論
文
有 脂 お よび脱 脂 牛 血 清 アル ブ ミン
(BSA) の
熱 構 造 転 移 と安 定性
児 玉 美 智 子, 竹 林 新 二, 城 所 俊 一 ＊, 上 平 初 穂 ＊＊
(平成4年6月29日受理)
Thermal
Transitions
and Stability
of Fatty Acid-Containing
and
Defatted
Bovine Serum Albumin
(BSA)
Michiko Kodama, Shinji Takebayashi, Shun-ichi Kidokoro* and Hatsuho Uedaira**
(Received June 29, 1992)
The thermal denaturation (N-D transition) of fatty acid-containing and defatted (fatty acid-free)
bovine serum albumin (BSA) at pH 7.00 was investigated by differential scanning microcalorimetry.
The enthalpy change (ΔHcal) associated with the thermal transition from the native to the denatured
state for the fatty acid-free BSA was about 30% lower than that for the fatty acid-containing BSA.
The calorimetric data of two BSA's were analyzed on the basis of a double deconvolution method
proposed by S.Kidokoro et.al.(Biopolymers 26,231(1987)).
By this method, the thermal transition of
the defatted BSA was analyzed to be a three-state transition, while the thermal transition of the fatty
acid-containing
BSA was estimated to be a four-state transition, corresponding to a three-domain
structural model for this protein.
1. 緒 言 タ ンパ ク質 は20種 類 の ア ミノ酸 がペ プチ ド結合 に よ って 連結 した ポ リペ プチ ド鎖 か ら構 成 され, 生体 に お ける代 謝 反応 の触 媒 や 細胞 内外 の物 質移 動 な どの 機能 を発 現 す る た め には, ア ミノ酸 配 列 に対応 して構成 され る α-ヘ リ ック スや β-構 造 等 の二次構 造 を含 ん だ高次 の 立 体構 造 を と ら ね ば な らな い。 牛 血清 アル ブ ミン (BSA) は牛 血 清 中 に最 も多 く含 まれ て いる タ ンパ ク質 であ り, 血 液 中 に取 り込 まれ た栄 養 物 質お よび薬 物 な どの 輸送 タ ンパ ク質 と して の機 能 を有 する こ と が 知 られ て い る1),2)。BSAの1次構 造 を Fig. 1に 示 す が, こ れ は 分 子 量66.267, ア ミ ノ酸 残 基 数582か ら な る1本 鎖 の タ ンパ ク 質 で, 3つ の ドメ イ ン構 造 (Fig. 1のI, IIお よ びIII) か ら構 成 され, 17個 のS-S結 合 と1つ の シス テ イ ン 基 (-SH基), さ らに図 中 に矢 印 で示 す18個 の α-ヘ リッ ク ス構 造 を有 す る こ とが 明 らか に され て い る3)-5)。ま た, 一 般 にはBSAの 高次 構造 の 内部 の取 り込 まれ た脂肪 酸 の 除去 は 困難 で あ る こ とも報 告 され て いる6)-8)。本 研 究 にお い て は, 脂 肪 酸 除 去 の操 作 を行 ったBSAと こ の操 作 を行 わ な い, す なわ ち脂肪 酸 含有 のBSAの 熱構 造転 移 の相 違 を高感 度 示 差 走査 熱 量 測 定 に よっ て比 較, 検 討 した。 岡 山 理 科 大 学 理 学部 生 物 化 学科: 〒700岡 山市 理 大 町 1-1
