研究成果報告書

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Structural characterization of reaction pathway in a PLP-enzyme, methionine gamma-lyase: crystallographic snapshots of key intermediates

８０１５６５０４ 研究者番号： 原田 繁春（Harada, shigeharu） 京都工芸繊維大学・工芸科学研究科・教授 研究期間： ２３３７００５０ 平成 ２７ 年 ６ 月 ２３ 日現在 円 10,900,000 研究成果の概要（和文）：ピリドキサルリン酸（PLP）を補酵素に持つ赤痢アメーバ由来メチオニンγリアーゼ（EhMGL 1）の酵素反応機構の解明を目指し、リガンドフリー体、ミカエリス複合体およびEhMGL1結晶内にトラップした一連の 酵素反応中間体（中間体-1∼中間体-4）のX線構造を決定した。これらの構造から、PLP-酵素間（Lys205）のシッフ塩 基がPLP-基質メチオニン間のシッフ塩基へ変化することで始まる酵素反応機構を中間体構造に基づいて実証できた。こ の機構は従来の研究で予想されていた機構と一致する。一方、反応の最終段階が[1,5]-シグマトロピー転移によって非 酵素的に進むことを新たに明らかにできた。

研究成果の概要（英文）：Pyridoxal 5'-phosphate (PLP) is an indispensable cofactor in many enzymes. The catalytic mechanism of the first part, from substrate binding to PLP to formation of quinonid

intermediate, is characterized in several PLP enzymes, but the latter half is not fully understood. We determined X-ray structures of a series of reaction intermediates to elucidate the mechanism of

PLP-dependent methionine γ-lyase. The structures reveal that the methionine degradation is carried out by aldimine-based C4'-Nα-Cα system, followed by proton migration from the Cα to C4' position. After releasing methanethiol, the latter half of intermediates suggest that the reaction processes leading to the releasing 2-aminobutyrate accounted for a concerted [1,5]-hydrogen sigmatropy with respect to the C4' and Cγ-carbon sites. Taken together, these structural intermediates successfully depicted overall reaction process of γ-elimination.

