ヒトビタミンD受容体（VDR）遺伝子の腸管特異的発現調節領域の多型と機能

原

著（第

3

回徳島医学会賞受賞論文）

ヒトビタミン

D 受容体（VDR

）遺伝子の腸管特異的発現調節領域の多型と機能

新 井 英 一

宮 本 賢 一 ，

芳 由 美 智 子 ，

武 田 英 二

山 本 浩 範 ，

森 田 恭 子 ，

徳島大学医学部病態栄養学教室（主任：武田英二教授）

久 保 田 恵 ，

吉 田 繁 子 ，

池 田 己 喜 子 ー

岡山県立大学保健福祉学部栄養学科 （平成11 年11 月 1日受付） ヒトビタミンD 受容体 （VDR ）遺伝子のプロモーター 上に存在する，腸管特異的発現に関わるt;nemeel-sic h VD-SIF 1 (5 ’－ATAAAACTTAT 3’）に遺伝子多 型を 見い出し （Cdx-A: 5’－AT AAAACTT AT-3 ，’ Cdx-G : 5’－gT AAAACTT AT 3’），それぞれの遺伝子多型の頻 度，多型によるVDR 機能への影響および骨密度との関 係について検討した 。健常な日本人女性261 人を対象と し，ダイレクトシークエンス法により頻度を解析した結 果， Cdx-A 型 が18.4%, Cdx-G 型 が3.1 4%, oereth 型 が50.2% であった。それぞれの遺伝子型と骨密度との関 係を閉経後の女性で検討した結果， Cdx-G 型を有する群 は， Cdx-A 型よりも有意に骨密度が低値を示した 。hVD -S I F l配列と腸管特異的転写 因子であるdtealer-laudac homeodomain noitpircsnart rotcaf ( Cdx-2 ）との結合能を 検討した結果， Cdx-G 型はCdx-A 型に比して，有意に 結合能が低値を示した。また，多型と VDR の転写活性 との関係を明らかにするため，

s

o

c

7 細胞に hVD-SIF lを 含 む リ ポ ー タ ー ベ ク タ ー お よ びCdx- 2 発現ベク ターをトランスフェクションして転写活性能を検討した ところ，Cdx-G 型はCdx-A 型に比して転写活性が約20% 低下していた。今回見いだした多型は，カルシウム代謝 に深く関与している VDR の腸管における発現および骨 密度に差異を生じる因子のlつであると考えられた 。 骨粗怒症の発症には，遺伝因子と環境因子が関与する と考えられている- 3I ）。加齢や閉経に伴う骨密度の減少 は個人差が見られることから その発症機序の解明のた めに遺伝因子に関する研究が注目されている 。1949 年に オ ー ス ト ラ リ ア のEisman ら は ビ タ ミ ンD 受 容 体 (VDR ）遺伝子 のイントロン8 に見いだされる多型は， 骨密度との高い相関を示し，骨密度を規定する遺伝因子 の一つであることを報告した4）。 VDR はリガンドである, 25(0H1 2 D 3と複合体を形成) して，標的遺伝子の転写を調節することより，生理作用 を示す。VDR は，腸管，腎臓，骨といった様々な組織 に発現しているが，中でも小腸にもっとも多く発現して おり，カルシウムの吸収と小腸上皮細胞の分化に必須の 因子である5）。 とくに VDR 発 現量 がカルシウム吸収 能を規定する因子と考えられており 腸管でのVDR 発 現低下や機能異常は カルシウム吸収能低下から起こる 骨粗老症の発症に深く関連すると考えられる。これまで に我々は， VDR 遺伝子の腸管特異的発現機構の解析を 目的としてヒト VDR 遺 伝 子 の 転 写 調節機能の解析を 行ってきた。小腸上皮系幹細胞として性質を持つヒト大 腸癌由来細胞株， Caco-2 ￥田胞を用いて VDR 遺伝子プロ モーター領域上で腸管特異的発現に 重要 な領域の検索を ルシフエラーゼ法により試みた結果，転写開始点上流－ 4.0kb から－. 3kb3 の 領 域 がCaco ・2高田胞に特異的に反 応することを見いだした 。またこの領域にはホメオボッ ク ス 遺 伝 子 で あ るedcaudal-relat homeodomain t r a n s c r i p t i o n rotcaf (Cdx 2）の結合配列と相向性の 高 い 配列（hVD-SIF 1 ） が 存 在 し ゲ ル シ フ ト 法 に よ り hVD-SIF 1 に Cdx-2 が特異的に結合することを確認し た6。 本研究では，） Cdx-2 結合配列 上 に遺伝子多型を見 出し，本多型が腸管におけるVDR 発現量を規定し，さ らに骨密度を予測する遺伝因子である可能性について検 討した 。

