イ ン
ド ネ シ ア の ウ イ ル ス 学 的 免 疫 学 的 調 査
イ ン ド ネ シ ア 在 住 者 血 清 中 の 抗Arbovirus抗
体 の 検 索(第1報)
Sumatera島Lampung州
地 区 に お け る 成 績(予
報)
堀
田
進
青
木
英
夫
安
井
多
津
子
佐
本
進
(神戸大 学医学部微生物学教室)
(受付:7月10日,1966年)
一 定 地 域 の 住 民 の問 にい か な る種 類 の ウイ ル ス が ど の 程 度 に 浸 淫 して い る か とい う問題 は,医 学 的 公 衆 衛 生 学 的 に きわ めて 重 要 で あ る が,イ ン ドネ シ ア に 関 す る こ の 種 の研 究 調 査 は,従 来 ほ とん ど行 わ れ て い な い の が 実 情 で あ る。 た ま た ま 我 が 神 戸 大 学 医学 部 に お い て は イ ン ドネ シ ア の 医 学 調 査 を計 画 し,す で に第1次(1964年) お よ び第2次(1965年)の 調 査 隊 が派 遣 され た(宮 崎, 1966)6)。 こ の うち第2次 隊 は1965年(昭 和40年)7月 よ り9月 に わ た っ て 主 と してSumatera島Lampung州 地 区 に診 療所 を 開 設 した 。 そ の 隊 員 の 構 成 お よび 活 動 状 況 の 概 略 等 は 別 に 記 載 され た 通 りで あ る。(白 井, 1966a10),b11))。 本 研 究 は そ の 調 査 活 動 の一 環 と して 遂 行 され た もの で あ る。 イ ン ドネ シ ア は言 う まで もな く熱 帯 地 に 位 置 す る関 係 上,熱 帯 ウイ ル ス 病 の 病 原 体 と して最 も重 要 な 一 つ で あ る節 足動 物 媒 介 性 ウイ ル ス(Arbovirus)に 調 査 研 究 の重 点 を置 くこ と と し,特 に デ ング熱1型 お よび2型(D1, D2と 略 記),日 本 脳 炎(JEと 略 記),黄 熱(YFと 略 記) な らび にChikungunya(Chと 略 記)の ウイ ル ス を取 り 上 げた 。 これ らはい ず れ もイ ン ドネ シ ア に とつ て は も ち ろ ん 日本 を含 め ア ジ ア全 地 域 に 甚 だ 密 接 か っ 重 要 な 関 係 を もっ もの と考 え られ る 。本 研 究 は将 来 さ らに 広 汎 に続 行 の 予 定 で あ る が,今 日ま で に得 られ た成 績 の 一 部 を取 りあ えず こ こ に報 告 せ ん とす る もの で あ る。 実験 材 料 お よ び 実 験 方 法 血 清: 1965年 夏 期 に 前 記Lampung州 診 療 所 に 受診 の 目的 で 来 所 した現 地 在 住 者 か ら法 の如 く肘 窩 静 脈 よ り採 取 し た 血 液 か ら無 菌 的 に分 離 され,分 離 後 直 ち に密 栓 ペ ニ シ リ ン瓶 に容 れ られ た 。 血 清 の分 離 お よ び神 戸 へ の 運 搬 は 第2次 隊 全 員 の協 力 に よ つ て 遂 行 され,神 戸 大 学微 生 物 学 教 室 に お け る抗 体 測 定 実験 は 標 記 の 者 に よつ て 行 な わ れ た 。 血 清 は ス マ トラ よ り神 戸 到 着 まで は 可及 的 冷 暗所 あ る い は4℃ 冷 蔵 庫 に 保 管 す る よ うに 努 め た が,途 中 か な りの時 間 熱 帯 地 の室 温 に さ らされ る こ とは止 む を得 な か っ た 。そ のた め 防 腐 剤 と してPhenol mercuric borate ((C6H5Hg)2B4C7)5,000倍 溶 液 を約0.025ml/mlの 割 に加 えた 。神 戸 に帰 着 後 は電 気 フ リー ザ ー 内 に て 凍 結保 存 され た 。 実 験 に先 立 つ て非 特 異 的反 応 を除 去 す るた めに,56℃ 30分 加 熱 非 働 化 した 後,ア セ トン処 理 を行 つ た 。す なわ ち被 検 血 清0.2mlに 冷 ア セ トン4mlを 加 え ゴ ム栓 を施 して5∼10分 よ く振 盪 す る。 