研究分野： 構造生物学

キーワード： 酵素反応機構 生体分子 PLP酵素 タンパク質 時分割X線解析 スナップショット構造

様 式 Ｃ−１９、Ｆ−１９、Ｚ−１９（共通） １．研究開始当初の背景 これまでに X 線解析で決定された立体構 造に基づいて、多くのタンパク質の構造-機能 相関が明らかにされている。中でも、基質類 似物や阻害剤等との複合体構造は、酵素反応 機構の解明、構造を基礎にしたドラッグデザ イン等に大いに役立っている。一方、実際の 酵素反応は、様々な中間体を経て構造が変化 しながら進行している。従って、酵素がどの ように機能するかを真に理解するには、動的 構造変化を捉える必要がある。 ところで、結晶中でも反応速度が遅くなる とはいえ溶液中と同様に酵素反応が起こる。 従って、結晶中で酵素反応を行って中間体を トラップし、X 線解析すれば反応過程に存在 する様々な中間体構造、すなわち酵素が働い ている様子を動的に捉えることが原理的に できる。しかし、結晶中での酵素反応が全て の酵素分子で同期して進むわけではないの で、いろんな構造が結晶中に混在し、X 線解 析で中間体構造を決定することは絶望的で あると考えられてきた。 しかし、我々は、L-メチオニンやホモシス テインのγ 脱離反応を触媒し、アンモニア、 α ケト酸およびメタンチオールに分解する酵 素 [文献①-⑪]、赤痢アメーバのメチオニン γ リアーゼ１（EhMGL1）の結晶をメチオニン 含有溶液に短時間ソーキングすると結晶内 で酵素反応が起こり、液体窒素温度で結晶を 凍結すれば反応中間体が EhMGL1 に結合し た複合体結晶を調製できることを見出した。 ２．研究の目的 本研究では、EhMGL1 結晶をメチオニン 含有溶液に時間を変えてソーキングし、液体 窒素温度での凍結によって一連の反応中間 体を結晶内にトラップしてX 線解析を行い、 それらの構造からEhMGL1 の酵素反応機構 を明らかにすることを目的とする。 従来の酵素反応機構に関する構造生物学 的研究は、基質類似物や阻害剤との複合体構 造に基づいており、反応中間体構造の決定ま で行われている例は極めて少ない。従って、 本研究で得られる成果によって、酵素が実際 に働いている姿を見ることによって酵素反 応機構を理解できる。これは、タンパク質立 体構造という三次元空間に時間軸を加えた 新たな世界を切り開くことである。 ３．研究の方法 (1) 結晶化 大腸菌で大量発現した GST タグ融合全長 EhMGL1 を GSTrap HP カラムに結合させ てカラム内でタグを切除した。さらにゲル濾 過精製によって、結晶化に用いる EhMGL1 を得た。リガンドフリーEhMGL1 の結晶化は、 シッティングドロップ蒸気拡散法で、1.8 M 硫安、0.1 M カコジル酸緩衝液 pH6.2、0.1 M クエン酸リチウム、0.1 mM PLP をリザーバー 溶液に用いて、20°C で行った[文献⑫]。 (2) 酵素反応中間体複合体結晶の調製 リガンドフリーEhMGL1 結晶を 50 mM メ チオニン含有抗凍結剤溶液（2.2 M 硫安、0.1 M カコジル酸緩衝液 pH 6.2、0.1 M クエン酸 リチウム、0.1 mM PLP、20% (w/v) glycerol） にソーキングし、結晶内でメチオニンのγ 脱 離反応を開始させた。ソーキング開始から30 秒〜120 秒後に結晶を液体窒素で凍結して結 晶内酵素反応で生成した反応中間体をトラ ップし、EhMGL1-反応中間体複合体結晶を調 製した。 (3) X 線回折強度データの測定と構造解析 回折強度データの測定はSPring-8 BL41XU、 BL44XU および PF NW12A、BL5A、BL17A で行った。HKL2000 を使って回折像を処理し、 構造解析に必要なデータを得た。リガンドフ リーEhMGL1 の構造（1.97 Å 分解能、pdb code 3ACZ）は Pseudomonas putida 由来 MGL の構 造（pdb code 2O7C, [文献⑬]）をモデル分子に 分子置換法で決定した。次に3ACZ をモデル 分子に 6 個の EhMGL1-反応中間体複合体構 造を2.6〜2.0 Å 分解能で決定した（pdb codes: 3AEJ、3AEM、3AEN、3AEL、3AEO、3AEP）。 EhMGL1 はサブユニット A〜D から成るホモ 4 量体で存在しているので、6 個の結晶構造 から 24 個のサブユニット構造が得られた。 これらのサブユニットに結合している反応 中間体構造を調べたところ、3AEN-C サブユ ニットの活性部位はリガンドフリーだった。 一方、3 つのサブユニット（3AEJ-C, 3AEM-C and 3AEN-A）は、活性部位にメチオニンが結 合したミカエリス複合体であった。さらに、 4 種類の中間体（中間体-1a：3AEJ-A, -D サブ ユニット、中間体-1b：3AEJ-B サブユニット、 中間体-2：3AEM-A, -B, D, 3AEL-B, -C, -D サ ブユニット、中間体-3：3AEO-A, -B, -C, -D サ ブユニット、中間体-4：3AEL-A, 3AEN-B, -D, 3AEP-A, B, C, -D サブユニット）を同定する ことができた。 ４．研究成果 (1) EhMGL1 の全体構造 す で に 構 造 決 定 さ れ て い る 他 生 物 種 の MGL と同様、EhMGL1 は 2 つの catalytic dimer （A-D および B-C ペアー）から成るホモ 4 量 体構造をとっていた（図1）。リガンドフリー EhMGL の活性部位にはピリドキサルリン酸 （PLP）が結合し、Lys205 とシッフ塩基を形 成（内部アルジミン）していた。各サブユニ ットは、N 末ドメイン（残基 1〜56）、PLP 結 合ドメイン（残基57〜255）、C 末ドメイン（残 基256〜390）構造から成り、二次構造として 15 本の α ヘリックス（α1〜α15）と 12 本の β 鎖（β1〜β12）が存在していた。各サブユニ ットの活性部位入り口は catalytic dimer を形 成している他方のサブユニットのα2/α3 ルー プ（残基46〜57）でふさがれていた。PLP は

