義 診 断的意 関す 研究 十 指 腸 液 中 痛遺 伝 子 変 検 異 出

金沢大 学 十 全 医学 会雑 誌 第1 0 7巻 第5号 3 4 5 ^‑ 3 5 6 (1 9 9 8)

十^二指腸液中^{K 刊 那} 痛遺伝子変異^の検出^と その診断 的 意義^に関 す^る研 究

金沢 大 学^{が ん}研 究 所 腫 瘍 制御 研 究 部 門 腫 瘍 内 科 ( 主任^: 澤 武 紀 雄 教授)

阿 依 古策 略

3 4 5

内 視 鏡下経 乳 頭 的^に膵 管^より 採 取^{し た}純 膵 液^{に おい てK 刊 那 コ ドン1 2の}変 異が膵 癌^で高 率に検 出さ れ る こ と より, 揮液 中K 朝 那変 異^の検 出は膵 癌^の診 断 法と し て大 きな期 待が寄せ ら れ て^いる^. し か し, 慢 性 膵 炎^でも高 感 度な検 出 法 を 用^{いる と}粘 液 細胞 過 形 成^に由来 する K朝 那変 異^の検 出さ れ る場 合があ り, そ^の癖 特 異 性が問 題となっている^. また, 純 膵 液 採 取に は^一 定

の技術 を 要する^のみ で なく, 被 検 者に加 重 な負 担 を 与 え^る. そ^こで, 誰^{に で}も 容 易^に採 取^でき^る十^二指腸 液^{に おいて K 刊 那 コ} ド^ン1 2 ^の変 異 を3 種^の検 出法 を 用^いて検 討し, 膵 胆 道 痛^の診 断に おいて^いかなる意 義 を 有 す^{る か}を 明ら か に し ようとした^. 内 視鏡 的逆 行 性 胆 道 膵 管 造 影 (^{e ndo s c o}pic r etr og^{r a}de cholan gi ^opa n c r e atogr aphy, E R C P) 後^{スコ ー プの}吸 引 装置 を 利 用し て回 収し た十二指 腸 液より 抽 出し た D N A に お^いて変 異^{ア レ ル}特 異 的 増 幅 (m utant allele spe ci丘c am pliBc ati_{o n}

, M A S A) 軋 ^{P C R 制} 限酵 素 断片 長 多 塑 分 析 (^{P C R r e strictio n fra}gm e ntle ng th polym o rph is m a n alysis_, P C R^‑R F L P) 法^{, ハイ プ1) ダ イ ゼ ー ショ ンプロ} テ ク ショ ン分析 O^ly bri diz atio n pr ote ctio n a s s ay, H P A) 法を用^いて K m s = ド^ン12 の変異^の検 索 を 行^{っ た.} 十^二指 腸 液 中

コ ド^ン12 の変異は膵 癌に お^いて P C R:R F I,P法で 4 2 % (^{1 6}/3 8)^{, H P A}法で 3 7 % (1 4/3 8),M A S A法^{で 6 6 %} (2 5/3 8) に検^{出さ れ た.} また, 胆 道痛で は P C R^‑R F L P 法で 3 2 % (7/2 2), H P A法^{で 3 2 %} (⁷/^{2 2}), M A S A 法^{で 5 5 %} (^{1 2}/^{2 2}) ^に検 出^{さ れ た. 一} 方, 慢 性 膵 炎でもP C R^‑R F I^.P法で 1 6 % (⁶/3 8)^{, H P A}法で 1 3 % (5/3 8), M A S A 法で 3 2 % (12/38) に認め ら れ た が, 胆 嚢 腺 筋 腫 症2 0例, 胆 石症^{2 2}イ軋 対 照群^{2 0}例^{で は P C R,R F L P} 法, M A S A 法^いずれ に ても総て陰 性であっ た. 純 膵 液 中で^のK r a sコ ド^ン1 2 ^の変 異を 検討 する と膵癌で は P C R R F L P 法で 7 8 % (2 9/37), H P A 法で 6 6 % (1 9/2 9), M A S A法で 8 1 % (^{2 6}/^{3 2}) ^に検 出さ れ, 膵 液^に比^し て十^二指 腸 液^{に お}け^る場 合^のほうが, いずれも低 率^であ^った. 以 上^のように, E R C P直 後に膵 癌 患 者より 簡便に採 取し た十二

指腸 液でのK^‑Y u S = ド^ン1 2変 異^の検 出頻 度は, 純 粋 膵 液^の場 合に比し て低^いが, 高 感 度^{のM A S A}法 を 用^{いる と K r a s コドン12}

変 異が かな り 高 率に検 出可能で, 十二指 腸 液 中K刊 那 変異^の検 出は, 膵 癌^のみ な らず 胆 道 痛^{の ス}ク リ ^{ー ニ ン}グ にも 有 用 な^こと が示唆さ れ た^.