次 に1,500g5分 間遠 心 後 上 清 を捨 て沈 澱 に再 び 冷 アセ トン4mlを 加 え,よ く振 盪 した後 遠 心 して 上 清 を捨 て る 。そ の沈 澱 を試 験 管 内 壁 に拡 げ て真 空 乾 燥器 に入 れ減 圧 乾 燥 す る 。乾 燥 粉 末 に棚 酸 緩 衝 食 塩 水(pH9.0)を2ml加 えて4℃ 冷 蔵 庫 に一 夜 静 置 した 。 この もの を1:10の ア セ トン処 理 血 清 とす る 。 さ らに 吸 収 処 理 の た め ガ チ ョ ウ 赤 血 球 のPacked cellを0.05ml加 え え氷 水 中 で15分 間 反 応 させ た後, 3,000rpm 7分 間 冷 却 遠 心 した 上 清 を もつ て 下 記 の赤 血 球 凝 集 抑 制 反 応(HI)を 行 つ た 。 ウイ ル ス: 本 論文 で は デ ン グ熱1型(D1),日 本 脳 炎(JE)お よび 黄 熱(YF)に 関 す る成 績 が記 載 され て い る。 D1は 望 月 株,JEはJaGar#01株,YFは17D 株 で い ず れ もマ ウス 脳 通 過 株 で あ る 。 こ の うちD1とY Fの 抗 元 は 下記 の ご と く当研 究 室 に て 作製 され,JE抗 元 は 武 田 薬 品 工 業 製 の市 販 品 を使 用 した 。D1は マ ウ チ第7巻 第2号 通 過 第167代,YFは 同 じ く18代 の も の を 出 発 材 料 と し,本 実 験 中 を 通 じ こ れ よ り余 り 世 代 を 経 な い も の が 用 い ら れ た 。 い ず れ も 感 染 マ ウ ス 脳 乳 剤 をProtamine ethanol沈 澱 法 で 処 理 し て ウ イ ル ス の 部 分 精 製 を 行 つ た 。 本 精 製 法 の 大 綱 はJEウ イ ル ス に つ い て 中 村 ら(1963)7) 深 井 ら2)の 記 載 し た 方 法 に 従 つ た が,細 部 に つ い て は 本 教 室 松 村(1965)7)の 改 良 法 に も と つ い た 。
す な わ ち(i)感 染 幼 若 マ ウ ス 脳 にTris-cystine saline (TSC)(0.02MTris,0.14MNaCl, Cystine100μg/ml, pH7.8)を 加 えWaring blendorで3分 間 磨 細 し,10% 乳 剤 と す る 。(ii)8,500g15分 間 遠 心 後 の 上 清 に 最 終 濃 度1mg/1nlに な る よ う に 硫 酸 プ ロ タ ミ ン を加 え,4℃ で30∼60分,時 々 撹 拝 し な が ら 作 用 さ せ,つ い で4,0009 15分 間 遠 心 し て 上 清 を と る。(iii)こ の 上 清 に 最 終 濃 度 25%に な る よ う に 予 め冷 却 し た エ タ ノ ー ル を 撹 梓 し つ つ 徐 々 に 滴 下 し4℃ に て60分 作 用 さ せ る 。(iv) 4,000g 15分 間 遠 心 し て 沈 澱 を と り,そ れ を 出 発 材 料 の1/10容 の TCSに 再 浮 游 せ し め る 。 そ の 低 速 遠 心 上 清 を も つ て 最 終 部 分 精 製 材 料 と し た 。 市 販JE抗 元 は 滅 菌 蒸 溜 水 で 再 溶 解 し4℃ で1時 間 静 置 し た 後 使 用 し た 。 赤 血 球 凝 集 反 応(HA)お よ び 赤 血 球 凝 集 抑 制 反 応(HI): 反 応 は 全 てMicrotiter*を 用 い て 行 つ た 。 そ の 方 法 は Sever (1962)9)の 論 文 お よ びCooke社 のInstruction Manualの 記 載 に 従 っ た が,そ の 概 略 は 次 の 通 りで あ
る 。 (a) HA:
(1) Microtiter(R) V-Plateの ク ボ ミ(Well)にBorate buHered saline(BBSと 略 す,pH9.0)をMicrodropper