2 2 6 新 井 英 一 他 方 法 結 果 1 ）対象：インフォームドコンセントが得られた岡山県 在中の健常な9 歳から 71 0 歳までの女性26 1名で，末梢血 より DNA を抽出した 。骨密度の測定には ，腰椎 （L2-L 4 ) 骨密度を， Dual energy rayX- yratmetiorposba ( DXA ) 法により model QDR-2000 (Hcogiol ） を使用して測定 した 。 なお，骨疾患，卵巣摘出者 および骨代謝または 骨密度に影響を与える薬物を使用している者は外した 。 1 ) hVD-SIF I 配列 における多型と頻度 VDR 遺伝子の腸管発現機構に はその 遺伝子の上流約 - 3, 173 か ら－3,702 の領域にcdetaler-ladua homeodomain p r o t e i n (Cdx-2 ）で ある 転写調節因子が結合 し作用す る こ と を 報 告 し た 。Cdx-2 結 合 配 列ATAAAAACT

(Cdx-A 型）に 対 し てgTAAAA ACT (Cdx-G 型）と A から g に変 異 した多型 （hVD-SIF 1 多型）を見い出 した （図l B ）。216 名の日本人女性において，本多型の 2) hVD-SIF l と Cdx 2 との結合能 ：検 討 に は ゲ ル シ- 頻度を検討した結果， C dx -A 型 が148. % , Cdx -G 型 が フト法を用いた7。 図） 4 B に示す種々のオリゴヌクレオ 31.4 % ，ヘテロが50 .2% であった （図I C ）。 チドを作成し ，Maxam-Gi lbter 法にて脱 リン酸化し， T 4 ポリヌクレオチドキナーゼを用いて［γ33P ] ATP 061( μCi /μ)l により末端標識を行った 。その後， p o l y (dCI-d ）， オ リ ゴ を 加 え て4 ℃に て1 時 間 反 応 後 ， dye を 混 入 し 6 % p o l y a c r y l a m i d e leg [ ezis : 1 c4 m ×14cm × 0.1mc ］で、20mA で2 時間，冷却しながら 電気泳動を行っ た。泳動後はゲルを乾燥さ せ，バイオイメージングアナライザーBAS -1500 （富士 フィルム ） を用いて解析した。 図1 .F-SIVDh lにおける多型の配列

A)

hSI-SIFl 5

’

－

GGGTGCAATAAAACTTTATGAGTAG-3

’

CE-LPHl 5

’

ー

CTAGTATTTTACAACCTCAGTTGT-3

’

hVD-SIFl 5

’

ー

GGTCACAATAAAAACTTATTTCTTA-3

’

（・3731 )

i

GTAAA

B

3 ）転写活性 能の測定：測定はルシフ エ ラーゼ法を利用した8。）VDR 遺伝子プロ モーターの腸管特異的発現に必要な領域を 含 む配列をpGL- 3 bcisa orctve にサブク ロ ー ニ ン グ し た 。次 に COS-7 細胞に， pGL - 3 bcisa ,rotcev Cdx -2発 現 ベ ク タ ー (pRc /CMV-Cdx-2 ), 日－ガラクトシダー ゼ 発 現 ベ ク タ －pCMV 明

p

を そ れ ぞ れ TransIT-L Tl lniotcfeopi regent と共 に DEAE-Dextran 法に よ り トランスフ ェク

C)

