doi : 10.3136/nskkk.63.464 http://www.jsfst.or.jp
研究ノート
エダマメ栽培温度がマルトース生成量に及ぼす影響
†野村知未
1，松井元子
2，大谷貴美子
2，村元由佳利
3，古谷規行
4* 1元京都府立大学大学院：（現）広島女学院大学人間生活学部管理栄養学科 2京都府立大学大学院生命環境科学研究科応用生命科学専攻 3京都府立大学生命環境学部食保健学科 4元京都府農林水産技術センター生物資源研究センター：（現）京都府山城北農業改良普及センターEffect of Growing Temperature on Maltose Production of Green Soybean
Satomi Nomura1, Motoko Matsui2, Kimiko Ohtani2, Yukari Muramoto3and Noriyuki Furutani4*
1Former: Graduate School of Life and Environmental Sciences, Kyoto Prefectural University, Present: Faculty of Human Life Studies, Hiroshima Jogakuin University,
4-13-1 Ushita Higashi, Higashi-ku, Hiroshima, Hiroshima 732-0063 2Graduate School of and Environmental Sciences, Kyoto Prefectural University,
1-5 Hangi-cho, Shimogamo, Sakyo-ku, Kyoto, Kyoto 606-8522 3Faculty of Life and Environmental Sciences, Kyoto Prefectural University,
1-5 Hangi-cho, Shimogamo, Sakyo-ku, Kyoto, Kyoto 606-8522
4Former: Biotechnology Research Department, Kyoto Prefectural Agriculture, Forestry and Fisheries Technology Center, Present: Kyoto Prefecture Institute, Agricultural Yamashiro Extension Center,
1 Tanabemyota, Kyotanabe, Kyoto 610-0331
The present study examined the effect of three growth temperatures on the starch gelatinization temperature and β-amylase activity of two cultivars of green soybean in experimental plots. The β-amylase activity of Fuki at climate chamber of 25℃ was significantly higher (p<0.01) than that grown in a field. On the other hand, we found no significant difference between three plots of Shin-tamba-guro upon comparison of their β -amylase activities. However, when comparing the starch gelatinization temperature, the values for the three plots were significantly different (p<0.01): gelatinization temperature increased with a rise in growth temperature. Thus, we suggest that the production of maltose in green soybean is affected by temperature during the ripening process.
（Received Mar. 22, 2016 ; Accepted Jun. 22, 2016）