種を超えて保存されている 基（Gly83 Ser202 dimer 基を示す。）と れらの の構造 EhMGL1 ま れ て い る 硫 酸 イ オ ン が 結 合 し て お り 、 Asn155 の主鎖窒素原子と水素結合を形成していた。 おそらく活性部位の安定化に関わっている と考えられる。 (2) メチオニン分解反応中間体構造 ① ミカエリス複合体の構造 メチオニンの き換わり、 合していた N 原子は にあり、 る直前の構造を示していた。また、 OH 基と つ な が る 水 素 結 合 ネ ッ ト ワ ー ク （ OH...Cys110 SH...Lys234 Nζ...H れ て い た 。 こ の ネ ッ ト ワ ー ク に よ っ て EhMGL1 （-NH なると考えられる。また 一つの水素結合ネットワーク（ -NH2...Tyr108 OH...Arg55 って求核性が高められ、 図1. EhMGL トの 末ドメインは紫、緑、黄で色分けしてある。 Catalytic dimer D サブユニットの 種を超えて保存されている Gly83、Met84、 Ser202、Ser204、Tyr53 dimer 中の一方のサブユニットのアミノ酸残 基を示す。）と水素結合を形成していた。 の水素結合は、本研究で決定したすべて の構造に見られた。また、リガンドフリー EhMGL1 の活性部位には結晶化剤溶液に含 ま れ て い る 硫 酸 イ オ ン が 結 合 し て お り 、 Asn155、Lys205、Arg367 の主鎖窒素原子と水素結合を形成していた。 おそらく活性部位の安定化に関わっている と考えられる。 メチオニン分解反応中間体構造 ミカエリス複合体の構造 メチオニンの α き換わり、Ser332 合していた。また、 原子はPLP C4' にあり、C4'に結合して る直前の構造を示していた。また、 基との水素結合 つ な が る 水 素 結 合 ネ ッ ト ワ ー ク （ OH...Cys110 SH...Lys234 Nζ...H れ て い た 。 こ の ネ ッ ト ワ ー ク に よ っ て EhMGL1 に結合したメチオニンの NH3 + ）はプロトン なると考えられる。また 一つの水素結合ネットワーク（ ...Tyr108 OH...Arg55 って求核性が高められ、 A サブユニット C サブユニット 1. EhMGL１の四量体構造。 トの N 末ドメイン、 末ドメインは紫、緑、黄で色分けしてある。 Catalytic dimer（ サブユニットの 種を超えて保存されている5 つのアミノ酸残 、Asn155、Tyr108 Tyr53*、Arg55* 中の一方のサブユニットのアミノ酸残 水素結合を形成していた。 は、本研究で決定したすべて に見られた。また、リガンドフリー の活性部位には結晶化剤溶液に含 ま れ て い る 硫 酸 イ オ ン が 結 合 し て お り 、 Arg367 の側鎖および の主鎖窒素原子と水素結合を形成していた。 おそらく活性部位の安定化に関わっている メチオニン分解反応中間体構造 ミカエリス複合体の構造 α-COO-基が硫酸イオンと置 Ser332、Asn155、Arg367 。また、メチオニンの PLP C4'と極めて近い 結合して四面体中間体を形成す る直前の構造を示していた。また、 水素結合を通じて、 つ な が る 水 素 結 合 ネ ッ ト ワ ー ク （ OH...Cys110 SH...Lys234 Nζ...H れ て い た 。 こ の ネ ッ ト ワ ー ク に よ っ て に結合したメチオニンの プロトンを引き抜かれて なると考えられる。またα-アミノ基は、 一つの水素結合ネットワーク（ ...Tyr108 OH...Arg55* Nη...PLP PO って求核性が高められ、C4'の求核攻撃 サブユニット D サブユニット サブユニット B サブユニット １の四量体構造。 末ドメイン、PLP 結合ドメイン、 末ドメインは紫、緑、黄で色分けしてある。 （A-D、B-C ペアー サブユニットのα2/α3 ループを赤で示す。 つのアミノ酸残 Tyr108、Asp180_* ; *印は catalytic 中の一方のサブユニットのアミノ酸残 水素結合を形成していた。 は、本研究で決定したすべて に見られた。また、リガンドフリー の活性部位には結晶化剤溶液に含 ま れ て い る 硫 酸 イ オ ン が 結 合 し て お り 、 の側鎖およびSer332 の主鎖窒素原子と水素結合を形成していた。 おそらく活性部位の安定化に関わっている メチオニン分解反応中間体構造 硫酸イオンと置 Arg367 と水素結 メチオニンのα-アミノ基 極めて近い距離（2.5 Å 四面体中間体を形成す る直前の構造を示していた。また、Tyr108 、外部水分子に つ な が る 水 素 結 合 ネ ッ ト ワ ー ク （Tyr108 OH...Cys110 SH...Lys234 Nζ...H2O）に組み込ま れ て い た 。 こ の ネ ッ ト ワ ー ク に よ っ て に結合したメチオニンのα-アミノ基 を引き抜かれて-NH2 アミノ基は、もう 一つの水素結合ネットワーク（メチオニン η...PLP PO4-）によ 求核攻撃が可能 サブユニット サブユニット １の四量体構造。A サブユニッ 結合ドメイン、 末ドメインは紫、緑、黄で色分けしてある。 