and a f t e r   a m i l o r i d e   ( 1   mM) a p p l i c a t i o n .  

DISCUSSION 

The p r e s e n t  s t u d y  i n  c a n i n e  v e n t r i c u l a r  muscle showed t h a t  a m i l o r i d e   ( 1 )   i n h i b i t e d  t h e  V  max 

and d e p r e s s e d  t h e  APA ，  ( 2 )  d e p o l a r i z e d  t h e  RP ，  ( 3 )  produced a  profound p r o l o n g a t i o n  o f  APD ， 

C a r d i o p r o t e c t i o n  b y  a m i l o r i d

( 2 0 7 )  

and  ( 4 )   d e c r e a s e d  t h e  c o n t r a c t i l e  f o r c e  a t  low c o n c e n t r a t i o n s ，  b u t  i n c r e a s e d  i t   a t  h i g h  c o n c e n ‑ t r a t i o n s ，  and  ( 5 )   t h a t  i n  i s o l a t e d  s i n g l e  v e n t r i c u l a r  m u s c l e  c e l l s ，  a m i l o r i d e  a c t u a l l y  e l e v a t e d  t h e  

[ C a J !  l e v e l .  

A m i l o r i d e  i s   a  w i d e l y  u s e d  p o t a s s i u m

s p a r i n g  d i u r e t i c  d r u g ，  and a l s o  h a s  v a r i o u s  a c t i o n s  on  c a r d i a c  m u s c l e s4 ) ^， 5 ) ^， 1 2 ) ^， 1 3 ) ^， 1 4 ) .   As mentioned i n  t h e  I n t r o d u c t i o n ^，  a m i l o r i d e  c o u l d  p r o d u c e  p o t e n t   a n t i a r r h y t h m i c  a c t i o n s  d u e  t o  I N a  i n h i b i t i o n  ( c l a s s  I  a n t i a r r h y t h m i c  a c t i o n )  and APD p r o l o n g a ‑ t i o n   ( c l a s s  I I I   a n t i a r r h y t h m i c  a c t i o n ) ，  and d e p r e s s  s p o n t a n e o u s  a c t i v i t y  d u e  t o   d e c r e a s e  i n   pacemaker c u r r e n t s   ( c l a s s   V a n t i a r r h y t h m i c   a c t i o n )  1 5 ) ， 1 6 ) .   The e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l   and  m e c h a n i c a l  a c t i o n s  o f  a m i l o r i d e  on c a r d i a c  m u s c l e s ，  which i s   a  c a r d i o p r o t e c t i v e  a c t i o n ，  a r e   d i s c u s s e d  b e l o w .  