Keywords : green soybean, maltose, β-amylase, growth temperature, starch gelatinization temperature キーワード : エダマメ，マルトース，栽培温度，β-アミラーゼ活性，糊化温度 エダマメは，日本や中国・台湾で主に食されており，国 内では夏から秋にかけての代表的な野菜として地位を築き 上げている．2000 年代に入るとエダマメは「世界の食べ 物」1）と位置付けられ，さらなる良食味品種の育成が国内 各地で行われている．良食味のエダマメの品種育成では甘 味・旨味を呈する遊離糖量や遊離アミノ酸含量が重要視さ れ，それらの成分はエダマメの食味に大きく影響する．エ ダマメには，アラニンなどの甘味を呈す遊離アミノ酸を含 むことが報告されているが，アミノ酸含量に比べて，糖量 はゆで加熱後で約 2 g∼6 g/100g-f.w.2）∼4）と非常に多くエダ マメの食味に大きく関与する．その中でも含有量が最も多 いスクロースは，エダマメの食味向上にとって欠かせない 要因である1）．ゆで加熱後の糖の約 60 % を占めるスクロー ス5）は，収穫後，エダマメの呼吸に利用されるため常温で は急激に低下する6）．そのためスクロースの減少を防ぐた めに流通時の徹底した温度管理や，青果物自身の呼吸を低 く抑え品質低下のスピードを遅延させる P-プラス（住友 ベークライト株式会社）などの鮮度保持フィルム7）8）の導入 が不可欠である．一方，マルトースはエダマメが持つ β-アミラーゼによって加熱中に糊化デンプンに作用して生成 され2）9），流通時の保存温度にあまり影響されない10）．そのた め，調理後の糖の増強，補強が期待されるものの，品種2）や 作期4）によって生成量が異なることが報告されている． 京都のブランド野菜の丹波黒大豆エダマメ「紫ずきん®」 1〒732-0063 広島県広島市東区牛田東 4-13-1，2〒606-0823 京都府京都市左京区下鴨半木町 1-5 3〒606-0823 京都府京都市左京区下鴨半木町 1-5，4〒610-0331 京都府京田辺市京田辺明田 1 *連絡先（Corresponding author），n-furutani03@pref.kyoto.lg.jp
は，加熱中にマルトースを生成することが報告2）されてお り，早生品種から順に 紫ずきん 2 号，紫ずきん，新丹波 黒 で構成される．紫ずきん 2 号 は，他の 2 品種と異なり マルトース生成量の年次変動が著しく，古谷等3）は，紫ず きん 2 号 の子実肥大期が 8 月の高温期となるためデンプ ンの糊化温度や β-アミラーゼ活性の変動によるものであ ると考察している．我々はこれまでに，エダマメを加熱中 に生成されるマルトースの量は，デンプン量と有意な相関 はなく，品種による β-アミラーゼ活性の強さとデンプン の糊化温度が関与していること，また，新丹波黒 のマル トース生成能は高く，一方でマルトースの生成を検出でき なかった品種があることを報告2）した． そこで本研究では，先行研究2）にてマルトースは生成さ れずスクロース含量が高かった高スクロース型9）の 富貴 と，マルトース生成量が高かったデンプン型9）の 新丹波黒 を試料として栽培温度がエダマメのマルトース生成量に及 ぼす影響について検討した． 1． 実験方法 （1）材 料 2012 年に京都府農林水産技術センター・生物資源研究セ ンターのほ場で栽培された丹波黒大豆エダマメの 新丹波 黒 および黄大豆エダマメの 富貴 の 2 品種を用いた．こ のほ場区に加えて，栽培温度の違いによるマルトース生成 量の変動を把握するため，さらに，ほ場より高温のビニル ハウス区11）12）（換気扇設定温度 35℃）と，25℃に制御したガ ラス人工気象室区（以下，25℃区）の 3 区で栽培し，適期に 収穫したエダマメを試料とした． 各々のエダマメは，収穫適期に達したところで速やかに 収穫・脱莢し 新丹波黒 は沸騰後 10 分，富貴 は 6 分ゆで た後，直ちに実験に供するまで−30℃で冷凍保存した． （2）遊離糖の分析 遊離糖の分析は，前報2）と同様の方法で行った．すなわ ち，上記の凍結保存サンプルを 8 倍量の 80 % エタノール 中で粉砕抽出し，遠心分離後の沈殿物を再度 8 倍量の 80 % エタノール中で撹拌抽出し，遠心分離した上清をメンブラ ンフィルター（0.45 µm）で濾過し，抽出は 3 反復行った． 得られた抽出液は，示差屈折計検出器（RID）を装着した 高速液体クロマトグラフ（1260Infinity/Agilent technol-ogies，カラム：Asahipak NH2 P-50 4E/Shodex，カラム温 度 40℃）を用いて分析した．移動相は，70 % アセトニトリ ル（流速 1.0 ml/min）を用いて分離した．標品としてフル クトース，グルコース，スクロースおよびマルトース（和 光特級/Wako）を使用し，各遊離糖の含量に関する検量線 を作成して 4 種の糖の定量に用いた． （3）耐熱 β-アミラーゼ活性の測定 β-アミラーゼの活性は，前報2）と同様に，Betamyl-3Ⓡ キット（Megazyme/Bray）を用いて測定を行った．