Department of Biochemistry, Okayama University of Science, 1-1 Ridai-cho Okayama 700, Japan
＊相 模 中央 化 学 研 究所: 〒229相 模 原 市 西 大 沼4-4-1
Sagami Chemical Rsearch Center, Nishiahnuma 4-4-1 Sagamihara. Kanagawa 229, Japan
＊＊繊 維 高 分 子材 料 研 究 所: 〒305茨 城 県 つ くば市 東1-1-4
Rsearch Institute for Polymers and Textiles, Tsukuba, Ibaraki Pref. 305, Japan
-163-論
文
熱
測 定
一 方, 近 年 の高感 度 型熱 量 計 の 開発 に よって, タ ンパ ク 質 の 熱構 造 転 移 に伴 われ る熱 力学 量 を解 析 す る種 々の 方 法 が 提 案 され る に至 って い る9)-12)。そ こで, 本研 究 で は, 城 所 らに よ って 開発 され た Double deconvolution 法11),13)-15)に 従 っ て上 述, 2種 のBSAの 熱構 造 転 移 に伴 わ れ る熱 力 学 量 を解 析 した。 そ の結 果, BSAの 天然(N)状 態 か ら熱 変 性(D) 状 態 へ の 熱構 造 転移 は16)-18), X線構造解析によって明かに さ れ てい る構 造 ドメ イ ンモ デ ル3)に対 応 す る多 状 態 転 移 で あ る こ と を明 らか に した の で そ れ に つ い て 報 告 す る。 2. 実 験 2.1 試 薬牛 血 清 ア ル ブ ミン (Code No.250010 Lot No.86) は Miles 社 か ら購 入 した。 脂 肪 酸 除 去 に使 用 し た 活 性 炭 は, 和 光 純 薬 工 業 のDarcoG-60で あ る。BSA内 に1つ 存 在 す る Cys 残 基(-SH基)の 化 学修 飾 に は, ナ カ ラ イ テス ク の ヨ ー ドア セ トア ミ ド (SH基 蛋 白 質 研 究 用) を用 い た。 ま た, ゲ ル ろ過 は Pharmacia LKB社 製 の Sephadex S-200HR カ ラム に よ っ て 行 っ た。 試 料 の 調 整 に は10mMリ ン 酸 Na塩 緩衝 溶 液 (pH=7.00) を使 用 した。 2.2 脱 脂 お よび 有 脂 の2種BSAの 調 整 2.2.1 脂 肪 酸 除 去 市販 のBSA内 に含 まれる脂 肪 酸 を除 去 する た め に用 い た 活 性 炭 処 理 法6)19)の操 作 手順 を以 下 に記 す: 5gのBSAを 脱 気 水100mlに 溶解 し, これ に脱 気 ・洗 浄 した活 性 炭 を重 量 比3:4 (活性 炭:BSA) の割 合 で加 え た。 この 溶液 のpHを2.75 に調 整 し, 温 度3℃で24時 間撹 拌 した。 その 後, 超 遠心 操 作 (15.000rpm×30min) に よって活 性 炭 を取 り除 き, さ らに 上澄 み液 を0.2μmの フ ィル タ ー で吸 引 ろ過 した。 こ の よ う に して得 られ たBSA溶 液 のpHを0.1M-KOHを 用 い て 7.00に 調整 した。 2.2.2 シス テ イ ン残 基 (Cys) の 化学 修 飾