On t h e  c a r d i o p r o t e c t i v e  a c t i o n s  

A m i l o r i d e  h a s  been r e p o r t e d  t o  r e d u c e  d i g i t a l i s  s e n s i t i v i t y  o f  t h e  h e a r t  by a  d i r e c t  c a r d i a c   a c t i o n 2 ) ， 1 7 )   a s  w e l l  a s  by a l t e r i n g  t h e  p h a r m a c o k i n e t i c s  o f  d i g o x i n1 8 ) ， 1 9 ) .   The p r o t e c t i o n  f o r  h e a r t   muscle a g a i n s t  t o x i c  e f f e c t s  i s   d u e  t o  t h e  r e d u c t i o n  ( o r  i n h i b i t i o n )  o f  c e l l u l a r  Ca2 +  o v e r l o a d  v i a   NaLK+ pump i n h i b i t i o n  i n d u c e d  by d i g i t a l i s2 0) ， 2 1 ) ， 2 2 ) ，  and t h e r e b y  t h e  o n s e t s  o f  rhythm d i s t u r ‑ b a n c e s  and c a r d i a c  a r r e s t  would be d e l a y e d  o r  e l i m i n a t e d .   The p r o t e c t i v e  a c t i o n s  would r e s u l t   from t h e  I N a   ( o r  V  m a x )  i n h i b i t i o n  and t h e  p r o f o u n d  APD  p r o l o n g a t i o n .   The I N a   i n h i b i t i o n  c o u l d   n o t  o n l y  d e p r e s s  t h e  e x c i t a b i l i t y  o f  t h e  membrane ，  b u t  a l s o  i n d i r e c t l y  d e c r e a s e  t h e   [ C a J !  l e v e l   t h r o u g h  NaLCa 2+  exchange2 0) ， 2 1 ) ， 2 3 ) .   On t h e  o t h e r  hand ，  t h e  APD p r o l o n g a t i o n  s i m u l t a n e o u s l y   accompanies a  l e n g t h e n i n g  o f  t h e  r e f r a c t o r y  p e r i o d ，  r e s u l t i n g  i n  i n h i b i t i o n  and a b o l i s h m e n t  o f   premature b e a t  and r e ‑ e n t r y  a r r h y t h m i a .   S i n c e  a m i l o r i d e  i n h i b i t s  I c a  and I h   c u r r e n t s  i n  t h e  SA  node c e l l s 4 ) ，  a m i l o r i d e  h a s  c l a s s   IV and V a n t i a r r h y t h m i c   a c t i o n s .   I n   a d d i t i o n ，  a m i l o r i d e   d e p o l a r i z e s  t h e  RP  d u e  t o  d e c r e a s e  i n  K+ c o n d u c t a n c e ，  which may c o n t r i b u t e  t o  t h e  d e p r e s s i o n s   i n  t h e  Na+ and Ca ²⁺  c h a n n e l  a c t i v i t i e s .  

On t h e  i n o t r o p i c  a c t i o n  

A m i l o r i d e  a t  low c o n c e n t r a t i o n s  d e c r e a s e d  t h e  c o n t r a c t i l e  f o r c e ，  b u t  a t  h i g h  c o n c e n t r a t i o n s   i n c r e a s e d  i t .   The b i p h a s i c  i n o t r o p i c  e f f e c t  o f  a m i l o r i d e  h a s  a l r e a d y  been shown i n  g u i n e a ‑ p i g   p a p i l l a r y  and r a t  l e f t   a t r i a l  m u s c l e s6 ) ， 1 2 ) ，  and i t   might be d e p e n d e n t  on [Cal l e v e .   l At h i g h   e x t r a c e l l u l a r  Ca  2

c o n c e n t r a t i o n( [  C a J  0 ) ，  a m i l o r i d e  enhanced t h e  c o n t r a c t i l e  f o r c e ，  whereas a t   low [ C a J o ，  a m i l o r i d e  d e c r e a s e d  i t .   The change i n  t h e  a m i l o r i d e  a c t i o n s  a t  d i f f e r e n t   [ C a J o  l e v e l   would be d e p e n d e n t  on [ C a J !  l e v e l .   The [ C a J  

l e v e l  would be r e g u l a t e d  by complex mechanisms  0 .   e .   NaLCa2 +  and NaLH

e x c h a n g e s ， and Ca2Lpump).  I n  t h e  p r e s e n t  e x p e r i m e n t s  ( [ C a J o   was  1 .  8  mM) ，  however ，  t h e  c o n t r a c t i l e  f o r c e  was n o t  s i g n i f i c a n t l y  d e c r e a s e d  a t  low c o n c e n t r a ‑ t i o n s  o f  a m i l o r i d e .   T h i s  s u g g e s t s  t h a t  i t   may be n o t  enough f o r  t h e  exchange s y s t e m s  t o  b e   a c t i v a t e d  a t  low c o n c e n t r a t i o n s .  