ションした 。細胞を 4 時間インキュベート した後，血 清 の 入 っ て い る DMEM に変 え， 48 時間培養した。細胞を収集し，溶解 液のルシフエラーゼ活性， 戸－ガラク トシ ダーゼ活性およびタンパク濃度を測定した 。 ＊ C A C AA T A A AAA C T Cdx-A Cd x -G genotype Cd x -A Cd x・A/G Cd x -G latot n 48 131 82 261 % 8.41 250. 43.1 100.0 4 ）有意差検定 ：一元配置分散分析後に， F i s h e r のPLSD 検定を行い， p<O. 05 以 下 を有意とした。 A ) Cdx 2-に よ り 転 写 が 制 御 さ れ る 遺 伝 子 の 配 列 を 示 す。lFIS-ISh はhuman s u c r a s e -i s o m a l t a s e 遺伝子，CE-LPHl はgipsatcal nizirole-hp esalordyh 遺伝子を示 し，下線部位にC dx -2 タンパクが結合する 。B ) hVFSID- lを含む領域をPCR に て増幅し ， ダイ レク トシークエンス法により塩基配列を決定した。転写開始点よ り 3731 番目の塩基 A が G に変異していた。C ）それぞれの遺伝子多型の頻度を 示す。

A)

富

L

t

1

.

o

診、

言

ω

ω 白6.0 偲 ~ 4.0

冨

20. ω 回

。

凶

。

n 図 2 . hVD-SIF l多型と腰椎骨密度（L 2 -L 4 ）との関連性 Cdx-A Cdx ・A/G Cdx-G 1 2 35 21

B)

言

0.1 ω :0.8 －－ ー の ~ 6.0 白 ~ 4.0 冨

冨0

.2 ω 回

。

国

。

Cdx-A Cdx-A/G Cdx-G n 7 32 71 腰椎骨密度L2 ～L4 の平均値をグラフ化したもので， A ）は閉経前の健常女性を， B ）は閉経後の健常女性を対象としたo *p<O . 05 3) hVD-SIF 1多型が及ぼす結合能への影 響 Cdx-A およびCdx-G のhVD-SIF l と Cdx-2 との結合能を，ゲルシフト法を用い て行った。核蛋白は， COS-7 細胞にマウ スのCdx-2 発 現 ベ ク タ ー を ト ラ ン ス フ ェ クションして， Cdx-2 を強制的に発現させ たものを用いた。その結果， Cdx-2 とhVD -SIF 1との結合能は， Cdx-G 型 で は Cdx-A 型 に 比 べ 同 様 な 競 合 阻 害 が 見 ら れ な い ことから，著しく結合能が低下しているこ とが示された（図3 ）。 4) hVD-SIF 1多型が及ぼす転写活性への 影 響 2 ) hVD-SIF I多型と骨密度との関係 閉経前の女性86 名と閉経後の女性65 名の女性を対象に 骨密度とこの遺伝子多型との関係を検討した。閉経前の 女性では各遺伝子型には有意な差は認められなかったが （図2 A），閉経後の女性においてCdx-G 型はCdx-A 型 に比べ，骨密度が有意に低値を示した（p<O. 05) （図 2 B）。 また，それぞれの身長，体重， BMI や血中カル シウム濃度， 1週間のカルシウムを含む栄養摂取は ，閉 経前，閉経後の女性の各遺伝型について比較検討したが 有意な差は認められなかった（表1。） hVD-SIF 1を含む25bp の合成オリゴヌ クレオチド（Cdx-A, Cdx-G ）をherpes virus thymidine kinase 遺 伝 子 プ ロ モ ー タ ー の 上 流 に つ な い だ リ ポー ターベクターを作成した 。 これと共に， Cdx-2 発現ベク ターをCOS-7 細胞にトランスフェクションして，ルシ フエラーゼ活性を測定した 。その結果， Cdx-A で の 活 性を100% とした時， Cdx-G の転写活性は70% から80% を示し， Cdx-G はCdx-A に比して約20% の 発 現 低 下 が 示された （pく. 00 1 ) （図 4 ）。この低下の程度は結合能 の結果と 一致した 。 表1. 閉経前，閉経後女性の身体所見 Age rs)yea( Hight (cm) Weight (kg) BMI (kg/cm2) Body fat(%) Body lean (%) Dairy calcium (mg/day) Serum calcium (mg/di) Age menopause ta )arsye(