BsA内 に1つ存 在 す る cys 残基 (-SH基) は, BSA分 子 間 で のS-S結 合 をつ く りや す い。 そ こ で この 反応 を阻 止 す る た め に, ヨー ドアセ トア ミ ド (ICH2CONH2) を用 いて-SH基 を-SCH2CONH2に 置 換 した19)。そ の 手 順 を 以 下 に 記 す: 2.2.1の 脂肪 酸 除 去 の 操作 を行 っ たBSA溶 液 (pH=7.00) に KCl (0.2mol/l) を加 え, さ らに ヨー ドア セ トア ミ ドをモ ル 比5:1 (ヨードアセトアミド:BSA) の割合で加え, 温度3℃で 24時 間 撹拌 した。 その後, 温度3℃で4日 間透 析 し, 透 析 外 液 の 電 気伝 導度 測 定 に よ って 透析 完 了 を確 認 した。 こ の透 析 後 の 試料 を凍 結 乾 燥 し, 脂 肪 酸 除 去 の 操 作 を 行 ったBSAの 粉 末 を回収 した。 また, 2.2.1の脂 肪 酸 除去 の 操 作 を行 わないBSAに つ い て も上述 の化 学修 飾 お よび透 析 の 操作 を行 ない, 凍 結乾燥 に よっ てそ の粉 末 を 回収 した。 2.2.3 ガ ス ク ロマ トグラ フ ィー に よ る脂 肪 酸 除去 の 確 認 2.2.1の活性 炭処 理 法 に よるBSA内 の脂 肪 酸 除 去 の効果 を 確 認 す る ため に, 以 下 の方法 に従 って脂 肪 酸 の抽 出 を行 っ た20),21):2.2.2で得 られた2種 のBSA粉 末 の各 々400mgを 蒸 留 水8mlに 溶解 した。 これ に1N-H2SO4の0.1mlと 混 合 溶液 (イ ソ オ ク タ ン:イ ソ プ ロ ピ ル ア ル コ ー ル=1:40) (体積 比) の 40mlを 除 々に加 え, さ ら0.1N-H2SO4の16mlと イ ソ オ ク タ ンの24mlを 加 え た。 この 溶液 を分液 ロ ー トを用 い て振 と う した後 に, 上 澄 み 液 (イソ オ クタ ン相) を分離 した。 そ の 後, イ ソオ ク タ ン24mlを 用 いて抽 出操作 を5回 繰 り返 し, 上澄 み液 を回収 し, エ バ ポ レー ター を用 いて 濃縮 した。 こ の イ ソ オ ク タ ンの 濃 縮 液 の ガ ス ク ロマ トグ ラ フ ィー (GC) ス ペ ク トル を測 定 した。GC装 置 は パ ー キ ンエ ルマ ー社 製 Q-MASS910で あ るが, キ ャ ピ ラ リ ー カ ラ ム (PEG-20M, 25m×0.25mm) を用 い130℃か ら250℃ま で の 昇 温 分 析 を 行 っ た。 GC分 析 に よって得 られ た2種BSAの 結果 を比 較 す る と, 活 性 炭処 理 を行 わ ないBSAは, 重 量 比 を明確 にす るこ とは で き な いが, 炭 素 数8∼16の 脂 肪 酸 を含 み, 活性 炭 処 理 を 行 な ったBSAで は これ らの脂肪 酸 が 除去 され て い る ことが 明 らか に され た。従 って以後, 前者 を有脂BSA, 後 者 を脱 Fig.1 Three-domain model of bovine serum albumin
(BSA). The BSA molecule is composed of three
(I,II,and III) domains, seventeen S-S- bondings (∞) and eighteen α-helical structures (→). The diagram was constructed by referring "K.Aoki, T.Takagi, H. Terada (Eds.), Serum Albumin, pp.1,38, Kodansha (1984)"
I
II
III
脂BSAと 呼 ぶ。 2.2.4 ゲ ル ろ過 に よ る単 量 体 の 分 離 凍結 乾燥 よ り得 られ た脱 脂 お よび有 脂 の2種BSAは 共 に 多 量 体 を含 ん で い る 可 能 性 が あ る。 そ こで, Sephadex S-200HRカ ラム (25×90cm) に よ るゲ ルろ過 に よ って 各 々 BSAの 単 量体 を分 画 した。 カ ラム を リン酸Na塩 緩 衝 溶液 で 平 衡 化 した後 にBSA溶 液 (100mg/5ml) を徐 々 に カ ラム に 添 加 し, 溶 出液 は フ ラク シ ョン コ レク ター を用 い て4mlず つ 採取 した。 これ ら分画 試 料の280nmで の吸 光度 を測 定 し たが, 有脂BSAの 分 画 試料 の吸 光度 (Abs.) を溶 出量 に対 し て プ ロ ッ トした結 果 の 一例 を Fig. 2に 示 す。 