ペアー）のうち、 ループを赤で示す。 つのアミノ酸残 Asp180、 catalytic 中の一方のサブユニットのアミノ酸残 水素結合を形成していた。こ は、本研究で決定したすべて に見られた。また、リガンドフリー の活性部位には結晶化剤溶液に含 ま れ て い る 硫 酸 イ オ ン が 結 合 し て お り 、 Ser332 の主鎖窒素原子と水素結合を形成していた。 おそらく活性部位の安定化に関わっている 硫酸イオンと置 と水素結 アミノ基 2.5 Å） 四面体中間体を形成す Tyr108 の 外部水分子に Tyr108 ）に組み込ま れ て い た 。 こ の ネ ッ ト ワ ー ク に よ っ て アミノ基 2に もう メチオニン によ が可能 になっていると ② これらは PLP している。 はC4 が異なっている 位置が とから、 りの回転によって ン変化すると 体-1b の-OH 合形成が原動力になっていると考えられる。 さらに ピリジン環が同一平面上に並び、 はこの平面にほぼ直交 ③ 中間体 異性によって プロトンが 合を Tyr53 することで求核性が高められ アミノ基 ④ 中間体 転 移 し て C4'-移動に伴い、ピリジン環から 平面上に存在する。 ⑤ 中間体 たメチオニンから ある ットのうち、 および 電子密度が外部アルジミン近傍に認められ サブユニッ 結合ドメイン、C 末ドメインは紫、緑、黄で色分けしてある。 ）のうち、 ループを赤で示す。 になっていると 中間体-1a および これらは Lys205 PLP とシッフ塩基（外部アルジミン）を形成 している。中間体 C4-C4'結合回りの二面角（ が異なっている 位置が、ミカエリス複合体と とから、中間体-りの回転によって ン変化すると考えられる。 1b で形成されている OH 基とメチオニン 合形成が原動力になっていると考えられる。 さらに中間体-1b ピリジン環が同一平面上に並び、 はこの平面にほぼ直交 中間体-2 中間体-2（図 異性によって、中間体 プロトンが C4' を形成した構造を示している Tyr53* OH を介して することで求核性が高められ アミノ基が行うと考えられる。 中間体-3 中間体-2 から 転 移 し て で き る 中 間 体 -Nα-Cα=Cβ 構造を示している。二重結合の 移動に伴い、ピリジン環から 平面上に存在する。 中間体-4 中間体-4 は外部アルジミン メチオニンから ある。この中間体 ットのうち、3 つ（ および 3AEP-C 電子密度が外部アルジミン近傍に認められ 図2. メチオニン になっていると考えられる（図 および-1b の構造 Lys205 に代わってメチオニンが とシッフ塩基（外部アルジミン）を形成 中間体-1a（図 3 結合回りの二面角（ が異なっている。メチオニン ミカエリス複合体と -1a ができた後、 りの回転によって 1b へとコンフォメーショ 考えられる。この変化は、 で形成されているPLP 基とメチオニンα アミノ基 合形成が原動力になっていると考えられる。 1b では C4-C4'=Nα ピリジン環が同一平面上に並び、 はこの平面にほぼ直交している 図3c）はプロトトロピック互変 、中間体-1b（C4'=Nα C4'に転移し、C4' た構造を示している を介してPLP リン酸基と水素結合 することで求核性が高められ が行うと考えられる。 からCβ プロトンが で き る 中 間 体-3 構造を示している。二重結合の 移動に伴い、ピリジン環から 平面上に存在する。 は外部アルジミン メチオニンから CH3SH が脱離した構造 中間体構造を示す つ（中間体-4a: C サブユニット 電子密度が外部アルジミン近傍に認められ 2. ミカエリス複合体 メチオニン （図2）。 の構造 に代わってメチオニンが とシッフ塩基（外部アルジミン）を形成 3a）と 1b（図 結合回りの二面角（1a: -102°、1b: メチオニンのα アミノ基 ミカエリス複合体と1a でほぼ同じこ ができた後、C4-C4'結合回 コンフォメーショ この変化は、 PLP ピリジン環 アミノ基間の水素結 合形成が原動力になっていると考えられる。 C4'=Nα-Cα と ピリジン環が同一平面上に並び、Cα-H している。 はプロトトロピック互変 C4'=Nα-Cα）の C4'-Nα=Cα 二重結 た構造を示している。この転移は、 リン酸基と水素結合 することで求核性が高められた Lys205 が行うと考えられる。 プロトンがα アミノ基 3 （ 図 3d ） 構造を示している。二重結合の 移動に伴い、ピリジン環から Cγ までが同一 は外部アルジミンを形成してい が脱離した構造 構造を示す7 つのサブユニ 4a: 3AEL-A、3AEP サブユニット）は CH3SH 電子密度が外部アルジミン近傍に認められ ミカエリス複合体 に代わってメチオニンが とシッフ塩基（外部アルジミン）を形成 （図 3b） 1b: -9°） アミノ基の ほぼ同じこ 結合回 コンフォメーショ この変化は、中間 ピリジン環3 位 間の水素結 合形成が原動力になっていると考えられる。 と PLP H 結合 はプロトトロピック互変 のCα 二重結 この転移は、 リン酸基と水素結合 Lys205 の ε-アミノ基に ） は 、 構造を示している。二重結合の までが同一 を形成してい が脱離した構造で サブユニ 3AEP-A SH の 電子密度が外部アルジミン近傍に認められ