閉経前女性

Cdx-A n = 1 2 4 1 . 1 ± 8.1 1 5 5 . 4 ± 7.1 5 5 . 3 ± 9.3 2 2 . 8 ±1.4 2 9 . 0 ± 2.1 3 8 . 4 ± 6.1 Cdx-A/G n = 3 5 4 1 . 0 ± 9.0 1 5 5 .9 ± 9.0 5 6 . 7 ± 7.1 2 3 . 3 ± 6.0 2 9 . 8 ± 4.1 3 8 . 2 ± 0.9 4 0 4 . 0 ± 6.56 0.105 ± 8.24 8.7 ± 2.0 9.8 ± 0.1 Cdx-G n = 2 1 4 0 . 2 ± 2.1 1 5 5 . 6 ± 0.7 5 7 . 0 ± 7.1 2 3 . 5 ± 6.0 3 0 . 2 ± 7.1 P* 0.68 0 . 9 4 0 . 8 9 0 . 8 7 0.91 3 9 . 0 ± 6.0 38.0 4 8 5 .8 ± 8.27 75.0 9 . 0 ± 0.1 073. V a l u e s era mean± SEM . *Secnacifingi f dosecnereffi eenbetw eht eerht .espytnoeg

閉経後女性

Cdx-A n = 7 6 6 . 4 ± 2.5 1 4 8 . 8 ± 0.2 5 1 . 9 ± 2.2 2 3 . 4 ± 0.7 2 9 .8 ± 2.3 3 6 . 2 ± 7.1 Cdx-A/G n = 3 2 6 4 .2 ± 2.1 1 4 8 . 5 ± 0.9 5 1 . 3 ± 4.1 2 3 . 2 ± 5.0 3 0 . 0 ± 1.1 3 5 . 5 ± 6.0 5 9 2 . 8 ± 4.97 0.494 ± 0.44 8 . 5 ± 0.1 9.8 ± 1.0 5 1 . 4 ± 0.2 7.84 ± 2.1 Cdx-G n = 1 6 6 2 . 5 ± 0.1 1 4 9 . 6 ± 5.1 4 8 .2 ± 2.1 2 1 . 5 ± 4.0 2 6 . 4 ± 1.1 3 5 . 5 ± 1.1 6 2 6 . 6 ± 4.19 8.7 ± 0.2 4 7 . 0 ± 9.0 P* 0 . 4 1 0 . 8 0 0 . 3 0 0.10 0.18 0 . 9 1 0 . 2 8 0.23 0 . 2 8

2 2 8 新 井 英 一 他 図.3 FVD-SIh I配列とdx-2C タンパクとの結合能 hVD-SIFl WT 5’－GGTCACAATAAAAACTTATTTCTTA ・3’ (Cdx-A)

(

M

x

1

)

5’－GGTCACAgTAAAAACTTATTTCTTA ・3’ ＊ Ml 5－G’GTCACAAgcAAAACTTATTTCT1 司A・3’ ＊＊ M2 5－G’GTCACAAgcAAAACTgcTTfC ’ffA ・3’ ＊ ＊ ＊ ＊ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 11 2 h V S -S I F I配列を含む2本鎖のオリゴヌクレオチド（WT;Cdx-A ）をプローブとして，［yぉ] AP TP でラベルし核蛋白と反応 させた。核蛋白はCOS-7 細胞に-2xdC 発現ベクターをトランスフェクションして強制的に発現させたものを用いた。rotitepmoc は右図に示す種々のオリゴヌクレオチドを用い，競合阻害実験を行った 。 40 60 % ofWT S-1IF h V S -S I F l配列を含むpb25 のオリゴヌクレオチドCdx・, CAGx-d の2種類を作成 し，それぞれをsepreh suriv enidimyht esanik 遺伝子プロモータ 二の上流につな いだリポーターベクターを作成した。 COS-7 細胞にCdx 2発現ベクターとリポー ターベクターをそれぞれトランスフェクションし48時間培養後，ルシフエラーゼ 活性を測定した。 ＊p<0.05 図4. SIFhVD- lにおける多型のプロモーター活性への影響 内 必 ロ 胃 品 』 叫 C ＋