Eey ^{w o r}ds K r a s,pa n C r e atic c a n c e r,b ilia ry t^{r a c}t c a n c e r

,du ode n alj^{uic e},pa n C r e aticj^{uic e}

近年各種 画 像 診 断 法^の進 歩や様^々な腫 瘍^{マ ー} カ ^ー の開発な ど に より, ある程 度 進 行^{し た}膵 癌^の診 断 能^は非 常^に向上 し た が,

依然と して早 期 診 断は難しく, 治癒 率^の向上 はあ まりみ ら れ て いな^い. ま た, 膵^生検^は胃や大腸 癌^の場 合^のように容 易に行え な^いた め, 慢 性 膵 炎な ど と^の鑑 別 困 難 例 も少なく な^い. 一っブ,

近年癌^に関 する分 子生物 学 的研 究^の進 歩に より, 膵癌^で種^{々 の} 痛遺伝 子, 痛 抑 制 遺 伝 子 異 常^の発 現 す^{ること が}明^{ら か に さ れ},

軌^こ, ヒトの膵 癌^の大 部 分 を 占め る膵 管痛で K朝 那 コ ド^ン1 2 の

点突然変 異が膵 癌 組 織^{で 7 5 ‑ 1 00 % と}高 率^に発 現 す^{ること が}明 らか に さ れ て^{i)､1 1)}_, 発癌との関わり^のみ な らず, 臨床 応 用^の点 からも 注目さ れ て^いる. 当 教 室で は膵の病 的 状 態で増 加 する物 質^は血 液^より も 膵 液^へより 反 映さ れ易^{い の}で はな^いか と^いう 観 点^より, 十^二指 腸 内 視 鏡下経 乳 頭 的に採 取し た純 粋 膵 液 中^の

種^{々 の}腫 瘍^{マ ー カ ー や}各種生理 活性 物 質 を測 定し, 膵 疾 患^の診 断^へ応 用し ようとする研 究を行^って来た^{1 2､1 4).} こ のような経 験を踏 え^てl 陣 痛 組 織^{で K刊 那 コ ドン1 2の}点 突 然 変 異^が高 率^に 発 現す る^こと に注目 し, セ クレチ^ン刺 激に よ る内視 鏡下経 乳 頭 的^に採 取^{し た}純 粋 膵 液^{に お}ける K刊 那 コ ド^ン1 2 ^の一互突 然 変 異^の 検 出が膵 癌 診 断に有月ヨである^ことを 報 告し てきた^{1 5}､^{1 日)}. こ の

方 法^{で は}十 二指 腸 内 視 鏡下経 乳 頭 的に膵 管に選 択 的に カ^{ニ ュ ー} レを挿人 し, セ ク^レチ^ン刺 激 下に採 取し た純 膵 液 を 使 用 す^るの で, こ のよう な場 合^の術 者は十^二指 腸 内 視 鏡 検 査に関し て経 験

の深^い専 門家^であ^る必 要^があ^る. 加 え^て, 患 者^{に とって}も 加重 な負 担に な る検 査 法である^.

そ^こで, 本 稿^{で は}膵 液^{のみ で は な}く, 胆 汁, 十二指 腸 自 身^か らの分泌 液, 胃液 なども 含 有 す^{る が}, 誰に でも容 易に採 取^でき

平成10 年⁹ 月1 8 日受付, 平 成^{1 0}年^{1 0}月^{2 3} 日受理

A b br e viatio n s : A S O, allele sp^{e c}i負c olig^{o n u c}le otide; A E, a C ridiniu m e ste r; C T, C O m p^uted to m og^{r a}ph_{y ;} E R C P,

e ndo s c opic r etr og^{r a}de chola ngi ^op ^{an C r e a}tOg^{r a}ph_{y ;}H PA ^hybrid iz atio n p^{r o}te ctio n a s s ay; M A S A, m utant allele sp^{e c}i丑c a mplifi c atio n;P T C D ,p^{e r C u}ta n e O u S tr a n Shep^atic th oledo ch al dr ain ag^e;P C RrR F L P, r e Strictio n fr ag^{m e n}tle ng th p^oけ^{m o r}phis m; R u J,r elativ eligh ^{tu ni}t;S S C P, Singl ^{e str and c o nfo r m atio n} p^oけ^{m o r}ph is m