エダ マメ子実に 1 M Tris/HCl 緩衝液（pH 8.0, 20 mM EDTA, 0.02 % アジ化ナトリウム含）を加えホモゲナイズし室温で 1 時間撹拌抽出した．その後懸濁液を遠心分離（15 000 rpm，常温，10min）し，得られた上清を粗酵素液とした． 基質の p-ニトロフェニルマルトトリオースに抽出した粗 酵素液を加え 60，65，70，75℃の各温度で 10 分間反応させ た．その後 1 %（w/v）Trizma-base を加えて反応を停止し， 解離した p-ニトロフェノールを 400 nm で測定した．結果 は，1 分間に基質から 1 µmol の p-ニトロフェノールが解 離した量を 1unit とし，エダマメ重量当たりの β-アミラー ゼ活性を比較した．なお，抽出した粗酵素液は，分析に用 いるまで−30℃の冷凍庫で保存し，測定は 3 反復行った． （4）デンプンの分画 デンプンの分画は，Matsunaga 等13）の方法で行った．つ まり，エダマメを 10 倍量の 0.05 M の水酸化ナトリウム中 で粉砕し懸濁させることにより除タンパクした．その後， 沈殿物を蒸留水に懸濁させさらに 1 時間撹拌させた．沈殿 物に再び蒸留水を加え 0.1 M の塩酸で中和した後そのまま 撹拌を 1 時間行い遠心分離（5 500×g，10min）した．その 後，沈殿物を蒸留水に懸濁させ撹拌し洗浄して 355 メッ シュ（東京スクリーン株式会社）に通し，30℃のオーブン （DRYING OVEN Mov-112/SANYO）で 24 時間乾燥させ た．なお，Matsunaga 等の方法は，中和により生成された 塩を除去するために十分な洗浄が行われるため，デンプン 糊化温度へのナトリウムの影響はなかった14）といえる． （5）示差走査熱量測定（DSC） 無水単離デンプン 4 mg および蒸留水 20 µl をサンプル パンに封入し，示差走査熱量計（DSC-60/SHIMADZU）を 用いて分析した．昇温速度は 2℃/min とし，対照として水 20 µl をサンプルパンに注入したものを用いた．DSC の特 性値として糊化の開始温度（To），ピーク温度（Tp），終了 温度（Tc）を求めた． （6）統計処理 新丹波黒 および 富貴 各々の品種について，栽培温度 が異なる 3 区のエダマメの遊離糖量，デンプン量，糊化温 度，β-アミラーゼ活性（unit）の値についてはエクセル統 計 Statcel3 アドインソフト（オーエムエス版）を用い，一 元配置分散分析後，Scheffe の F 検定を行った．また，各 栽培条件下における 2 品種の差異は，student の t 検定を 行った． 2． 実験結果 （1）エダマメの子実肥大期と温度 ほ場で栽培された各エダマメの開花日および収穫日，子 実肥大期の最高気温および最低気温の平均値を Table 1 に 示した．エダマメ子実は，受精後，莢の伸長が始まり一定 の長さとなった後に充実し，子実が肥大し始めるのは 富 貴 のような早生エダマメは開花日から数えて約 20 日 後15）より，新丹波黒 のような晩生エダマメは開花より約 40 日後16）である．また，デンプン蓄積が顕著となる時期が
子実肥大開始時期と一致する1）17）．これらのことから，本研 究では，夏エダマメの 富貴 は開花日より数えて 20 日後 から収穫日までの 15 日間を，新丹波黒 は開花日より 40 日後から収穫日までの 25 日間を子実肥大期と定めた． 子実肥大期のほ場の最高および最低気温を比較したとこ ろ，両者とも最高および最低気温の差は約 10℃であった が，新丹波黒 の子実肥大期の最高および最低平均気温は 富貴 に比べて約 5℃低い結果となった．高温のビニルハ ウス区は，ほ場区よりも最高気温の平均値で 新丹波黒 は 4℃，富貴 は 5℃高くなったが，最低気温の平均値では両 品種とも 2℃しか高くならなかった．25℃区は，ほ場区よ り最高気温は 新丹波黒 で 4℃，富貴 で 9℃低くなった． 一方，25℃区の最低気温は，ほ場区よりも 新丹波黒 で 9℃，富貴 で 2℃高くなった． （2）遊離糖量 生およびゆでエダマメの遊離糖量の結果を Fig. 1 に示し た． 両品種ともに，栽培条件が異なっても生エダマメにおい てスクロースが遊離糖量の約 90 % を占めていた．全遊離 糖量は，新丹波黒 では，ビニルハウス区（2.47 g/100g-f.w.） >ほ場区（1.69 g）>25℃区（1.59 g）であり，富貴 におい てもビニルハウス区（2.40 g/100g-f.w.）>25℃区（2.39 g）> ほ場区（2.27 g）の順となった．ゆでエダマメでは，富貴 のビニルハウス区以外のエダマメでマルトースが生成さ れ，新丹波黒 は，ほ場区>ビニルハウス区>25℃区の順 となりほ場区とビニルハウス区では有意な差は認められな かった．