た。さらに、 に関して、 trans（ していることを 間体 -ット）は (3) EhMGL1 EhMGL1 プしたメチオニン分解反応中間体構造から 酵素反応機構を考察した。 ① PLP 先ず、 に結合 る。次に てメチオニン b）する α-NH (α-NH ..H2O α-NH 水 素 結 合 ネ ッ ト ワ ー ク Tyr108 図3. た。さらに、電子密度 に関して、α アミノ基 （図3f）の両方 していることを示して -4b: 3AEN-B、 ット）は trans の関係にあった。 (3) EhMGL1 の酵素反応機構 EhMGL1 結晶中に液体窒素温度でトラッ プしたメチオニン分解反応中間体構造から 酵素反応機構を考察した。 PLP-methionine imine 先ず、メチオニンがリガンドフリー に結合してミカエリ 次にLys205 が内部アルジミンから脱離し メチオニンが外部アルジミンを形成（図 ）する。EhMGL1 NH3+ は 、 水 素 結 合 ネ ッ ト ワ ー ク NH3+...Tyr108-OH..Cys110 O) に よ っ て プ ロ ト ン が 引 き 抜 か れ て NH2となる。さらに窒素原子はもう一つの 水 素 結 合 ネ ッ ト ワ ー ク Tyr108-OH...Arg55 3. EhMGL1 結晶中にトラップした中間 体-1a~4b 電子密度図は、Cα=Cβ アミノ基とCγ は の両方が混じって結晶中に存在 示していた。 、-D、3AEP の関係にあった。 の酵素反応機構 結晶中に液体窒素温度でトラッ プしたメチオニン分解反応中間体構造から 酵素反応機構を考察した。 methionine imine の生成 （transamination メチオニンがリガンドフリー してミカエリス複合体（図 が内部アルジミンから脱離し 外部アルジミンを形成（図 EhMGL1 に結合したメチオニン は 、 水 素 結 合 ネ ッ ト ワ ー ク OH..Cys110-SH... に よ っ て プ ロ ト ン が 引 き 抜 か れ て となる。さらに窒素原子はもう一つの 水 素 結 合 ネ ッ ト ワ ー ク .Arg55*-NHC(NH2) 結晶中にトラップした中間 1a~4b の構造 Cα=Cβ 二重結合 は cis（図 3e） が混じって結晶中に存在 一方、残り（ -B、D サブユニ の関係にあった。 結晶中に液体窒素温度でトラッ プしたメチオニン分解反応中間体構造から の生成 transamination 反応） メチオニンがリガンドフリーEhMGL ス複合体（図 2）ができ が内部アルジミンから脱離し 外部アルジミンを形成（図 に結合したメチオニン は 、 水 素 結 合 ネ ッ ト ワ ー ク SH...Lys234*-NH に よ っ て プ ロ ト ン が 引 き 抜 か れ て となる。さらに窒素原子はもう一つの 水 素 結 合 ネ ッ ト ワ ー ク (α-NH )2+...PLP-PO4 結晶中にトラップした中間 二重結合 ）と が混じって結晶中に存在 一方、残り（中 サブユニ 結晶中に液体窒素温度でトラッ プしたメチオニン分解反応中間体構造から 反応） EhMGL ができ が内部アルジミンから脱離し 外部アルジミンを形成（図3a, に結合したメチオニンの は 、 水 素 結 合 ネ ッ ト ワ ー ク NH3+. に よ っ て プ ロ ト ン が 引 き 抜 か れ て となる。さらに窒素原子はもう一つの NH2... 42-） によって求核性が高められる。その結果、メ チ オ ニ ン の C4'=Nζ る。この中間体から -1（ ② 酵素 imine がN=Cα 間体 プロトンの への移動が連続することで行われる。これら のプロトン移動は を介した 高められている われる。 中間体 ③ ことによって中間体 中間体 重結合のアリル位にあるので、脱離し易くな っている。 S 原子と近距離（ よっ て行われる と考えられ る。 Lys234 と水素結合ネットワークを形成している で、このネットワークを通じてプロトンが外 部水分子から供給される。 ④ 本研究では、中間体 に よ っ て 生 じ る 中 間 体 、 α-iminobu かった。その理由はこの中間体が極めて早く、 非酵素的に て中間体 ができる 体両方の存在が 性を示している。 ⑤ 中間体 ることで内部アルジミンが再生される。 時、 素結合ネットワークによって求核性が高め られている。脱離基は水と反応して酵素反応 の 最 終 生 成 物 2-oxobutyrate 以上、本研究によって分光学的データ等に よって推定されていた 造生物学的に実証することができた。また、 メ チ オ ニ ン 分 解 の 最 終 段 階 は 非 酵 素 的 に [1,5] を示すことができた。 結晶中にトラップした中間 によって求核性が高められる。その結果、メ チ オ ニ ン の α C4'=Nζ に求核付加して る。この中間体から （PLP-methionine imine 二重結合の1,3 酵素反応の次のステップ imine の C4'=N N=Cα（中間体 間体-3、図 3d）へ プロトンの C4'への移動と への移動が連続することで行われる。これら のプロトン移動は を介した PLP PO 高められている われる。中間体 中間体-2 になると考えられる。 CH3SH の脱離反応 中間体-3（図 ことによって中間体 中間体-3 において 重結合のアリル位にあるので、脱離し易くな っている。CH3S 原子と近距離（ よっ て行われる と考えられ る。 Lys234 および Cys110 と水素結合ネットワークを形成している で、このネットワークを通じてプロトンが外 部水分子から供給される。 [1,5]-シグマトロピー転移 本研究では、中間体 に よ っ て 生 じ る 中 間 体 、 iminobutyrate かった。その理由はこの中間体が極めて早く、 非酵素的に[1,5] て中間体-4a に変換されるからと考え ができる。中間体 両方の存在が 性を示している。 内部アルジミンの再生 中間体-4b に Lys205 ることで内部アルジミンが再生される。 時、ε-NH2はTyr53 素結合ネットワークによって求核性が高め られている。脱離基は水と反応して酵素反応 の 最 終 生 成 物 oxobutyrate に分解される。 以上、本研究によって分光学的データ等に よって推定されていた 造生物学的に実証することができた。また、 メ チ オ ニ ン 分 解 の 最 終 段 階 は 非 酵 素 的 に [1,5]-シグマトロピー転移 を示すことができた。 によって求核性が高められる。その結果、メ α-NH2 が 内 部 ア ル ジ ミ ン の に求核付加して四面体中間体ができ る。この中間体からLys205 が脱離 methionine imine）が生成する。 1,3-プロトトロピック 反応の次のステップで C4'=N 二重結合（中間体 （中間体-2、図 3c）を経て ）へ移動する。この反応は への移動と への移動が連続することで行われる。これら のプロトン移動は、PLP から脱離 PLP PO42-との水素結合で求核性が 高められているLys205 の ε 中間体-1b はキノイド中間体を経て になると考えられる。 の脱離反応 （図3d）から ことによって中間体-4（図 3e, f においてCH3S-置換基は、 重結合のアリル位にあるので、脱離し易くな S-置換基へのプロトン供給は 原子と近距離（3.2 Å）にある よっ て行われる と考えられ る。 Cys110 を介して と水素結合ネットワークを形成している で、このネットワークを通じてプロトンが外 部水分子から供給される。 シグマトロピー転移 本研究では、中間体-3 から に よ っ て 生 じ る 中 間 体 、 tyrate をトラップすることができな かった。その理由はこの中間体が極めて早く、 [1,5]-シグマトロピー転移によっ に変換されるからと考え 。中間体-4a について、 両方の存在がシグマトロピー転移 性を示している。 内部アルジミンの再生 Lys205 の ε-NH ることで内部アルジミンが再生される。 Tyr53*を介した 素結合ネットワークによって求核性が高め られている。脱離基は水と反応して酵素反応 の 最 終 生 成 物 で あ る に分解される。 以上、本研究によって分光学的データ等に よって推定されていたMGL 造生物学的に実証することができた。また、 メ チ オ ニ ン 分 解 の 最 終 段 階 は 非 酵 素 的 に シグマトロピー転移で行われる可能性 を示すことができた。 によって求核性が高められる。その結果、メ が 内 部 ア ル ジ ミ ン の 四面体中間体ができ が脱離して中間体 ）が生成する。 プロトトロピックシフト で PLP-methionine （中間体-1b、図 ）を経てCα=Cβ る。この反応は への移動と Cβ プロトンの への移動が連続することで行われる。これら から脱離後、Arg55 との水素結合で求核性が ε-NH2によって行 はキノイド中間体を経て になると考えられる。 から CH3SH 脱離する 3e, f）が生成する。 置換基は、Cα=Cβ 重結合のアリル位にあるので、脱離し易くな 置換基へのプロトン供給は ）にあるTyr108 OH よっ て行われる と考えられ る。Tyr108 を介して外部の水分子 と水素結合ネットワークを形成している で、このネットワークを通じてプロトンが外 シグマトロピー転移 から CH3SH の脱離 に よ っ て 生 じ る 中 間 体 、β,γ-unsaturated することができな かった。その理由はこの中間体が極めて早く、 シグマトロピー転移によっ に変換されるからと考えること ついて、cis 体と シグマトロピー転移の可能 NH2が求核攻撃す ることで内部アルジミンが再生される。 を介したPLP PO42-との水 素結合ネットワークによって求核性が高め られている。脱離基は水と反応して酵素反応 で あ る ア ン モ ニ ア と に分解される。 以上、本研究によって分光学的データ等に MGL の反応機構を構 造生物学的に実証することができた。また、 メ チ オ ニ ン 分 解 の 最 終 段 階 は 非 酵 素 的 に で行われる可能性 によって求核性が高められる。その結果、メ が 内 部 ア ル ジ ミ ン の 四面体中間体ができ 中間体 ）が生成する。 シフト methionine 、図3b） Cα=Cβ（中 る。この反応は Cα プロトンの N への移動が連続することで行われる。これら Arg55* との水素結合で求核性が によって行 はキノイド中間体を経て 脱離する が生成する。 Cα=Cβ 二 重結合のアリル位にあるので、脱離し易くな 置換基へのプロトン供給は、 r108 OH に Tyr108 は 外部の水分子 と水素結合ネットワークを形成しているの で、このネットワークを通じてプロトンが外 の脱離 unsaturated することができな かった。その理由はこの中間体が極めて早く、 シグマトロピー転移によっ ること 体と trans の可能 が求核攻撃す ることで内部アルジミンが再生される。この との水 素結合ネットワークによって求核性が高め られている。脱離基は水と反応して酵素反応 ア ン モ ニ ア と 以上、本研究によって分光学的データ等に の反応機構を構 造生物学的に実証することができた。また、 メ チ オ ニ ン 分 解 の 最 終 段 階 は 非 酵 素 的 に で行われる可能性