A m i l o r i d e  i n h i b i t s   V  m a x   and I N a   c u r r e n t 4 ) ， 2 4 ) ， 2 5 ) .   I n   SA node pacemaker c e l l s ，  a m i l o r i d e  

i n h i b i t e d  a l l  t h e  c u r r e n t s   ( I c a ，  I K '   and I h ) 4 ) .   These i n h i b i t i o n s  o f  i o n i c  c u r r e n t s  would p r o d u c e  

n e g a t i v e  i n o t r o p i c  e f f e c t .   The I N a   i n h i b i t i o n  i n d u c e d  by c l a s s   I  a n t i a r r h y t h m i c  d r u g s ，  l i k e  

l i d o c a i n e  o r  p r o c a i n a m i d e  and TTX ，  p r o d u c e s  t h e  n e g a t i v e  i n o t r o p i c  e f f e c t 2 0) ， 2 1 ) ， 2 6 ) .   D e c l i n e  o f  

c e l l u l a r  N  a  +  c o n c e n t r a t i o n  l e a d s  t o   a  d e c r e a s e  i n   [ C a J !   l e v e l   t h r o u g h  N  a  + ー Ca ²⁺ e x c h a n g e .  

( 2 0 8 )   H .  S a t o h 巴 ， ta .   l A l s o ，  t h e  I c a   i n h i b i t i o n  d e c r e a s e s  t h e  c o n t r a c t i 1 e  f o r c e 4)

)

On t h e  o t h e r  hand ，  a m i l o r i d e  a t  h i g h  c o n c e n t r a t i o n s  enhanced t h e  c o n t r a c t i l e  f o r c e .   S i n c e  t h e   p o s i t i v e  i n o t r o p i c  e f f e c t  was no mediated throughβadrenoceptor s t i m u l a t i o n ，  t h i s  might be  due t o  t h e  APD p r o l o n g a t i o n .   The p r o l o n g a t i o n  can enhance t h e  c o n t r a c t i l e  f o r c e 4) .   Actua l 1 y ，  a m i l o r i d e   i n c r e a s e d  t h e   [ C a ]   1  l e v e l ，  b u t  t r a n s i e n t l y   ( s e e   F i g .   2 ) .   A m i l o r i d e  c a u s e d  t h e   c o n c e n t r a t i o n ‑ d e p e n d e n t  p o s i t i v e  i n o t r o p i c  e f f e c t ，  b u t  t h e   [ C a ]  

was d e c r e a s e d  even d u r i n g  t h e   APD  p r o l o g a t i o n .   T h e r e f o r e ，  t h e s e  r e s u l t s  s u g g e s t  t h a t  t h e  p o s i t i v e  i n o t r o p i c  e f f e c t  may n o t  b e   due t o  t h e  APD p r o l o n g a t i o n .  

A m i l o r i d e  p o s s e s s e s  i n h i b i t o r y  a c t i o n s  on N  a

Ca2 +and N  aL  H+ exchanges 7) ， 9 ) ， 2 8 ) .   I n  c a r d i a c   muscle c e l 1 s ，  t h e s e  exchange s y s t e m s  and Ca2Lpump a r e  t h e  major mechanisms f o r   Ca 2+ 

e f f l u x2 9)   The pump h . a s  h i g h  a f f i n i t y  and low c a p a c i t y ，  whereas t h e  NaLCa 2+  exchange i s   a  low a f f i n i t y  and h i g h  c a p a c i t y  system f o r  r e g u l a t i o n  o f   [CaV 山 川 2 ) The d i r e c t i o n  and l e v e l   o f  o p e r a t i o n  o f  N  a +

Ca 2+  exchange a r e  d e t e r m i n e d  by t h e  e l e c t r o c h e m i c a l  g r a d i e n t  f o r  N  a  +  and  t h e  membrane p o t e n t i a F 3 ) ， 3 2 ) .  