一方，富貴 は 25℃区>ほ場区>ビニルハウス区 の順となり 3 つの栽培条件で有意に（p<0.01）マルトース の生成量が異なった． （3）β-アミラーゼ活性 栽培温度の異なる 2 品種のエダマメの β-アミラーゼの 温度依存および活性の強さを比較し，Fig. 2 に示した． 前報と同様に，各々のエダマメから抽出した粗酵素液と 基質の p-ニトロフェニルマルトトリオースを 60，65，70， 75℃で反応させた場合 65℃で最大値を示し後，70℃から 減少し始め 75℃では急激に減少した．この傾向は，栽培条 件を変えても変化は認められず，ほ場区，ビニルハウス区 および 25℃区において同様だった． 新丹波黒 の場合，いずれの栽培条件においても酵素反 応の各温度で活性の強さに有意な差は認められず，ほぼ同 等の値を示した．しかし，富貴 の場合では，3 つの栽培条 件において β-アミラーゼ活性の強さは有意に異なってお り，最大活性を示す 65℃に着目すると，25℃区（416U）> ほ場区（309U）>ビニルハウス区（251U）の順で活性は異 なった．また，富貴 の β-アミラーゼ活性を 65℃の最大 値（=a）を 70℃の値（=b）で割ったものを低下率（=b/a ×100）とした場合，25℃区（80 %）>ほ場区（78 %）>ビニ ルハウス区（71 %）となり，富貴 は栽培条件によって β-アミラーゼ活性の低下率が違っていた． （4）デンプンの糊化温度 エダマメの単離デンプンの糊化特性を DSC で調査した （Table 2）．品種および栽培条件に関わらず単一ピークを 持つ曲線が得られた．糊化開始温度，ピーク温度，終了温 度供に 2 品種で差が認められ，通常栽培条件のほ場区にお いて，新丹波黒 の糊化ピーク温度は 富貴 に比べて有意 に（p<0.01）低く，約 12℃異なった． さらに，2 品種ともに Table 1 に示したように，子実肥 大期の気温が異なることで同品種であっても，糊化温度に 差が認められた．糊化ピーク温度（Tp）は 新丹波黒 では 25℃区（70.2℃）>ビニルハウス区（60.2℃）>ほ場区（58.9 ℃）となり 25℃一定で栽培した際に最も高かったが，一方， 富貴 ではビニルハウス区（72.8℃）>ほ場区（71.1℃）>25 ℃区（68.6℃）となり 25℃一定条件で栽培したエダマメデ ンプンの糊化ピーク温度が最も低い結果であった． 3． 考 察 本研究で用いたエダマメ品種の夏エダマメの 富貴 は， スクロース含量が高い2）ものの，通常の栽培条件ではマル トースはほとんど生成されないことが明らかとなってい る．本実験において通常の栽培条件（ほ場区）では，0.30 g/100g-f.w.とわずかに生成が認められたが，ビニルハウス 区では検出されず，逆に 25℃区では 1.19 g/100g-f.w.生成さ れた．加熱によるマルトース生成には，β-アミラーゼが失
Table 1 Green soybean samples used in this study
Cultivar cultivationconditions Flowering date Harvesting date temperatures during seed filling stageHigh/Low average ambient Field 11 August 11 October 29/16℃
Shin-Tamba-Guro Vinyl House 13 August 11 October 33/18℃ 25℃ 8 August 6 October 25/25℃ Field 24 July 28 August 34/23℃ Fuki Vinyl House 18 July 20 August 39/25℃ 25℃ 12 July 13 August 25/25℃
活する前にデンプンの糊化が開始されていることが条件と なり，糊化温度の低い方がマルトース生成に当然有利とな る．これまでに，米では登熟期ごろ18），サツマイモにおいて は，塊根の肥大期温度19）がアミロペクチン短鎖/長鎖比お よびデンプンの糊化温度に強い相関を示し，側鎖が長くな ると糊化温度が高くなることが報告されている．このよう に，多数の植物においてデンプンの糊化温度が栽培時の気 温に影響しており，エダマメにおいても，デンプンが急激 に蓄積される子実肥大期の温度がデンプンの糊化温度に作 用する可能性が考えられる．本研究において 富貴 をほ 場区より気温が低い 25℃区で栽培した結果，デンプンの糊 化温度が他の試験区よりも有意に（p<0.01）低くなり，マ ルトースが生成されたと示唆された．また，富貴 をビニ ルハウス区で栽培した場合，Table 1 に示したように，3 区 の中で子実肥大期の温度が最も高くなり，糊化温度が有意 に（p<0.01）高くなったと考えられる．