同

町 A ロ 玄 訓 山 山 c ＋

－

T 二町一

u

zL

一

T 弓 剖 」 C 一 一 口 一 AA

－ －

G 一 品

＝

P

一

A

＝

Ju

一

A 品 川 ιC 一 T － 1 G

4

℃

dx・A

片

岡

-}icuL! ~ ATAAAAACTTAT

。

2 0 考 察 今回，ヒト VDR 遺伝子において，腸管特異的発現を 規定する;ntmelee-sci h VD-SIF 1配列上に多型を見いだ ＊ し，骨密度との関連性およびVDR の発現 機：能について干食言すした。Cdx-2 のコンセン サス結合配列である ATAAA 型（Cdx-A 型）を有する配列と， Aがgに変異した gTAAA 型（Cdx-G 型 ） が 多 型 と し て 存 在することが明らかになった。 hVD-SIF 1 の領域は，esatlamosi-esarcus 遺 伝 子 や l a c t a s e -p h l o r i z i n sedrolahy 遺 伝 子 の プ ロ モーター上に見出されているSIF 1配列に 類似しており（図l），この領域に腸管特 異的転写因子Cdx-2 が結合することで， 転写を促進する9。 今回の多型において，） Cdx-G 型はCdx-A 型に対して，転写因子 Cdx-2 との結合能および転写活性が共に有 意 に 低 値 を 示 し た 。 hVD-SIF l配列； 5－’AT AAAAACTTT AT-3 ’には， Cdx-2 が二量体を形成して結合する。この領域に，変異を導入 したオリゴヌクレオチドを作成して，ゲルシフト法を 行ったところ， 5－’ATAAA-3 ’配列が最も重要であるこ とが明らかになった。 よって， 5’側のAがGに変異す 80 100

るhVD-SIF 1多型は，腸管でのVDR の発現を調節する と考えられた。 小腸上皮細胞において，細胞内でのカルシウム輸送を 行うカルビンデインD 9 K (CaBP 9 K）および細胞外 へのカルシウムの排出に関与するカルシウムポンプは 1 , 25(0H)2D3 依存的に発現を調節されている,01 11。 中で） もCaBP 9 K はその遺伝子のプロモーター領域にVDR が結合するビタミンD 応答配列（VDRE ）が存在して いる,2131。 このように） VDR の腸管での機能はカルシ・ ウム吸収に関連した一連の輸送タンパクの発現を規定し て い る と 考 え ら れ る 。従 っ て 今 回 見 い だ さ れ た hVD-SIF 1多型は腸管におけるカルシウム吸収に影響を 与 え て い る も の と 思 わ れ る 。 また高齢者では，血清 1 , 25(0H)2D3 レベルの減少やカルシウム吸収能低下が知 られている61-41 。 さらに，閉経後骨粗怒症は，閉経を迎） えることで，エストロゲンの低下や, 25(0H)2D1 3の反応 性の低下，またVDR の発現の低下に伴い腸管でのカル シウム吸収低下を示し，骨密度の減少にいたると考えら れる71日）。 最近，エストロゲンが腸管でのVDR の発現 を増加させることが報告された02）。この興味深い報告か ら，我々はhVD-SIF I多型による骨密度の差異が，閉 経前女性にはなく 閉経後女性に認められる理由ではな いかと考えている。 我々のグループはこれまでに VDR 遺伝子の翻訳開 始点において， ATG (M 型）およびACG 型（m 型） の遺伝子多型を見いだし報告した。 M 型ではBaker ら が示した従来の翻訳開始部位より1 J, m2 型では9bp 下 流に存在する ATG より翻訳が開始されるため，合成さ れるタンパク質のサイズが異なり M 型に比べm 型の 方が標的遺伝子の転写活性および閉経前の女性の骨密度 ともに有意に高値を示すことを報告した22）。しかしなが ら，閉経後の女性では骨密度は有意な差は認められな かった口この遺伝子多型と骨密度との関係は各国で追試 検討が行われているが我々の知験と同様な結果が得ら れている3 -226。 最近の報告によるとこの翻訳開始部位の） 多型と腸管でのカルシウム吸収に相関が見られることが 報告された72）。すなわち 翻訳開始部位多型と今回見い だしたhVD-SIF 1多型との組み合わせによって，カル シウム吸収や骨密度をより正確に推定できることが考え られる 。 現在までにVDR 以 外 に エ ス ト ロ ゲ ン 受 容 体28）やコ ラーゲンタイプ92I ）および-LI 6遺伝子03）をはじめ，骨 代謝に関係する遺伝子の多型と骨密度の関係が報告され ている。しかし，これらの遺伝子多型と骨密度の関係は， 研究によって結果はまちまちである 。今後はVDR 遺伝 子多型を考慮した，骨粗緊症予防に対するカルシウムや ビタミンD の効果を検討することが重要と思われる 。 文 献 1 . McKey, .H,.A,yeliaB ,.A.D ,nosnikliW ,.A.A ,tonusHo C . S. : lailmiaF camparison bone fo ralmine ytsiend a t

teh ailmroxp femur and lumbar .enips e.noB ,.reniM 2

4

: 9,071-5 9419

2. ,ylleK ,J.P Nguyen, ,.T e,rppoH

J

吋,koccoP ,.N te.la :