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Life 61, 1019-28 (2009).

⑤Yoshimura, M. et al. Formation of methyl mercaptan from L-methionine by Porphyromonas gingivalis. Infection and immunity 68, 6912-6 (2000).

⑥Rébéille, F. et al. Methionine catabolism in Arabidopsis cells is initiated by a gamma-cleavage process and leads to S-methylcysteine and isoleucine syntheses.

Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103, 15687-92

(2006).

⑦Song, H., Xu, R. & Guo, Z. Identification and Characterization of a Methionine gamma-Lyase in the Calicheamicin Biosynthetic Cluster of Micromonospora echinospora. Chembiochem (2014).

⑧Kappes, B. et al. PLP-dependent enzymes as potential drug targets for protozoan diseases.

Biochim Biophys Acta 1814, 1567-76 (2011).

⑨Cavuoto, P. & Fenech, M.F. A review of methionine dependency and the role of methionine restriction in cancer growth control and life-span extension. Cancer Treat Rev 38, 726-36 (2012).

⑩Huang, T., Joshi, V. & Jander, G. The catabolic enzyme methionine gamma-lyase limits methionine accumulation in potato tubers. Plant

Biotechnol J 12, 883-93 (2014).

⑪Sato, D. et al. Kinetic characterization of methionine gamma-lyases from the enteric protozoan parasite Entamoeba histolytica against physiological substrates and trifluoromethionine, a promising lead compound against amoebiasis.

FEBS J 275, 548-60 (2008).

⑫Sato, D. et al. Crystallization and preliminary X-ray analysis of L-methionine gamma-lyase 1 from Entamoeba histolytica. Acta Crystallogr

Sect F Struct Biol Cryst Commun 64, 697-9

(2008).

⑬Kudou, D. et al. Structure of the antitumour enzyme L-methionine gamma-lyase from

Pseudomonas putida at 1.8 A resolution. J.Biochem.(Tokyo), 141:535-544 (2007).

５．主な発表論文等 〔雑誌論文〕（計 10 件）

①Young L., May B., Pendlebury-Watt A., Shearman J., Elliott C., Albury MS., Shiba T., Inaoka DK., Harada S., Kita K., Moore AL. Probing the ubiquinol-binding site of recombinant Sauromatum guttatum alternative oxidase expressed in E. coli membranes through site-directed mutagenesis. Biochim Biophys Acta. 1837, 1219-25 (2014). 査読有り

②Balogun EO, Inaoka DK, Shiba T, Kido Y, Tsuge C, Nara T, Aoki T, Honma T, Tanaka A, Inoue M, Matsuoka S, Michels PA, Kita K, Harada S., Molecular basis for the reverse reaction of African human trypanosomes glycerol kinase. Mol Microbiol. 94, 1315-29 (2014). 査 読有り

③Emmanuel Oluwadare Balogun,Daniel Ken Inaoka,Tomoo Shiba,Yasutoshi Kido,Takeshi Nara, Takashi Aoki, Teruki Honma, Akiko Tanaka, Masayuki Inoue, Shigeru Matsuoka, Paul AM. Michels, Shigeharu Harada & Kiyoshi Kita, Biochemical characterization of highly active Trypanosoma brucei gambiense glycerol kinase, a promising drug target. J. Biochemistry, 154, 77-84 (2013). 査読有り

④Luke Young, Tomoo Shiba, Shigeharu Harada, Kiyoshi Kita, Mary S. Albury, Anthony L. Moore, The alternative oxidases: simple oxidoreductase proteins with complex functions, Biochem Soc

Trans. 41, 1305-1311 (2013). 査読有り

⑤A.L. Moore, T. Shiba, L. Young, S. Harada, K. Kita and K. Ito, Unraveling the Heater: New Insights into the Structure of the Alternative Oxidase. Annual Review of Plant Biology, 64, 637-663 (2013). 査読有り

⑥Shigeharu Harada, Daniel Ken Inaoka, Junko Ohmori, Kiyoshi Kit, Diversity of parasite complex II. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)

- Bioenergetics, 1827, 658-667 (2013). 査読

有り

⑦Tomoo Shiba, Yasutoshi Kido, Kimitoshi Sakamoto, Daniel Ken Inaoka, Chiaki Tsuge, Ryoko Tatsumi, Gen Takahashi, Emmanuel Oluwadare Balogun, Takeshi Nara, Takashi Aoki, Teruki Honma, Akiko Tanaka, Masayuki Inoue, Shigeru Matsuoka, Hiroyuki Saimoto, Anthony L. Moore, Shigeharu Harada, Kiyoshi Kita, Structure of the trypanosome cyanide-insensitive alternative oxidase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,

110, 4580-4585 (2013). 査読有り

⑧Audu J. Natala, Emmanuel O. Balogun, Joshua A. B. Balogun, Hajiya M. Inuwa, Andrew J. Nok, Tomoo Shiba, Shigeharu Harada, Kiyoshi Kita, Rowland I. S. Agbede, and King A. N. Identification and Characterization of Sialidase-Like Activity in the Developmental Stages of Amblyomma variegatum, Journal of