3 4 6 阿 依 苗 麗

る十^二指 腸 液^{に おいて K 刊 那 コ ドン1 2}変 異^の有 無^を検 討^し, 陣 痛^のみ な らず 胆 道 痛^{に おいて}も^いかなる診 断 的 意義を有 す^{る か} を解 明^{し よ}うと し た^. ま た, K 攻が コ ド^ン1 2の検 出法^{に関し て}

は種^{々 の}方 法が試^{み ら れ て}きた が^弼

〜21)

, Naka mu r aら^{2 1)}に より 開 発^{さ れ た}変 異ア レ^ル特 異 的 増 幅 (^{m uta nt allele spe cific}

a mpliAc atio n , M A S A) 法^は検 出 感 度が非常に高^いと言わ れ て^い るも^{の の}, 測 定 条件が微 妙^で, 必 ず^しも普 及^{し てい}な^い･ そこ で, M A S A 法^の有 用 性につ いて, P C R 制 限酵 素 断 片 長多^{型 分 析} (P C R r e strictio n 血^･ag^{m e n}tle ng th polym o rph is m a n aly^sis･ P C R:

R F L P) 法^{や ハ} イ プ リ ダ イ ゼ^ー シ ^{ョ ン}プ^ロテ ク シ ョ ン分 析 Olybrid iz atio n pr ote ctio n a s s ay, H P A) 法^{な ど}他^の方 法とも 比 較

してそ^の有 用 性に^{つ い}ても 明ら か に し よう^{と し た･} 対 象^{お よ}び方 法

Ⅰ. 払r α g変 異の検 出 法に関 する基礎白勺検 討^に用^いた培 養 細

胞株

各検 出 法^の基 礎 的 検 討を行 うた め に, 陽 性^{コ ントロ ー ルと し}

てK r a sコ ド^ン1 2 に G G T‑^{→T G T へ の変 異を有 するヒト由 来 膵}

癌培^{養 細 胞株である PaCa‑2を, 陰 性コ ントロ ー ルと し て K 刊 那}

コ ド^ン1 2 に変 異 を 有^さな^いBxP C^‑3を用^{いた. PaC計2 につ いて} はJ^{C R B} 細 胞^{バ ン}ク (痛 研 究 振 興 財 団^, 東 京) ^より 供 給さ れ,

B_xP C^̲3 につ いて は大日本 製 薬 (大 阪) より 購入 し た^. PaCa^‑2 は D^.M E M 培 地 (大日本 製薬), BxP C^‑3 は R P M I 1 6 4 0培 地 ( 大日本 製 薬) ^に牛 胎 児^血清 ( 大^日本 製 薬) 1 0 % を 加 え^て培 養 液^{に て} 3 7 ℃, 5 % C O2イ^ンキ ^{ュベ ー} タ ^ー 内で培 養し, 十 分 増 殖し た時

点^で珊 胞を回収し た^. I ^. 十^二指 腸 液

1 9 9 4年9 月か ら 1 9 9 8年6月 ま^での間^に金 沢 大 学が ん研 究 所 内 科 及^び関 連 施 設 を 受 診^{し た}膵 癌 患 者3 8例, 慢 性 膵 炎^{3 8}例,

胆 道 癌2 2例, 胆 嚢 腹 筋 腫 症^{2 0}例, 胆 石 症2 2例, 膵 胆 道 系に は疾 患^がなく, 悪 性 疾 患 を 否 定さ れ た比 較 対 照 群^{2 0}例^の合 計 1 6 0 例 を 対 象と し た^. 膵 癌 症 例 中^{2 3}例は, 手 術な^い し剖 検 時

の摘 出標 本^の病 理 組 織 学 的 診 断に よ り確 認^{さ れ た}, 他^の1 5例 は腹 部 超 音 波^と腹 部^{コ ンピ ュ ー タ ー} 断 層 撮 影 (c o m puted to m og^{r a}p y, CT) ^の所 見に加 え, 内 視 鏡 的 逆 行 性 胆 道 膵 管 造 影 (e ndo s c opic r etr og^{r a}de chola ngi ^opa n c r e atogr ap hy^, E R C P) ^の 所 見に より 診 断^{さ れ}, これ らの 膵癌 症 例^{につ い て は}膿 瘍^の大 きさ, 占 拠 部 位, 臨 床 病 期に^{つ い}て膵 癌 取 扱 規 約 ( 膵 癌 研 究 会 編)^{2 2)}に従^い分 類し た^. 胆 道 痛^{につい て は}仝 例 手 術な^いし剖 検 時^の摘 出 標 本につき 病 理 学 的に確 認さ れ た^. 慢 性 膵 炎^につい て は, 日本 膵 臓 学 会^の診 断 基 準^{23 )に}基づき 診 断^{さ れ}, いず^れ も 確 診^{に 一} 致し て^いた^.