で1滴(0.025ml)ず つ 入 れ る 。 (2) 上 記Protamine-ethanol処 理 抗 元 を 稀 釈 ル ー プ (Wiredilution loop)に と り1番 目 の ク ボ ミ に 入 れ 指 先 で 廻 し な が ら よ く混 合 し,次 の ク ボ ミ に 入 れ る 。 (3) 以 下 同 様 に し て2倍 段 階 稀 釈 を 順 次 に 行 う 。 (4) 全 部 の ク ボ ミ にBBS1滴 ず つ 入 れ る 。 (5) 燐 酸 緩 衝 液(い わ ゆ るVirus adjns重ing diluent, VAD),(D1で はpH6.2,JEで はpH6.4,YFは
pH6.0)で 稀 釈 し た0.33%ガ チ ョ ウ赤 血 球 浮 游 液(1.88 ×107cell/ml)を0.05ml(Microdropperで2滴)入 れ, 充 分 振 盪 し て 混 和 す る 。 こ れ で 反 応 液 が 総 量0.1mlと な る 。 セ ロ テ ー プ で 封 じ反 応 液 の 蒸 発 を 防 ぎ37℃ の 艀 卵 器 に30∼60分 間 納 め る。
(6) 1HA単 位 はLast positive (Complete agglutina-tion)を 示 す 抗 元 の稀 釈 で表 わす 。 (b) HI: (1) 抗 元 をBBSで0.025ml中 に4∼8HA単 位 含 む よ うに稀 釈 す る 。稀 釈 した抗 元 に つ き 正確 に4∼8H A単 位 が含 まれ て い る か否 か を上 述 の方 法 で予 め測 定 し て お く。 (2) ア セ トン処 理 お よ び ガ チ ョ ウ赤 血 球 に よ る吸 収 を 行 つ た被 検 血 清(1:10稀 釈)をBBSで2倍 段 階稀 釈 を 行 う。 す な わ ち1列 の ク ボ ミにBBS1滴(0,025ml)を 入 れ て お き,被 検血 清 をル ー プ で と り第1の ク ボ ミか ら 順 次 に2倍 段 階 稀釈 を行 う。 (3) 全 て の被 検 血 清 の 稀 釈 が 完 了 した後,そ の各 々 に 抗 元4∼8HA単 位/0.025mlを1滴 ずつ 加 え,よ く振 盪 して混 和 して セ ロテ ー プ で 封 じ る 。別 に抗 元 の1滴 を BBS1滴 の入 つ た ク ボ ミに 入 れ 翌 日の 抗 元 定 量 に 使 用 す る 。 (4) 抗 元 元 を入 れ終 つ て か ら4℃ 冷 蔵 庫 に 入 れ一 夜 静 置 す る 。 (5) 翌 日上 記 の抗 元 の第2次 定 量 を行 つ て そ の力 価 を 確 認 す る 。 (6)全 て の ク ボ ミに適 当 なpHの 緩 衝 液 で 稀 釈 した 0.33%ガ チ ョ ウ赤 血 球 を2滴(0.05ml)加 え よ く混 和 し て セ ロテ ー プ で 封 じ37℃ 艀 卵 器 に 静 置 し30∼60分 後 に パ ター ン を読 む 。 HI力 価 は 血 球 凝 集 抑 制 を示 す 血 清 の 最 高 稀 釈 で 示 す 。 稀 釈 の第1の ク ボ ミす な わ ち1:20以 上 のHI価 を示 した も の を陽 性 血 清 と し,そ れ 以 下 を陰 性 と した 。 成 績 被 検 血 清 は1965年 度 調 査 隊 診 療 部 を受 診 の 目的 で訪 れ た 住 民 よ り採 取 した もの で,し た が つ て 対 象 はす べ て 自覚 的 な らび に他 覚 的 に何 らか の 異 常 を訴 えた が,急 性 感 染 症 は除 外 さ れ た 。 彼 らの 多 くは ジ ヤ ワ島 か ら10∼ 20年 前 に ス マ トラ 島 に移 住 した 人 々 で あ る と言 わ れ て い る。 第1表 は被 検 者 の居 住 地 の分 布 状 態 を示 す。 これ ら6 村 落 はMetroを 中心 に お お よ そ20km範 囲 内 の農 耕 地 帯 に位 置 し,各 村 落 問 の交 通 は 自動 車 ま た は徒 歩 に よつ て お り,距 離 的 な関 係 か ら,各 村 落 が孤 立 して い る とは 考 え られ ない。 第2表 は使 用 した3種 の ウイ ル ス 抗 元(D1, JE, YF) の うちの1種 類 に対 して のみ 陽 性 反 応 を示 した血 清 の例
* Cooke Engineering Company, Alexandria, Va.,
U.S.A.