During washing o u t ，  t h e  [ C a ]   1  l e v e l  e l e v a t e d  f u r t h e r  ( r e b o u n d ) ，  and f i n a l 1 y  r e v e r t e d  t o  c o n t r o l   l e v e   1 . I t   i s  c o n s i d e r e d  t h a t ，  when t h e  c e l 1 u l a r  h i g h  Ca 2+  c o n c e n t r a t i o n  i s  d e c r e a s e d  s u d d e n l y ，  t h e   d e p r e s s e d  uptake and r e l e a s e  o f  Ca 2+  d u r i n g  t h e  Ca2 +  o v e r l o a d  were t r a n s i e n t l y  p o t e n t i a t e d ，  and  were r e t u t n e d  t o  r e g u l a r  a c t i o n s2 0   . )

I n  t h e  p r e s e n t  e x p e r i m e n t s ，  t h e r e f o r e ，  t h e   [ C a ]  

l e v e l   would be e l e v a t e d  m a i n l y  by t h e   i n h i b i t i o n s  o f  exchange systems ，  a l t h o u g h  t h e  mechanism i s   s o  c o m p l e x .   At 1  m M ，  am i 1 0 r i d e   i n i t i a l 1 y i n c r e a s e d   [Cal and t h e n ，  t h e   [ C a ]   1  l e v e l   d e c r e a s e d .   These r e s u l t s   s u g g e s t  t h a t   a m i l o r i d e  a t  h i g h  c o n c e n t r a t i o n s  would d i r e c t l y  and i n d i r e c t l y  i n h i b i t  t h e  exchanges t o  e x c l u d e   Ca2 ヘ ^{r e s u l t i n gi n  i n d u c t i o n  o f  t h e   [ C a ]   1  e l e v a t i o n .   The s e c o n d a r y  d e c l i n e  i n   [Cal d u r i n g}  

e x p o s u r e  t o   am i 1 0 r i d e   would be due t o   t h e   o t h e r   mechanisms ，  i f   NaLCa2 + and NaLH+ 

exchanges were i n h i b i t e d .   O t h e r  p o s s i b i l i t i e s  f o r  t h e   [ C a ]  

m o d u l a t i o n  by a m i l o r i d e  a r e :   ( 1 )   a  d i r e c t  m o d u l a t i o n  o f  Ca2L pump t o  e x t r u d e  Ca2 ¥and ( 2 )   a  s t i m u l a t i o n  o f  i n o s i t o l  t u r n o v e r   ( α l ‑ a d r e n o c e p t o r  s t i m u l a t i o n  p r o d u c e s  p o s i t i v e  i n o t r o p i c  e f f e c t ) 2 7 ) .   F u r t h e r  e x p e r i m e n t s  a r e   r e q u i r e d  t o  e l u c i d a t e  t h e s e  p o s s i b i l i t i e s .  

REFERENCES 

1 )   G r e e f f ，  V .   K .   a n d  K o h l e r ，  E .  :  A n i m a l  e x p e r i m e n t s  o n  t h e  e f f e c t  o f  t r i a m t e r e n e  a n d  a m i l o r i d e  i n  h e a r t  a n d   c i r c u l a t i o n  a n d  t h e  t o x i c i t y  o f  d i g o x i n .  A r z n e i m i t .   F o r s c h .  2 5  :  1 7 6 6 ‑ 1 7 6 9 ，  1 9 7 5 .  

2 )   L u d e r i t z ，  B . ，   Naumann d ' a l n o n c o u r t ，  C .   a n d  S t e i n b e c k ，  G .  :  E f f e c t s  o f  a n t i k a l i u r e t i c  a g e n t s  o n  c a r d i a c  

巴

l e c t r o p h y s i o l o g y .M e a s u r e m e n t s  i n  p a p i l l a r y  h e a r t  mus c 1 e  a n d  i n  P u r k i n j e  f i b e r s .  K l i n .  W o c h e n s c h .  5 5

4 2 3 4 2 7 ，  1 9 7 7 .  