十^二指 腸 液^の採 取 方 法^は空 腹 時に十二指 腸 内 視 鏡J^{F‑1 0},

J^{F I T‑1 0,} Jト 2 3 0(オ リ ^{ン パ ス}, 東 京) ^{の い}ずれ かを 用^{い て}･

E R C P後^{ス コ ー プ}抜 去 時にスコ ^ー プの先 端 部 を 十^二指 腸 乳 頭 部

の近傍に置^いて セ ク レ チ^ン注 射^を行^わずに, ス コ ^ー プの吸 引 装 置 を利 用^{し て}十二指腸 液2 ^〜 5ml吸 引 採 取し た^･

≠^. 牌さ夜

1 9 9 0年4月か ら 1 9 9 7年4月ま で^の間^に金 沢 大 学^{が ん}研 究所 内 科お よ び関 連 施 設 を 受 診^{し た}膵 癌3 2例, 慢 性 膵 炎^{2 0}例^より 採 取し た純 膵 液 を 対 象と し た^. 膵 癌 症 例 中^{2 0} 例は, 手 術ないし 剖検 時^の摘 出標 本^の病理 組 織 学 的診 断に より 確思さ れ, 佃^{の1 2} 例は腹 部 超 音 汲 とC T お よ び E R C P ^の所 見に より 診 断さ れ た^･ 慢 性 膵 炎^{につ いて は, 日}本 膵 臓 病 学 会^の診 断 基 準^に基づき 診 断

さ れ, いずれも 確 診^{に 一}致し ていた･ 膵 液^の採 取は空 腹時^に十 二指 腸 内 視 鏡J^{F‑1 0,} JF I T^‑1 0,JF^‑2 3 0(オ リ^{ン パ ス}) ^{の い}ずれ か を用^いて, 経 乳 頭 的^に膵 管 内^{に カニ ュ ー レを}挿入 し, セ クレ バ ン(^{エ ー ザ イ,} 東 京)1 U/kg を静 注^し, 膵 液 分 泌 開始 後⁵分毎⁴ 分 画に分割^して計^{2 0} 分 間に わ たり 膵 液を採 取し た^{1 2}一^{､1 4)}

Ⅳ^. D N A 抽 出

採 取^{し た}十二指 腸 液, 膵 液 を 遠 心 分 離し て得ら れ た沈 達に,

プロティナ ^ー ゼ K (和 光 純 薬^工業^{K K}, 大 阪) ^で処理後, フェノ

ー ル. ク^ロ ロホ^{ル ム}柚 軋 ^エ タノ ^ー ル沈殿に て D N A を抽出し,

2 6 0n m の吸 光 度測 定^{に よ}り, D N A濃 度を測 定し た^{24)2 5)}

Ⅴ. M S A 法

M 瓜 A法^は, セ^{ン ス}プ ラ イマ ^ー の3^'末 端^の変 異D N A のみ を高率 に P C R に て増 幅して点突 然 変異 を検出^{し よ}うとする方法である^{2 1)}.

正常型^{で は}, 3^, 末端^{が 一}致していな^いた め に, P C R に^て増幅^の効 率が低下する^{. こ の}よう^な原^理を 基づいて, セン スプ ラ イマ ^ーの 3^,末端 を^{Ⅰ 細 コ ドン12 の}第^一塩 基部 位 なら び に第^二塩 基部位^に設