有り

⑨ Mitsuki FUKUMOTO, Daizou KUDOU, Shouko MURANO, Tomoo SHIBA, Dan SATO, Takashi TAMURA, Shigeharu HARADA & Kenji INAGAKI, The Role of Amino Acid Residues in the Active Site of L-Methionine γ-lyase from Pseudomonas putida. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 76, 1275-1284 (2012). 査読有り

⑩Okuda, M., Shiba, T., Inaoka, D., Kita, K. Kurisu, G., Mineki, S. Harada, S., Watanabe, Y. & Yoshinari, S., A Conserved Lysine Residue in the Crenarchaea-Specific Loop is Important for the Crenarchaeal Splicing Endonuclease Activity.

J. Mol. Biol., 405, 92-101 (2011). 査読有り 〔学会発表〕（計 10 件） ①湯之戸俊介、安田江里、古谷和大、福本充 樹、工藤大蔵、志波智生、佐藤暖、田村隆、 原田繁春、稲垣賢二、Pseudomonas putida 由 来メチオニン gamma-リアーゼの結晶構造解 析、第 87 回日本生化学会大会、2014 年 10 月 15 日、京都市 国立京都国際会館 ②安田江里、古谷和大、佐藤暖、福本充樹、 工藤大蔵、志波智生、原田繁春、田村隆、稲 垣賢二、L-メチオニン γ-リアーゼ基質複合 体の X 線結晶構造解析と基質認識に関わる残 基の機能解析、日本ビタミン学会第 66 回大 会、2014 年 6 月 13 日、姫路市 姫路商工会 議所 ③古谷和大、湯之戸俊介、福本充樹、工藤大 蔵、志波智生、佐藤暖、田村隆、原田繁春、 稲垣賢二、Pseudomonas putida 由来メチオニ ン γ-リアーゼの結晶構造解析、第 86 回日 本生化学会大会、2013 年 9 月 11 日、横浜市 パシフィコ横浜 ④清水あやか、花田尚子、山田哲也、田村 隆、 佐藤 暖、志波智生、稲垣賢二、原田繁春、 好熱好酸性アーキアSulfolobus tokodaii 由 来シスタチオニンγ‐シンターゼの構造解 析、第 86 回日本生化学会大会、2013 年 9 月 11 日、横浜市 パシフィコ横浜 ⑤酒井 菜摘、岡 知宏、村野 祥子、唐木 剛、 野崎 智義、佐藤 暖、志波 智生、原田 繁春、 赤痢アメーバ由来メチオニンγ-リアーゼの 結晶学的構造解析、第 86 回日本生化学会大 会、2013 年 9 月 11 日、横浜市 パシフィコ 横浜 ⑥清水あやか、花田尚子、山田哲也、田村隆、 志波智生、稲垣賢二、原田繁春、好熱好酸性 アーキアSulfolobus tokodaii 由来シスタチ オニン合成酵素の X 線結晶構造解析、第 13 回蛋白質科学会年会、2013 年６月 12 日、鳥 取市 とりぎん文化会館 ⑦酒井 菜摘、岡 知宏、村野 祥子、唐木 剛、 野崎 智義、佐藤 暖、志波 智生、原田 繁春、 赤痢アメーバ由来メチオニン γ -リアーゼの 精製と結晶構造解析、第 13 回蛋白質科学会 年会、2013 年６月 12 日、鳥取市 とりぎん 文化会館 ⑧山田哲也、田村 隆、花田尚子、清水あや か、志波智生、原田繁春、稲垣賢二、好熱好 酸性アーキアSulfolobus tokodaii 由来シス タチオニンγ-シンターゼの活性中心残基残 基の機能解析、第 85 回日本生化学会大会、 2012 年 12 月 14 日、福岡市 福岡国際会議場 ⑨岡知宏、佐藤暖、村野祥子、唐木剛、中沢 隆、野崎智義、原田繁春、赤痢アメーバメチ オニンγ-リアーゼ１の結晶中で捉えたα, γ-脱離反応機構、第８４回日本生化学会大 会、2011 年 9 月 21 日、京都市 国立京都国 際会館 ⑩岡知宏、佐藤暖、村野祥子、唐木剛、中沢 隆、野崎智義、原田繁春、赤痢アメーバメチ オニン γ−リアーゼ 1 の結晶中で捉えた α ,γ - 脱離反応進行に伴うスナップショ ット構造、第１１回日本蛋白質科学会年会、 2011 年 6 月 7 日、大阪府吹田市 ホテル阪急 エキスポパーク 〔図書〕（計 0 件） 〔産業財産権〕 ○出願状況（計 0 件） ○取得状況（計 0 件） 〔その他〕 http://www.bio.kit.ac.jp/ ６．研究組織 (1)研究代表者 原田 繁春（HARADA, Shigeharu） 京都工芸繊維大学・工芸科学研究科・教授 研究者番号：80156504 (2)研究分担者 （ ） 研究者番号： (3)連携研究者 （ ） 研究者番号：