3 )   C o r a b o e u f ，  E . ，  D e r o u b a i x ，  E .   a n d  C o u l o m b e ，  A .  :  E f f e c t   o f   t e t r o d o t o x i n  o n  a c t i o n  p o t 巴 n t i a l so f   t h e   c o n d u c t i n g  s y s t e m  i n  t h e  d o g  h e a r t .   Am.  J .   P h y s i o   l . 2 3 6  :  H 5 6 1 ‑H 5 6 7 ，  1 9 7 9  

4 )   S a t o h ，  H .  a n d  H a s h i m o t o ，  K .  :  An e l

c t r o p h y s i o l o g i c a ls t u d y  o f  a m i l o r i d e  o n  s i n o ‑ a t r i a l  n o d e  c e l l s  a n d  

V 巴 n t r i c u l a rmus c 1 巴 o fr a b b i t  a n d  d o g .  N a u n y n ‑ S c h m i e d e b e r g ' s  A r c h .  P h a r m a c o l .   3 3 3  :  8 3 ‑ 9 0 ，  1 9 8 6 .   5 )   P o u s t i ，  A .   a n d  K h o y i  M. A .  :  E f f e c t s   o f   a m i l o r i d ， 巴 a  p o t a s s i u m ‑ s p a r i n g  d i u r e t i c   d r u g ，  o n   i n o t r o p i c  

r e s p o n s

so f  i s o l a t e d  g u i n

a ‑ p i ga t r i a 目 J . Mol l .   C e l l  C a r d i o   l . 9 目 4 6 ， 1 9 7 7 .  

6 )   C a r g n e l l i ，  G . ，  B o v a ，  S .  a n d  L u c i a n i ，  S .   :  E f f e c t s  o f  a m i l o r i d e  i n  g u i n e a ‑ p i g  a n d  r a t  l e f t  a t r i a l  c o n t r a c t i o n  

C a r d i o p r o t

c t i o nby a m i l o r i d e   ( 2 0 9 )  

a s  a f f e c t e d  by f r

quencyo f   s t i m u l a t i o n  and  [ C a

。 一 ] [Na 。 つ r a t i o: r o l e  o f   Na+/Ca

x c h a n g e .B r .   J .   Pharmaco l .   97 :  5 3 3 ‑ 5 4 1 ，  1 9 8 9

7 )   Aicken ，  C .  C .  and Thomas ，  R .  C .  :  An i n v e s t i g a t i o n  o f  t h

i o n i cmechanism o f  i n t r a c e l l u l a r  pH r e g u l a t i o n   i n  mouse s o l 巴 u smus c 1 巴 f i b e r s . J .   P h y s i o l .   CLondJ  2 7 3  :  2 9 5 ‑ 3 1 6 ，  1 9 7 7 .  

8 )   W i l l i a m s ，  D .  A. ，  Becker ，  P .  L .  and Fay ，  F .  S .  :  R e g i o n a l  chang

si n  c a 1 c ium und

r l y i n gc o n c e n t r a t i o n  o f   s i n g l e  smooth mus c 1 e  c e l l s .  S c i

n c e 2 3 5

1 6 4 4 ‑ 1 6 4 8 ， 1 9 8 7  

9 )   F r e l i n ，  C . ，  Vigne ，  P .  and L a z d u n s k i ，  M. :  The r o l e  o f  t h e  Na+/H+ exchange s y s t e m  i n  c a r d i a c  c e l l s  i n   r e l a t i o n  t o  t h e  c o n t r o l  o f  t h e  i n i t i a l  N  a

c o n c e n t r a t i o n .J .   B i o l .   Chem.  2 5 9  :  8 8 8 0 ‑ 8 8 8 5 ，  1 9 8 4 .  