定した^. そ し て各変 異塩 基^{ご と に}変 異 体に特 異 的な プ ラ イ^{マ ー}を 合 成し, ア ンチ セン ス:5^'‑C T C A T G A A A A T G G T C A G A G A A A C C^‑ 3^,; セ ン ス ‥5^･‑A C T T G T G G T A G T T G G A G C T A ^‑3^' , 5^'‑

m m T n G G A G C r C 3^,,5^' m m G m 3^･,5^,一C T T G T G G T A G T T G G A G C T G A^‑3^,,5^,‑C T T G T G G T A G T

T G G A G C T G C^‑3^,,5^,‑C T T G T G G T A G T T G G A G C T G T^‑3^,･ これら の プ ラ イマ ^ー を用^いて, ま ず 第¹塩 基, 第²塩 基^の3種 類^のプ ラ イ ^{マ ー} を それ ぞ れ混 合^{さ せ 1 セッ ト に し て,} 抽 出し た鋳型 D N A l O Ong, プ ラ イ^{マ ー}2 0pm ol, A m pli Taq^TM ポ¹) ^メラ ^ー ゼ (Pe rkin^‑Elm e r Cetu s, No I Walk, U S A) 2^･5単 位, d N T P (^Pe rkin

Elm e r) ^{1 0 0}/^LM , 1 0^×P C R 反応 緩 衡 液 (^{K C1 5 0 0m M , Tris}‑^{H C l}

l OO^m M p H 8^.3, M gC l21 5m M_g, 0^･1 % ゲ ラ チ^ン) ⁵F^Ll, 超純 水^を 加 え 全 量5 0_FLl と し て反 応 液 を 調 整^{し た･} T A K A R A^TM T P 3 0 00 (宝 酒 造, 京 都) ^を用^いた, 前 加 熱9 4 ℃ 1 分 間･ 変性^{9 4 ℃ 3 0}秒,

ア^{ニ ー} リ^ング 6 3^.5 ℃ 1分^{3 0}秒, 伸 長^{7 0} ℃1 分3 0 秒を1 サ イ ク^ル と し て 4 0 サ イ ク^ルP C R 反 応 を 行^{っ た.} 得ら れ た P C R産 物は 2 % NuS ie v eT M G T G ア ガロ ^ー ス ゲル (F M C B ioPr o^‑du cts･

R｡ Ck la nd, U S A) を用^い, Tri^s一氷 酢 酪^{E D T A}(^Tris‑^{II C1 4 0m}

pH 8^.0, 氷 酢 酸^{2 0m M} , E D T n 2m M) 泳 動 用頼 衡 液^にて電 気泳動 を 5 0 V, 1時 間行^い,

エナ ジ ウム ブロ マイ ド(0^･5_{〃 g}/ml) 染色^を 行^{っ て}, バ ンド が得ら れ ること に よ り変 異 を確 認^{し た･ そ して} 変異が認め ら れ たも^{のについて は}, さ ら に, プ ラ イ^{マ ー} を それ ぞ れ単 独に月] ^いて, 前 述^の方 法^で再 度^{P C R で}増 幅し, アガロ

ー スゲ^ル電 気 泳 動 後, エナ ジ ウ^ム ブロマイ ド染 色に て変異^した 塩 基 配 列 を 同 定し た^{2 1).}

実 際^の泳 動 図^を用いて説 明 する と, 第1塩 基 部 位^に変 異^を設 定し た 3種^のプ ラ イ^{マ ー} を 1 セッ ト に し て, P C R を施 行 後^に電 気 泳 動 を 行 う^と, 図1 に示 すように セッ ト 1^の混 合^{プライマ ー}

に よりレ^ー ン2, 3 に変 異 帯 (^{1 7 9 b}p) ^が検 出さ れ, 第1塩 基^の部 位^に変 異^のあること が判 明 する^･ 同 様に第²塩 基^の部 位に変異 を 設 定^{し た 3}種^{の プ ラ イマ ー} をセッ ト 2 の混 合プ ラ イ^{マ ー}と し て P C R後に電 気 泳動 を 行 うと^{レ ー ン}1, 5 で変 異 帯 (^{1 7 8bp}) ^が 検 出さ れ, 第²塩 基の部 位に変 異が存 在 する と判 定^{さ れ る･} 次 に変 異が陽 性と判 定さ れ たも^{の につ いて}, プ ラ イ^{マ ー}を^{そ れ ぞ} れ単 独^に用^いて再 度P C Rを 行^った後に泳 動 を 行 う^と･ 図2 に示 すようにレ ^ー ン2 は C G T, レ ^ー ン3 は T G T, レ ^{ー ン}1 と 5 は G 肝 のプ ラ イ^{マ ー} と反 応し て変 異 帯が み ら れ, 各^{々 の}症 例^の変 異^パタ ^{ー ン}も確 認 す^{ること が}可 能である^.