2.2.5 電 気 泳 動 測 定 に よ る単 量 体 の確 認 Fig. 2の 有 脂BSAの ゲ ル ろ過 の結 果 を参 照 す る と, 吸光 度 (abs) vs. 溶 出 量 (ml) 曲 線 は 波 線 で 示 す よ う に 多 量 体 (180∼220ml) と単量 体(220∼260ml)の2つ の領 域 に区 分 され る。 そ こでA∼Fの 各 分画 試 料 の ポ リア ク リル ア ミ ドゲ ル 電 気 泳 動 測 定 を行 っ た。用 い た泳 動 緩 衝 溶 液 は グ リシ ン (14.4g)と トリス(3g)を蒸 留 水1lに 溶解 し, pHを7.00に 調整 した もの で あ る。 電気 泳 動 測 定 の 結 果 を Fig. 3の 写 真 に 示 す が, Fig. 2の A∼Cに 対応 す る分 画 試 料 は2∼3本 の バ ン ドを示 し, 単 量 体 のみ な らず 多 量 体 も含 まれ て い る こ とが 明 らか に され た。 また, Fig. 2のD∼Fに 対応 す る 分画 試料 は1本 のバ ン ド を示 し, 単 量体 の み を含 む こ とが確 認 され た。 これ に基 づ い て高感 度 示 差 走 査熱 量 測定 にはD以 降 の単 量体 試 料 を用 い た。脱 脂BSAに つ いて も電気 泳 動 測定 を行 い, 単量体 試 料 で あ る こ とを確 認後 に測 定 用 試 料 と して 用 い た。 2.3 高 感 度示 差 走 査熱 量 測 定 (DSC) 示 差 走査 熱 量 測 定(DSC)は, Microcal 社 製MC-2型 高感 度 示 差 走 査 熱 量 計 を使 用 した。 こ の熱 量 計 はA/D-converter (Deta-translation DT-2801) 内蔵のIBM-PS.2コンピューター に よ って, 測 定 の 操 作 お よび デ ー タ の取 り込 み が 行 わ れ る。DSCは45℃/hの 昇温 速度 で行 った。 また, 測定 に用 い たBSAの 濃度 は4.03∼4.09×10-5mol/lで あ るが, 吸 光係 数 Amol1cm=44.500(A1%1cm=6.67)22)を用いて280mlの吸光度から算 出 した。 また, 熱 デ ー タの解 析 は, 城 所11)によ って 開発 さ れ た Double deconvolution 解 析用 の ソ フ トに従 ってNECコ ン ピュー ター を用 いて行 った。 さ らに, この解 析 法 に よ っ て得 られ た 熱 力 学 パ ラ メ タ を初 期 条 件 と して, FACOM M-780コ ン ピ ュー タ ー を用 いて 非 線 型 最小 二 乗 法SALSプ ロ グ ラ ム23)による最 適 化 を行 った12)。 3. 結 果 と考 察 熱測 定 よ り得 られ た有脂 お よび脱脂 の単 量体BSAの 過 剰 熱容量(ΔCp)vs. 温度(T)曲線をFig. 4aおよびbにそれぞれ示す が, N→D状 態 の 熱構 造 転 移 に基 づ く吸 熱 現 象 が観 察 さ
Fig.2 Gel filtration of fatty acid-containing BSA. The BSA was separated on a Sephadex S-200HR in phosphtate buffer solution. The fraction volume was 4ml. Fractions were analyzed by their absorbances at 280 nm.
Fig.3 Electrophoretic analysis of the fractions A,B,C,D,E, and F of fatty acid-containing BSA obtained by the gel filtration shown in Fig.2.
F E D C B A
Fig.4 Excess heat capacity (ΔCp) versus temperature (T)
curves of fatty acid-containing BSA (a) and defatted BSA (b) at pH 7.00.