Changes ni laixa bone yitnsed with :.ega A twin s t u d y . .Je.Bon .erinM ,.seR 8 : 1,71-1 9391 3 . S,serwo M. ,.R ,kenheoB ,.M ,

J

chsuanna M. ,.LcturC 凶,dle M . , ate:.lytilailimaF and gninoititrap ehtytilibairav fo f e m o r a l bone alrenmi ytisned women ni cgnfiroaeb-dlih a g e . .ficlaC .eussiT ,.tnI 50 : 110 ・,411 9291 4. ison,Morr AN. ,. ,QI ,.C.J ,aitokT ,.A ,lyElK .P

,

.

J

te a l . : nioctdierP bone fo ytinsed from nitamiv D r-e c e p t o r .selella re,uatN 367 : 2,8724-8 9419 5 . Huang, C.Y,. ,eeL ,.S,zlotS ,.R,sedileirbaG ,.C ate:.l E百tce hormones fo and development on the -esrxpe s i o n tfo eh tar ,1 25-dihyroxyvitamin D3 rtorcepe g e n e . .J.loiB hem.,C 462 : 1,16471-4547 8919 6 . Yamamoto, ,.H Miyamoto, ,.K,gniliaB ,.iL ,nitakeTa Y . , ate.l : The detarer-laduac homeodomain niteopr Cdx- 2 resatuleg intamiv D rrotpece gene s-reexp s i o n tni eh llmas .enitsetni

J .

e.noB .erniM ,.seR 41 : 2 4 0 -2 4 7 , 1 9 9 9 7 . r,eibrehSc ,.E ,siathatM ,.P ,relluM M.M. ,renffahSc W. : Rapid onitcetde ofo meract gnidinb snietorp thwi m i n i -e x t r a c t s , paredrep from a sllam number cfo.slle N u c l e i c . .dicA ,.seR 71 : 6,194 9981 8 . T,niaetka ,.Y Segawa, ,.H ,iroamkihC ,.M ,atiroM ,.K e t a.l : noiatlugeR tfo epy IIlaner Na+ -tnepended iP t r a n s p o r t e r by 1, 25 (3.2D)HO .loiB.] Chem., 273 : 1 4 5 7 5 -1 4 5 8 1 , 1 9 9 8 9 . S,hu ,.E ,nehC ,.L,rolyaT ,rebarT,.] .P:.G A homeodomain p r o t e i n detaler cot ldaua setaluger cificeps-enitsetni g e n e .noitpircsnart .loM .lleC,.loiB 41 : 7,1573-043 4919 1 0 . ,tsroH .R,.L,ffoG .J,.P ,trdanhieR A.T. : Advancing age stluser tni eh noitcduer ifolanitsetn and bone

2 3 0 1 ,nimaitvxyoryhid-52 D r.rotpece ,ygolonircodnE 621 : 1 0 5 3 -1 0 5 7 , 1 9 9 0 1 1

. Houward, ,.A ,nogeL .S .,ertlaW .J:.R Human and tar i n t e s t i n a l plasma membrane muiclac pump .smrofosi Am. .,.JloisyhP 265: 2,57-9G19 9319 1 2 . ,wishDar M ..H . DeLuca. F.H : . ssilynaA bfongidin fo 1 , 25-dihyroxyvitamin D3 rreptoec potevitiso and n e g a t i v e nmiaitv D rseonpse .stnmeele .chrA m.cheBio B i o p h y s . , 51 : 2,3423-2 6199 1 3 . ,iL .Y..C.orriP E ..A . Demay, M. B:. sislyanA vfonimait D dependent gnnid-biumlicac ineotpr messenger r i b o n u c l e i c dica noisserpxe mni eci gnikcal eht niamtvi D r e c e p t o r . ,ogyolinocrndE :193 ,5187-84 9819 1 4