数 とそ の 力 価 を示 した も の で あ る。被 検 総 数300例 に対 す るHI陽 性 率 はD1(14%),JE(2.7%),YF(2.7%) で あ り,3者 の総 計 は(19.5%)で あ る。 こ の こ とは被 検 者 の 内 に,D1,JEの 罹 患 を経 験 した 者 の存 在 す る こ と を 示 し,D1の 浸 淫度 がJEの そ れ よ りも高 い 傾 向 が うか が わ れ る、 ア ジ ァ に は今 日ま で 見 出 され て い な いYFに 対 す る抗 体 が証 明 され る こ とは,交 叉 反 応 に も とつ く可 能性 が 考 え られ る が,な お 中和 反 応 其 他 の解 析 を行 う必 要 が あ る 。 第3表 は1種 類 の抗 元 に対 す る抗 体価 に 比 較 して,他 の2種 類 の 抗 体 価 が同 時 に4倍 以 上 の 差 を示 した 症 例 で あ る。 該 当 す る10例 中,D1抗 体 とJE抗 体 の組 合 せ が YF抗 体 の4倍 以 上 の 力価 を示 す とい う例 が 最 も多 く, 8例(80%)を 占 め,D1とYFの 組 合 せ の 陽性 率 が こ れ に次 い で2例 で,JEとYFの 組 合 せ は1例 もみ な か つ た 。 第4表 は1種 類 の抗 体 価 が他 の2種 類 のい ず れ よ りも 4倍 以 上 の 差 を示 す も の を集 計 した もの で あ る。D1と JEの 陽 性 率 が高 い こ とが認 め られ る。 第5表 で は1種 類 の抗 元 に対 す る最 高 また は そ れ に 近 いHI価 の例 を摘 記 した 。No.1とNo.2はD1罹 患 例, No.3はJE罹 患 例 と推 測 され る 。 上 記3種 の 抗 元 の全 て に陽 性 で あつ た血 清 は300例 中 69例(23%)で あ り,こ の 中 に は交 叉 反 応 に 由来 す る 陽 性 例 も含 ま れ る もの と考 え られ る 。3種 の抗 元 のい ず れ に対 して も陰性 で あつ た 血 清 は300例 中145例(48%) で あ つ た 。抗D1抗 体 を持 つ も の は136例(45%),抗JE 抗 体 を を持 つ もの は86例(29%),抗YF抗 体 を持 つ も の は100例(33%)で あ っ た 。 見 掛 け上 の 陽性 あ るい は陰 性 反 応 の 区 分 を ま と めて み る と第6表 の通 りとな る。 第1表 被 検 者 居 住 地 域 分 布 第2表 1種 類 の抗 元 に 対 して の みHI 陽 性 を示 した もの 第3表 1種 類 の抗 体 価 に 対 して 他 の2種 類 の 抗 体 価 が4倍 以 上 を示 す もの 第4表 他 の2種 類 の抗 体 価 の い ず れ よ りも 4倍 以 上 の抗 体 価 を示 す もの 第5表 1種 類 の 抗 元 に対 す る最 高 ま た は そ れ に近 いHI価 の例 第6表 3種 類 の 抗 元 に対 す る見 掛 け上 の 陽性 あ るい は陰 性 の区 分 * 内 訳:男185例,女115例
第7巻 第2号 考 察 本 論 文 は,前 述 した ご と く,1965年 夏 に神 戸 大 学 医 学 部 イ ン ドネ シ ァ 医 学 調査 隊 員 に よつ て採 取 され た 現 地 在 住 者 の血 清 にっ い て,抗Arbovirus HI価 を測 定 した も の で あ る 。 HI価 の測 定 に 当つ て は 最 近 開 発 され 次 第 に 広 く実 用 化 され つ つ あ る 微 量 定 量 法(Microtechnique)を 応 用 し た 。 ウイ ル ス の血 清 反 応 に お い て精 度 の 高 い 実験 を行 う た めに 大 量 の反 応 液 が必 要 で あ るが,大 量 の材 料 の得 ら れ な い場 合,微 量 の 材 料 を用 い て 実 験 す る必 要 にせ ま ら れ る こ とが 少 くな い 。 