-165-論 文
熱
測
定
れ る。 この転 移 に伴 われ る吸 熱 ピー ク に着 目す る と, 脂肪 酸 除 去 に よ り転 移 ピー ク温 度 は低 下 し, 転 移 面積 は減 少 す る こ とが 示 さ れ る。Fig. 4に 示 す2種BSAの ΔCp∼T曲 線 を 基 に して, 城 所 に よ って 開発 さ れ た ソ フ トを用 い て 式(1) ∼(7)に従 って 解 析 した11,13-15)。 ΔH(T)=∫TT1ΔCp(T)dT ……(1) ΔHN(T)=ΔH(T)-HN(T) ……(2) ΔHD(T)=ΔH(T)-HD(T) ……(3) d/dTlnfN(T)=-ΔHN(T)/RT2 ……(4) d/dTlnfD(T)=-ΔHD(T)/RT2 ……(5) fI(T)=1-fN(T)-fD(T) ……(6) 解析 の手 順 を要 約 す る と, 転 移 開始 温 度(T1)よ りも低 温 側, す な わ ち転 移前 のN状 態 の ΔCp曲 線 を基 準 線 と し, こ の 開始 温 度 よ りも高 温側 の ΔCp曲 線 を(1)式に従 って積 分 す る と Fig. 5に示すΔH(T)関数(実線)が得られる。この図に 示 す 転 移 終 了 温度(T2)よ りも高 温 側 の ΔH(T)関 数 を低 温領 域 に外 挿 す る こ とに よっ て, 転移 後 のす な わちD状 態 の エ ンタ ル ピー 関 数HDの(破 線)が 求 まる。 ま た, T1よ りも低温 側 の ΔH(T)関 数 はN状 態 の エ ンタ ル ピー 関数HN(T)(破 線)に 相 当 し, これ を高温 領域 まで外 挿 して示 す。 この ように し て 求 め た ΔH(T), HN(T)お よびHD(T)を(2)お よび(3)式にそれ ぞ れ代 入 す る こ とに よ って, Fig. 5に 示 す △HN(T)お よ び ΔHD(T)が 得 られ る。 次 に, ΔHN(T)お よび ΔHD(T)を(4)お よび(5)式の そ れぞ れ代 入 す る こ とに よっ て, N状 態の モ ル 分 率 関 数fN(T)お よびD状 態 の モ ル分 率 関 数fD(T)が求 め ら れ, さ らに, (6)式よ り中 間(I)状態 の モ ル分 率 関数fI(T)が得 られ る。 上述 の 方 法 に従 っ て 求 め た有 脂 お よ び脱 脂BSAの ΔH (T), HN(T)およびHD(T)の相関関係をFig. 6aおよびbにそれぞれ示 す。 また, Fig. 7aおよびbは有 脂 お よび脱 脂BSAのfN,
Fig.5 Schematic diagram explaining the correlation of
excess enthalpy function ΔH(T), enthalpy function
of native state HN(T), and enthalpy function of heat
denatured state HD(T). HD(T) and ΔH(T) are plotted
as the excess values from HN(T). T1 and T2 are initial and final temperatures of thermal denaturation (N-D transition), respectively.
Fig.6 Excess enthlpy function ΔH(T), enthalpy function of
native state HN(T), enthalpy function of heat denatured state HD(T) for fatty acid-containing BSA (a) and defatted BSA (b) at pH 7.00. Hypothetical excess enthalpy function of intermediate state
ΔH(N,D)(T) is obtained by the double deconvolution analysis11). ΔH(T), HD(T), and ΔH(N,D)(T) are plotted
as the excess values from HN(T). Enthalpy functions of two intermediate states, HI1(T) and HI2(T), are assumed for fatty acid-containing BSA(a), and enthalpy function of one intermediate state HI for defatted BSA (b).