1 0 )   Satoh ，  H. and Hashimoto ，  1 五 .:  On e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l  comparison betw

ena  nov

1 c 1 a s s  I c  a n t i a r r h y t h

mic a g e n t ，  NIK  ‑ 2 4 4   C e t h a c i z i n ) ，  and f l e c a i n i d e  i n  c a n i n e  v e n t r i c u l a r  mus c 1 e .   B r .  J .   Pharmaco l .   9 8  :  8 2 7 ‑ 8 3 2 ， 

1 9 8 9  

1 1 )   Satoh ，  H. :  C a f f e i n e  d e p r e s s i o n  o f  s p o n t a n e o u s  a c t i v i t y  i n  r a b b i t  s i n o ‑ a t r i a l  node c e l l s .  G e n .  Pharmaco l .   2 4  

・ 5 5 5 ‑ 5 6 3 ， 1 9 9 3  

1 2 )   F l o r e a n i ，  M. and L u c i a n i ，  S .   :  A m i l o r i d e :  R e l a t i o n s h i p  between c a r d i a c  e f f e c t s  and i n h i b i t i o n  o f  Na+/Ca'+ 

巴

x c h a n g e .E u r .  J .   Pharmaco l .   1 0 5  :  3 1 7 ‑ 3 2 2 ，  1 9 8 4 .  

1 3 )   Marchese ，  A. C . ，  H i l l ，  J .  A. ，  X i e ，  P .  and S t r a u s s ，  H. C .  :  E l e c t r o p h y s i o l o g i c a l  e f f e c t s  o f  a m i l o r i d e  i n  c a n i n

P u r k i n j e  f i b

r s:  e v i d e n c e  f o r  a  d

l a y e de f f

c ton r

p o l a r i z a t i o n .J .   Pharmaco l .   E x p .  T h e r .   2 3 2  :  4 8 5 ‑ 4 9 1 ，  1 9 8 5 .  

1 4 )   Kennedy ，  R .  H. ，  Akera ，  T .   and Brody ，  T .   M. :  S u p p r e s s i o n  o f  p o s i t i v e  i n o t r o p i c  and t o x i c  e f f e c t s   o f   c a r d i a c  g l y c o s i d e s  by a m i l o r i d e .  Eu r .   J .   Pharmaco l .   1 1 5  :  1 9 9 ‑ 2 1 0 ，  1 9 8 6  

1 5 )   Harron ，  D .  W. G . ，  B r e z i n a ，  M. ，  L i l l i e ，  C .  and Kobinger ，  W. :  A n t i f i b r i l l a t o r y  p r o p

r t i e so f  a l i n i d i n e  a f t e r   c o r o n a r y  a r t e r y  o c c 1 u s i o n  i n  r a t s .  Eur 目 J .Pharmacol 目 1 1 0:  3 0 1 ‑ 3 0 8 ，  1 9 8 5 .  

1 6 )   Satoh ，  H. and Hashimoto ，  K .  :  An e l e c t r o p h y s i o l o g i c a l  s t u d y  o f  a l i n i d i n e  i n  v o l t a g e  c 1 amp

dr a b b i t  s i n o ‑ a t r i a l  node c e l l s .  E u r .  J .   Pharmaco l .   1 2 1  :  2 1 1 ‑ 2 1 9 ，  1 9 8 6  

1 7 )   J o u n e l a ，  A .  and Pyorala ，  K .  :  E f f e c t  o f  a m i l o r i d e  on d i g i t a l i s ‑ i n d u c e d  e l e c t r o c a r d i o g r a p h i c  chang

s .A n .   C l i n .  R e s .   7 ・ 6 5 ‑ 7 0 ， 1 9 7 5  

1 8 )   S e l l e r ，  R .  H. ，  Greco ，  J . ，  Banach ，  S .  and Seth ，  R .  :  I n c r

a s i n gt h

i n o t r o p i c

f f e c tand t o x i c  d o s e  o f  d i g i t a l i s   by t h e  a d m i n i s t r a t i o n  o f  a n t i k a l i u r e t i c  d r u g s ‑ f u r t h e r

v i d e n c ef o r  a  c a r d i a c  e f f e c t  o f  d i u r e t i c  a g e n t s .  Am. 