. Armbrecht, ..J.H ,ztolB M.A .. Wongsurawat, :.N E x p r e s s i o

n pfoalasm membrane muiclac pump mRNA i n rtae:.enitsetni 旺tce afo ge and ,1nimatiyvxoryhid-25 D . B.imhoci s.yphoBi Acta ..9511 : 101 ,411 4991 1 5 . ,ganiL .C T .. ,senraB .J .Imanaka, .S .DeLuca, :..FH Alterations ni mRNA expression fo duodenal 1 , 25-dihydroxyvitamin D3 rtorpece and minvita D-dependent miucalc gnidnib neitorp aged ni rstaWi r a t s . p.Ex ..lotneneG : 192 ,618-97 4991 1 6 . ,llessuR J.E .. o.otrmioM .S .,egirB .S.J .,otsuaF ,.A te a l . : stceffE age fo and negorset on cmiucla -rpbsoa t i o n tni he .tar .Je.onB .reinM Res .. 1 : 1,981-58 6981 1 7 . ,iranneG ,.C.iedsungA D ..,idraN ,.iPlletiviC R: ngeorstE preserves a normal lanitsetni responsiveness ot 1 ,niamityvxorydihd-52 D3 i ondezimtocerohpo women. J ..nilC .lonicrodnE ,.bateM 17 : 1,3921-882 9019 1 8 . ,illetiviC ..R Agnusdei, ,.D i,adNr ,.P e.ichcaZ :.F E f f e c t

s one-year fo treatment with estrogens on bone mass, lanitsetni calcium n,ioptsorab and 25 h y d r o x y v i t a m i n D-1 aphla 幽esalyxordyh veeresr ni p o s t m e n o p a u s a l women. .ficlaC eussiT ,.tnI 2 : 74 -7 8 6 , 1 9 8 8 1 9 . n.ahC .S H ..D .,uihC .D.K..H A也血,s:.D ymtcehropoO sdael t o a sevitcele esaerced lnoreificlacel,ohcy1xordyhid-52 r e c e p t o r s ni tar lanujej suolliv .sllec .nilC icS.. : 66 7 4 5 -7 4 8 , 1 9 8 4 2 0 . ,leiL ,.Y y,hnaS .S .Smirno 妊，,.P z,rtwachS : .B enogtrEs i n c r e a s e s ,1 25-dihydroxyvitamin D rsoreptec -xe p r e s s i o n and senpoesroib tni eh tar anlduode sa.comu E n d o c r i n o l o g y , 041 : 280 ,582 9919 新 井 英 一 他 2 1 . r,keaB A.,.R ,ellcDonnM P.D,. hes.Hug M ..,psirC .T M .

, ate:.l Cloning and expression ffohtngel-llu cDNA encoding human nmiativ D r.rotepce .corP N a t l . cad.A .icS .,USA : 358 ,89324-92 8891 2 2 . .iarA H .. Miyamoto. ..K .nietaakT Y .. Yamamoto. H .. e t a.l : A vnmitai D rroptcee gene polymorphism ni t h e oniatrnsatr noitaitini codon: tceffE on pnietor a c t i v i t

y and noitalre bone ot ityensd Japanese ni women. .J.neBo r.neiM Res .. 12: ,2195-19 7919 2 3 . ,ssorG ,.C,llahselccE .T,.R ,yolalM J.P.. .zuL .alliV M .. e t a.l : The enseresp a polymorphism fo tta eh -snart l a t i o n noitaitini etis tfo eh inamitv D rroptece eneg i

s iatedassoc with low bone mineral tydensi ni p o s t m e n o p a u s a l Mexican-American women. .J.enoB M i n e r . ,.seR 11 : 1,558-1058 9691 2 4 . ,sirraH .SS...llahselccE .T..R.ssorG ..C DawsonHughes, B . , ate.l : The mniativ D roreptce trats codon -ylop morphism )kl(Fo and bone mineral itydens ni premenopausal American kacbl and white women. J . .oneB .rneMi ,.seR 21 : 1,8401-340 7991 2 5 . .llahselccE .T..R Gamero, P ...ssorG ..C s.maDel .P,.D e t a:.l Lack noitalerrocfo between trats codon -ylop morphism tfo he nmitavi D rrtoepec gene and oneb m i n e r a

l tysiend ni premenopausal French women The OFEL Y s.dytu .J Bone. r.ienM Res .. 31 : 3-1 3 5 , 1 9 9 8 2 6 . .irarreF .S ..ilozziR ..R Manen. D .. m.nasolS D吋t ae:.l