本 微 量 定 量 法 はTakatsy(1950)12) に よつ て 創 案 され,そ の 後Sever(1962)11)に よ り改 良 せ られ る と共 にRosenbaumら(1963)8)に よつ て実 用 化 の 可 能 性 が示 され,標 準 法 とよ く一 致 す る成 績 の得 られ る こ とが確 か め られ て い る。 した が つ て本 調 査 の ご と く追 加 採 血 が 実 際 上不 可 能 で,し か も限 られ た血 清 量 で な る べ く多種 類 の ウイ ル ス に対 す る抗 体 価 を測 定 しよ うとす る 目的 に は非 常 に 優 れ た方 法 で あ る と言 う こ とが 出 来 る 。 得 られ た成 績 を通 覧 して み る と,供 試3種 抗 元 の うち D1の 浸 淫 度 が最 も高 い こ とは 疑 い が な い 。 JEの 浸 淫 度 はD1よ り も低 い が,少 数 な が らた し か に 存 在 す る こ とは 否 定 出 来 な い 。 と くに 第5表 にみ られ る ご と くJE単 独 罹 患 と思 わ れ る例 が 認 め られ た 。 YF陽 性 血 清 が 少 な か らず 認 め られ た が,し か しそ の HIが80を 越 え る も の が1例 も な か っ た こ とか ら,そ の出 現 は交 叉 反 応 に も とつ く もの で は な い か と推 察 され る。 こ こ で考 慮 す べ き点 はArbovirus,特 にB郡 に 属 す る ウイ ル ス の問 に お け る交 叉 反 応 で あ る.こ の こ とは理 論 的 に重 要 かつ 興 味 あ る題 目で あ る の み な らず,本 論 文 に 取扱 つ た よ うな疫 学 的 調査 の解 釈 に対 して きわ め て 困 難 な 問 題 を 提 供 す る もの で あ る(成 書,例 え ばClarke and CasaLs,19651),参 照)。 こ の こ とに つ い て は,今 後 さ ら に慎 重 に検 討 す べ き もの と考 え る。 東 南 ア ジ ア を 含 め 熱 帯 地 方 の 住 民 の 間 に お け る抗 Arbovirus抗 体 の検 索 は近 年 少 な か ら ざ る研 究 者 に よつ て 試 み られ て お り,そ れ に 関 す る知 見 は 急 速 に拡 大 しつ つ あ る(綜 説,Wisseman and Sweet,196114),Wisse-man,196613),参 照)。 しか る にイ ン ドネ シ ア につ い て は こ の種 の 調 査 は 今 日ま で ほ とん ど行 な わ れ て お らず,わ ず か にLoら(19643),19654))の 報 告 が あ る に す ぎ な い 。彼 らはBandung地 区 で1963年 に採 取 した 血 清142 例,同 じ く1964年 に採 取 した 血 清253例 に つ い てZh-danovら(1961)15)の 方 法 に よつ てD1,D2お よびJEに 対 す るHIを 測 定 した 結 果 に も とづ き,D1,D2の 抗 体 は広 汎 に 分 布 して い るが,少 く ともJE抗 体 はそ の調 査 で は認 め られ な か っ た と述 べ て い る。 我 々 の 調査 の 成 績 は 上 記 の通 りで あ る が,今 後 さ らに 被 検 例 数 を増 す と共 に,他 種 ウイ ル ス抗 元 を も使 用 して 知 見 を拡 め る こ と を予 定 して い る 。