fDお よびfIを温度(T)の 関 数 と して そ れぞ れ 示 す。Fig. 7から 明 らか な よ うに, 両BSAと もfN+fD<1の 関係 を示 し, これ らBSAのN→D状 態 へ の 熱構 造 転 移 は中 間(I)状態 を経 て進 行 す る 多 状 態 転 移 で あ る こ とが 示 され る。 Table 1は21種BSAのN→D転 移 に伴 わ れ る熱 力 学量 を示す。 有脂 お よび脱脂BSAの 熱力 学 量 を比較 す る と, 特 に, 熱 測 定 か ら求 め た転 移 中 点 温度(Tm)で の エ ン タル ピ ー変 化 量 (ΔHcal)が大 き く異 な る こ とが 特 色 と して あ げ られ る。 す なわ ち, 脱脂BSAの ΔHcalは有 脂BSAに 比べ て約1/3ほ ど減 少 して い る。 また, 両BSAの ΔHcalは共 に計 算 よ り求 め た van't Hoff エ ン タ ル ピ ー(ΔHVH)よ りも大 き く, この結 果 か らも, これ らBSAのN→D転 移 が 多 状 態転 移24)-26)であ る こ とが示 唆 され る。 そ こで, 多状 態 転移 で あ る こ とを考慮 して, (7)式に従 っ て 中間 状 態 の エ ン タル ピー 関数 ΔH(N,D) (T)を 求め た11),13)-15)。 ΔH(N,D)ΔH(T)-HN(T)fN(T)-HD(T)fD(T)/1-fN(T)-fD(T) ……(7) 得 られ た2種BSAの 中間状 態 の エ ン タル ピー 関 数 ΔH(N,D) (T)を Fig. 6aお よびbに そ れ ぞれ 加 える。 有 脂BSAの △H(N,D) の は シ グモ イ ド型 を示 し, 従 っ て この エ ン タル ピー関 数 は Fig. 6aに 示 すHI1(T)とHI2(T)のエ ン タル ピー 関 数 で表 わ さ れ る2つ の状 態 に分 解 され る11),13)-15)。そこで(2)および(3)式 を用 いて さ らに計算 を押 し進 め, HI1(T)とHI2(T)にそれ ぞれ 対 応 す る モ ル分 率 関 数, fI1(T)およ びfI2(T)を求 め た(計算 に 際 して は, (2), (3)式の ΔH(T)を ΔH(N,D)(T), HN(T)をHI1(T) さ らに, HD(T)をHI2(T)に それ ぞ れ 置 き換 え て行 っ た)。こ の様にして求めたfI1(T)およびfI2(T)をFig. 7aに破線で示す が, 有脂BSAのN→D転 移 は2つ の 中間状 態 か ら構 成 され る 4状 態 転 移 で あ る こ とが 明 ら か に な っ た。 一 方, 脱脂BSAの 中 間状 態 の エ ンタ ル ピー 関数 は Fig. 6b に示 す よ うに直線 に 近似 され, HI(T)で表 さ れ る1個 の中 間 状 態 が 存在 す る11),13)-15)。すなわち, 脱脂BSAのN→D転移 は有 脂BSAと は異 な り1つの 中 間状 態 か ら構 成 され る3状態 転 移 で あ る こ とが 明 らか に な っ た。
Fig. 6aお よびbか ら得 られ る有脂 お よび脱脂BSAの 熱力 学 パ ラメ タ を初 期 条 件 と して, 非 線 型 最小 二乗 法SALSプ ロ グ ラム に よる熱力 学 関 数 の最 適化 を行 っ た。有 脂BSAの 相 転 移 を3状態 お よび4状 態 モ デ ル に適合 させ る こ とに よる実 測値 か らの 二乗平 均 誤 差 はそ れ ぞ れ0.576mJ/K, 0.047mJ/K とな り, また脱脂BSAの2状 態お よび3状 態 モデ ル に対 す る 二 乗 平均 誤差 はそ れぞ れ0.290mJ/K, 0.060mJ/Kと な った。 従 って, これ らの結 果 か ら, 有 脂 お よび脱脂BSAの 熱構 造 転 移 はそ れぞ れ3状 態 お よび4状 態 モ デ ルに従 う こ とが確 認 され た。 有脂 お よび脱脂BSAの 最 適転 移 に対 す る熱 力 学関 数 の 計 算 値 を Table 2に 示 す。 本研 究 にお い て は, 示差 走査 熱 量測 定 によ って得 られ た N→D状 態へ の熱 構 造 転 移 に伴 わ れ る熱 力 学 量 を解析 す る こ とに よ って, 有脂 お よび脱 脂BSAの この転 移 は それ ぞれ 4状 態 お よび3状態 か ら構 成 され る こ とを明 らか に した。 こ の結 果 に基 づ い て考 察 す る と, 有脂BSAの4状 態 転 移 とい
Fig.7 Molar fraction functions of native, heat denatured,
and intermediate states, fN(T), fD(T), and fI(T) for
fatty acid-containing BSA (a) and defatted BSA (b).
fI(T) of fatty acid-containing BSA (a) is analyzed
into two molar fraction functions of intermediate
states 1 and 2, fI1(T) and fI2(T).