Vitamin D receptor gene trast codon polymor -phisms l)kFo( and bone mineral :ytinsed -retnI a c t i o n ithw ,ega yrateid .muiclac and 3－’end noiger p o l y m o r p h i s m s . .J.eonB .reniM Res .. 31 ,0: 939-52 8991 2 7 . Ames, .S..K.sillE J.K.. Gunn. .S..K .dnalepoC C.K,. e t a:.l minVita D rrotpece gene FokI smlomorphiyp p r e d i c t s miulcac onitporsba and bneo lraenim ytisned i n c.nerdlih .J.neBo .rneiM ,.seR 41 : 7,647-04 9991 2 8 . Kobayashi. S .. .uenoI .S ..isooH T .. .ihcuO Y .. ate:l A s s o c i a t i o n bone fo alminer ytisned with -ormlypo phism tfo he neogtrse rotpecer .eneg .JBone .reniM Res .. 11 : 31,1-360 9619 2 9 . .tnarG .S,.F ,dieR .D ,.M ,ekalB ,.G .derH .R te:.la Reduced bone yitsnde and sisoropoetso detaicossa w

i t

h a pphicolymor Spl gnidnib etis ni ehtnegalloc type I alpha 1 gene ..Nature ,sicteneG 14: -302

205,1996

30. Tsukamoto, K., Yoshida, H., Watanabe, S., Suzuki, T .. et al.: Association of radial bone mineral density

with CA repeat polymorphism at the interleukin 6 locus in postmenopausal Japanese women.

J.

Hum. Genet., 44 : 148-51, 1999

The polymorphism in the caudal-related homeodomain protein Cdx-2 binding element in

the human vitamin D receptor gene

Hidekazu Arai, Michiko Yoshida, Hironori Yamamoto, Kyoko Morita, Ken-ichi Miyamoto, and

Eiji Takeda

Department of Clinical Nutrition, The University of Tokushima School of Medicine, Tokushima (Director : Prof Eiji Takeda)

Megumi Kubota, Shigeko Yoshida, and Mikiko Ikeda

Department of Nutritional Science, Faculty of Health and Welfare Science, Okayama Prefectural University, Okayama

SUMMARY

The major physiological activity of 1,25-hydroxyvitamin D3 (l,25(0H)2D3) is the regula-tion of calcium absorpregula-tion in the small intestine, and the level of vitamin D receptor (VDR) is an important factor in this regulation. In a previous study, we demonstrated that the caudal-related homeodomain Cdx-2 played an important role in the intestine-specific tran-scription of the human VDR gene. In the present study, the polymorphism was identified in the core sequence 51

-AT AAAAACTT AT-3' in the Cdx-2 binding site in the VDR gene promoter. In 261 Japanese women with genotyped VDR polymorphisms, 48 were genotype Cdx-A (adenine at-3731 nt relative to the transcription start site of human VDR gene, 51_{-A_ T AAAAACTT AT'-3'), 82 were genotype Cdx-G (guanine at-3731 nt, 5'-~TAAAAACTT AT-3'),}

131 were genotype Cdx-A/ G (heterozygote). The bone mineral density (BMD) in the lumbar spine (L2-4) with the Cdx-A homozygote was 12% lower than that with the Cdx-G homozygote

(P <0.05). In electropholertic gel mobility shift assay, the oligonucleotide with Cdx-G allele markedly decreased the binding to Cdx-2 compared with that in the Cdx-A allele. The transcriptional activity of the VDR promoter with Cdx-G allele was decreased to 70% of the Cdx-A allele. In addition, in the herpes simplex virus thymidine kinase promoter, the Cdx-2 binding element with the G allele showed significantly lower transcriptional activity than that of the A allele. Thus, the polymorphism in the Cdx-2 binding site of the VDR gene (Cdx-polymorphism) would affect the expression of VDR in the small intestine. In addition, this polymorphism may modulate BMD in postmenopausal Japanese women.

Key words: vitamin D receptor (VDR), polymorphism, bone mineral density (BMD), caudal-related homeodomain Cdx-2