す な わ ち,イ ン ドネ シ ァ の他 の 地 区 の 血 清 を逐 年 採 集 し,供 試 ウイ ル ス と し て は デ ン グ熱 の 他 の型,お よび 近 年 東 南 ア ジ ァ地 域 の 出 血 熱 の病 因 と して 注 目 を あ び つ つ あ るChikungunyaの ウイ ル ス な どの 使 用 も計 画 して い る。 ま た 黄 熱 が 未 だ か つ て ア ジア で 発 見 され て い な い事 は著 明 な歴 史 的 事 実 で あ り,そ の 理 由 の一 つ と して デ ン グ熱 との 交 叉 反 応 の 存 在 が 挙 げ られ て い る 。本 調 査 の 結果 も概 ね この こ と を裏 付 け る も の の ご と くで あ るが,さ らに 広 汎 な 観 察 が 望 ま れ る 。そ れ と同時 に,こ れ らの 点 に 関 しイ ン ドネ シ ア の 血 清 疫 学 的 実 情 を把 握 して お く事 は,将 来 こ の地 方 に お け る 出血 熱 や 黄 熱 の 発 生 に 対 し 予 測 を下 す こ と に も な り,ひ い て は これ ら流 行 病 が 日本 そ の他 の温 帯 地 域 に侵 入 す る お そ れ を未 然 に防 ぐこ とに も連 らな る も の と考 え られ る. 総 括 1965年8月 よ り9月 に か け て イ ン ドネ シ ア のSuma-tera島 南 部 のLampung州 地 区 に 在 住 す る 住 民 よ り血 清300例 を採 取 し,デ ング熱1型,日 本 脳 炎 お よび 黄 熱 の各 ウイ ル ス に対 す 赤 血 球 凝 集 抑 制 抗 体 をMicmtiter 法(Takatsy-Sever)に よ つ て 測 定 した 。 現 在 ま で に得 られ た 限 りの成 績 に も とつ い て 概 括 的 な 疫 学 的 推 測 を下 して み る と次 の 通 りで あ る 。 (1) デ ング熱1型 は か な り広 く分 布 して い る 。 (2) 日本 脳 炎 も少 数 な が ら存 在 す る と考 え られ る 。 (3) 黄 熱 に対 す る抗 体 が 認 め られ る 。そ の力 価 か ら推 測 して,そ れ は 恐 ら く他 種Arbovirus,特 に デ ン グ熱 の 感 染 に も とつ く交 叉 反 応 で あ ろ う と思 われ る が,な お将 来 例 数 を重 ね て 検 討 を行 い た い 。 今 後 被 検 例 数 を増 す と共 に,デ ン グ熱 の他 の型'お よ びChikmgmyaの ウイ ル ス に 対 す る 抗 体 を も検 索 す る 予 定 で あ る 。 (謝辞)本 調 査 隊 の活 動 に つ い て 種 々 ご支 援 い た だい た イ ン ドネ シ ア政 府(衛 生 省,高 等 教 育 科 学 省,外 務 省 お よび 駐 日大 使 館,領 事 館),日 本 政 府(外 務 省,駐 イ ン ドネ シ ア 大 使 館),兵 庫 県,神 戸 市,お よび 経 済 的 援 助
を与 え られ た 財 界 各 社,な らび に ご鞭撻 をい た だ い た神 戸 大 学 諸 先 生,事 務 局 各 位 に 対 し深 甚 の謝 意 を表 す る。 血 清 の 採 取 に 当 つ て はLampung州 衛 生局 の 各 位 な らび に 第2次 隊 々 員 諸 氏 の 絶 大 な ご 努 力 に よ る も の で あ つ て,こ こに衷 心 よ り厚 くお礼 申 し上 げ る次 第 で あ る。
引 用 文 献
1) Clarke,D. H., and Casals, J. (1965) :
Arbo-viruses: Group B. In Viral and Rickettsial
In-fections of Man. eds. Horsfall, F.L. Jr. and
Ta-mm, I., Philadelphia, J.B. Lippincott, pp. 606-
658.
2) 深 井 孝 之 助 (personal comminucation).