Table 1 Calorimetric enthalpy change (ΔHcal) and van't Hoff enthalpy (ΔHVH) at midpoint temperature
(Tm) associated with thermal transition of native to denatured states for fatty acid-containing and defatted BSA's.
-167-論
文
熱
測
定
う現 象 は, 従 来 のX線 構造 解析 等 の研 究 に よ って 明 らか に され て い る この タ ンパ ク質 の3-ド メ イ ン構 造 モ デ ル に う ま く適 合 す る。Fig. 8に この3-ド メ イ ン構 造 モ デ ル と本研 究 で得 られ た4状 態 転 移 を考 慮 した 転移 過程 を模 式 的 に示 す。N状 態 を構 成 す る3つ の ドメイ ン構 造 の内 の どれか1つ が まず 最 初 に壊 れ る こ とでI1状態 が, 次 に残 り2つの ドメ イ ン構 造 の 内 の どち らか一 方 が壊 れ る こ とでI2状態 が 実現 さ れ る。 最 終 的 に は3つ の ドメ イ ン構 造 の全 てが 壊 れ たD 状 態 が達 成 され る と考 え られ る。 一 方, 従 来 の研 究 か らは, BSA中 に取 り込 まれ た脂肪 酸 はC端 側 の ドメ イ ン(Fig. 1のIII)および 中間領 域 の ドメ イ ン (Fig. 1のII)に存在 す る こ とが 報 告 さ れ てい る7)8)。従 っ て, 本 研 究 で 得 られ た脱 脂BSAの3状 態転 移 とい う現象 は, 脂 肪 酸 を除 去 す る こ とに よ って ドメ イ ンIIおよびIIIのどち ら か一 方が 十 分 に構 造化 され て いな い状 態 にあ る こ と を示 唆 す る。 その 結 果, 熱 転 移 過 程 にお いて1つ の中 間状 態 が 存 在 す る3状 態 転 移 が発 現 さ れ た と も考 え られ る。 ま た, Fig. 7aとbの有脂および脱脂BSAのモル分率温度関数を比較 す る と, 両BSAのfN(T)の 温度 依存 性 はほ とん ど等 し く, さ らにaに示 すfI2(T)とfD(T)の和 は, bのfD(T)に近 い こ とが 示 さ れる。 こ の結 果 に基 づ く と, 脱脂BSAの 十分 に構成 化 され て い ない ドメ イ ン構造 の どれ かが不 安 定 なた め に転 移過程 にお い て熱 力 学的 に独 立 の状 態 に成 り得ず, これ に よって 有 脂BSAの 示 すI2状態 は実 現 されず, I1からD状 態へ の直 接 の転 移 が生 じた と も考 え られる。 脱 脂BSAの 転移 機構 を明 らか にす る ため に は分光 学 的 手段 等 の他 の測 定方 法 を加 え た検 討 が 必要 で あ る と考 え られ る。 しか し, 上述 の いず れ の転 移機 構 にお い て も脂肪 酸 を除去 す る こ とでBSAの ドメ イ ン構 造 の どれ かが 不 安定 化 す る こ とが 明 らか に な った。 4. 謝 辞 本研 究 を行 な うにあ た り, 多数 の御 助 言 をお よび御協 力 をい た だ きま した 岡 山理科 大学工 学 部 竹 田邦雄 教授 に厚 く御 礼 申 し上 げ ます。 また, GCス ペ ク トルの 測 定 お よび解析 を行 って 下 さ い ま した岡 山 理科 大 学理 学 部 直 島好 仲教 授 に深 く感 謝 致 し ま す。Table 2 Thermodynamic functions for fatty acid-containing
and defacted BSA's. aTNI1, TNI2 and TND are the temperatures at which ΔGNI1, ΔGNI2 and ΔGND given by equation d/dT(ΔGNi(T)/T)=ΔHNi(T)/T2
(i=I1,I2 or D) are equal to zero,respectively.
Fig.8 Schematic diagram of the process of thermal transition for fatty acid-containing BSA. The diagram was constructed by considering a four (N, I1, I2 and D)-state model obtained by the double deconvolution analysis11) and a three-domain model3) shown in Fig.1. N state I1 state I2 state D state
文
献
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