MiR-133b inhibits growth of human gastric cancer cells by silencing pyruvate kinase muscle-splicer polypyrimidine tract-binding protein 1

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Title

MiR-133b inhibits growth of human gastric cancer cells by

silencing pyruvate kinase muscle-splicer polypyrimidine

tract-binding protein 1( 内容と審査の要旨(Summary) )

Author(s)

杉山, 太郎

Report No.(Doctoral

Degree)

博士(医学) 甲第1049号

Issue Date

2017-04-19

Type

博士論文

Version

ETD

URL

http://hdl.handle.net/20.500.12099/56225

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氏名（本籍）学位の種類学位授与番号学位授与日付学位授与要件学位論文題目審査委員杉山太郎（愛知県）博士（医学）甲第 1049 号平成29 年 4 月 19 日学位規則第４条第１項該当

MiR-133b inhibits growth of human gastric cancer cells by silencing

pyruvate kinase muscle-splicer polypyrimidine tract-binding protein 1

（主査）教授千田隆夫

（副査）教授秋山治彦教授土井潔

論文内容の要旨

microRNA（miRNA）は 18～25 塩基からなる内因性の non-coding RNA で，標的となるｍRNA の 3’-UTR 領域に結合することで翻訳（タンパク発現）を負に制御している。miRNA は細胞増殖や細胞の分化， apoptosis などの生物学的に重要な過程に関与し，miRNA の多くは様々な腫瘍で発現が低下している。腫瘍細胞におけるエネルギー代謝は好気的環境下でも酸化的リン酸化から解糖系へと偏位しており，この現象は Warburg 効果として知られている。Warburg 効果では解糖系の律速酵素である PKM isoform が PKM2 に偏位しており，その機構は splicer である PTBP1 によって調節されている。大腸癌においては miR-133b が PTBP1 を標的として Warburg 効果を調節していることが既に明らかになっている。本研究では胃癌における miR-133b と PTBP1 の Warburg 効果への関与について検討することとした。【対象と方法】 ① 胃癌細胞株（MKN-1，MKN-45，KATO-Ⅲ）と胃癌臨床検体 20 例において miR-133b の発現を定量的 RT-PCR 法によって調べた。 ② 胃癌臨床検体 20 例において PTBP1 の発現を Western blot 法によって調べた。

③ Luciferase assay および anti-sense transfection assay にて miR-133b が PTBP1 を標的としているかを評価した。

④ MKN-1 と MKN-45 の 2 種類の胃癌細胞株に miR-133b の transfection と siRNA による PTBP1 の knockdown を行い，細胞増殖への影響と Warburg 効果関連タンパク（PTBP1，PKM1，PKM2）の発現の変化を調べた。

⑤ miR-133b の transfection と PTBP1 の knockdown による腫瘍増殖への影響を 3-D spheroid proliferation/viability assay によって評価した。【結果】 ① 胃癌細胞株では miR-133b の発現は正常胃粘膜と比較して有意に低下していた。胃癌臨床検体においても腫瘍組織での miR-133b の発現は正常胃粘膜と比較して有意に低下していた。 ② 胃癌細胞株（MKN-1，MKN-45）への miR-133b の導入によって細胞増殖が抑制され，PTBP1 の発現は低下し，PKM isoform の発現は PKM2 から PKM1 へと偏位していた。

③ miR-133b は PTBP1 の 3’-UTR 領域に結合しており，miR-133b は anti-sense の投与によって細胞増殖抑制が解除された。

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④ miR-133b の transfection によって，電子顕微鏡下では autophagy に特徴的な autolysosome や autophagosome を認めた。Western blot 法では LC3B-Ⅱ（MAP1LC3B-Ⅱ:Microtubule-associated protein light chain3B-Ⅱ）の増加を認めた。

⑤ 3-MA（3-Methyladenine）の添加により miR-133b の導入によって生じた細胞増殖抑制も一部解除された。

⑥ miR-133b の transfection と PTBP1 の knock down による腫瘍増殖抑制は 3-D spheroid proliferation/viability assay でも確認できた。【考察】既に報告されている大腸癌の場合と同様に，胃癌においても Warburg 効果の特性である PTBP1 による PKM1 から PKM2 への偏位が示された。さらに，このメカニズムとして miR-133b による PTBP1 の発現制御が密接に関与していた。胃癌細胞は miR-133b の発現を低下させることにより，Warburg 効果によるエネルギー産生を制御していると考えられる。また miR-133b／PTBP1 は胃癌細胞の autophagy 誘導に関与している可能性が示された。

胃癌細胞は Warburg 効果によってエネルギーを産生しているが，miR-133b による Warburg 効果の破綻は autophagy による癌細胞の細胞死を誘導する可能性が考えられる。【結論】胃癌細胞において，miR-133b は PTBP1 を標的として Warburg 効果に深く関与していることが示された。miR-133b や PTBP1 は癌特異的エネルギー代謝を破綻させる，創薬への標的分子になりうる可能性が示唆された。論文審査の結果の要旨申請者杉山太郎は，胃癌における Warburg 効果の機序に PTBT1 蛋白が関連し，その制御に miR-133b が深く関与していることを，株化胃癌細胞およびヒト胃癌組織を用いて証明した。癌における代謝の特性は近年注目されており，新たな癌治療の標的となり得る可能性が強く示唆されている。Warburg 効果が報告されて既に半世紀が経過したが，ブラックボックスであったその制御機序の一部を明らかにした本研究の成果は，腫瘍外科学の発展に少なからず貢献するものと認められる。［主論文公表誌］

Taro Sugiyama, Kohei Taniguchi, Nobuhisa Matsuhashi, Toshihiro Tajirika, Manabu Futamura, Tomoaki Takai, Yukihiro Akao and Kazuhiro Yoshida

MiR-133b inhibits growth of human gastric cancer cells by silencing pyruvate kinase muscle-splicer polypyrimidine tract-binding protein 1