H

a r t J .   9 0 ・ 5 6 ‑ 6 7 ， 1 9 7 5 .  

1 9 )   W a l d o r f f .  S . ，  Hansen ，  P .  B . ，  Kjaergard ，  H. ，  Buch ，  J . ，  E 邑 : e b l a d ， H. and S t e i n e s s ，  E .  :  A m i l o r i d e ‑ i n d u c e d  

c h a n g e s  i n  d i g o x i n  d 

( 2 1 0 )   H .  Satoh ，  e t  a 1 .  

p o t e n t i a l  o f  c a n i n e  s i n u s  n o d a l  c e 1 1 s .  J  a p .  Heart ] .   22

9 2 9 ‑ 9 3 7 ， 1 9 8 1

2 7 )   Satoh ，  H. and Hashimoto ，  K .  :  E f f e c t  o f   ，‑ X 1 a d r e n o c e p t o r  s t i m u l a t i o n s  w i t h  methoxamin

andp h e n y l

p h r i n

ont h e  s p o n t a n e o u s l y  b e a t i n g  r a b b i t  s i n o ‑ a t r i a l  node c e 1 1 s .   Naunyn‑Schmiedeberg's A r c h .  P h a r ‑ maco 1 .   3 3 7

4 1 5 ‑ 4 2 2 ， 1 9 8 8  

2 8 )   Weichmann ，  S .   A .  and Reuss ，  L .  :  NaLH+

xchangea t  t h e  a p i c a l  membrane o f  N e c t u r u s  g a 1 1 b l a d d e r .   Extrac

1 1 u l a rand i n t r a c

1 1 u l a rpH s t u d i e s .  ] .   G e n .  P h y s i o l

80:  2 9 9 ‑ 3 2 1 ，  1 9 8 2 .  

2 9 )   Sheu ，  S .   S .   and  Bl a u s t e i n ，  M. P .  :  Sodium‑calcium

xchange and  r e g u l a t i o n   o f   c e 1 1   c a l c i u m   and  c o n t r a c t i l i t y  i n  c a r d i a c  muscle ，  w i t h  a  n o t e  a b o u t  v a s c u l a r  smooth m u s c l

I n Th

H e a r tand C a r d i o v a s ‑ c u l a r  S y s t e m .  C F o z z a r d ，  H .   A . ，   Haber ，  E . ，  J e n n i n g s ，  R .  B . ，   Katz ，  A

M.and Morgan ，  H .  E . ，  e d s ふRavenP r e s s ，  New York ，  p .   5 0 9 ‑ 5 3 5 ，  1 9 8 6  

3 0 )   Bl a u s t e i n ，  M. P .  :  The i n t e r r e l a t i o n s h i p  between sodium and c a l c i u m  f l u x e s  a c r o s s  c e 1 1  membranes. R e v .   P h y s i o .   1 B i o c h

m.Pharmaco 1 .   70 ・ 3 3 ‑ 8 2 ， 1 9 7 7 .  

3 1 )   Barry ，  W. H. and Smith ，  T .   W. :  Mov 巴 mentso f  Ca ² +  a c r o s s  t h e  sarcolemma  : 巴 f f e c t so f  a b r u p t 巴 x p o s u r e t o  z e r o  e x t

r n a lN  a  +  c o n c e n t r a t i o n .  ] .   Mol 1 .   C

1 1 .C a r d i o   1 . 1 6 ・ 1 1 5 ‑ 1 6 4 ， 1 9 8 4 .  

3 2 )   P h i l i p s o n ，  K .   D .  :  Sodium‑calcium exchange i n  plasma membrane v e s c l e s .  Ann. R e v .  P h y s i o   . 1 4 7

5 6 1 ‑ 5 7 1 ，

1 9 8 5 .