一方，富貴 とは 異なり，適期の栽培でマルトースを生成する 新丹波黒 の マルトース生成量は，25℃区のマルトース生成量が最も低 かった（0.78 g/100g f.w.）．新丹波黒 は，子実肥大期の最 低気温が，25℃区よりもほ場区で 9℃，ビニルハウス区で 7℃低いために，25℃区のデンプン糊化温度（To, Tp, Te） は，他の試験区の糊化温度に比べて高くなったと示唆され る． 一方，マルトースを生成させる β-アミラーゼについて も，栽培温度を変えたことにより違いが認められた．犬飼 等20） は，サツマイモ塊根の場合，栽培温度を下げても，β-アミラーゼ活性の強さは変化しないことを報告している． 本研究において，エダマメ重量当たりのマルトース生成量 に及ぼす アミラーゼ活性を比較したところ，富貴 の β-アミラーゼ活性の強さ（最大活性 65℃時）は，ほ場区より も最高気温が低い 25℃区が，有意に（p<0.01）1.4 倍高い 値を示した．新丹波黒 においては，β-アミラーゼ活性の 耐熱性および強さは，3 区において変化が認められず，新 丹波黒 では 富貴 と異なり栽培温度が β-アミラーゼ活性 に与える影響は小さいことが考えられる．これまでに，稲 において β-アミラーゼはデンプンの代謝に関わる21）こと
Fig.1 Free sugar contents of three growth temperatures in experimental plots in two cultivars （ , ），Field；（ , ），Vinyl House；（ , ），25℃.
が報告されているため，エダマメにおいても β-アミラー ゼ活性に栽培温度が影響する可能性が考えられる． 以上のように，栽培温度がエダマメのデンプンの糊化温 度，エダマメ重量当たりの β-アミラーゼ活性に作用し，マ ルトース生成量に差異が認められた．栽培温度がデンプン の構造に及ぼす影響や β-アミラーゼの内在酵素の種類や 優位性についてはさらなる検討が必要である． 4． 要 約 栽培温度の異なる 3 つの試験区でエダマメ 2 品種を栽培 し，マルトース生成量に関与する β-アミラーゼ活性およ びデンプンの糊化温度の影響を検討した．富貴 は，子実 肥大期の温度が低い 25℃区がほ場区に比べて，β-アミラー ゼ活性の強さが有意に（p<0.01）高くなったが，新丹波黒 の場合，栽培温度の違いにより活性の強さは変化しなかっ た．一方，デンプンの糊化温度は両品種供に 3 つの試験区 で有意に（p<0.01）異なり，子実肥大期の温度が高いほど 大きく上昇した．これらのことから，エダマメ加熱後のマ ルトース生成量は，子実肥大期の温度に大きく影響を受け ることが認められた． 最後に，本研究を進めるにあたり京都府立大学大学院生 命環境科学研究科故本杉日野教授にご協力頂いた．また， DSC 分析には畿央大学健康科学部岩城啓子教授にご協力 頂いた．ここに記して心より感謝申し上げる． 文 献 1） 笹原健夫，作物としての特性，「農業技術大系野菜編 10 マ メ類・イモ類・レンコン」追録第 25 号，（農山漁村文化協 会，東京），pp. 1-14 (2000).
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(f.w.) of three growth temperatures in experimen-tal plots in two cultivars
，Field； ，Vinyl House； ，25℃.
Superscript letter indicate the level of significance (*p <
0.05，**p<0.01).
Table 2 Gelatinization properties by DSC of starches from Edamame different cultivars or environment
Cultivar cultivationconditions *）Endothermic transition（℃） To Tp Te
Field 55.4a±0.1 58.9a±0.1 64.3a±0.1
Shin-Tamba-Guro Vinyl House 56.2a±0.2 60.2b±0.1 65.3b±0.2
25℃ 66.0b±0.5 70.2c±0.1 73.5c±0.1
Field 66.8b±0.3 71.1b±0.1 75.3b±0.5
Fuki Vinyl House 68.4c±0.3 72.8c±0.0 76.9c±0.1
25℃ 62.3a±0.1 68.6a±0.1 73.3a±0.4 *）Each value showed mean±S.D.
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