氏 名（本籍）
学位の種類 学位記番号
学位授与の要件 学位論文題名 論文審査委員
中島和英（神奈川県）
博士（学術）
甲第 9号
学位規則第3条第2項該当
食肉からの腸管出血性大腸菌0157
（主査）福山正文
（副査）丸山 務
本 田 政 幸 清 水 義
H7の検査法に関する研究
治（東海大学健康科学部大学院非常勤教授）
論 文 内 容 の 要 旨
腸管出血性大腸菌0157：H7（以下；0157）は、1982年に米国で発生したハンバーガーを喫食したこ とを原因とする集団食中毒の患者からRilyら（1983）により初めて分離され報告された。それ以降、
0157による感染症は、カナダおよび英国等の先進国で多発している。そのため世界規模で新興感染症 として監視および予防対策が求められている。我が国では、小林ら（1985）によって1984年に大阪で 発生した散発下痢症から分離した菌株から初めて確認され、その後1990年に埼玉県の幼稚園で、飲料 水中の0157による集団発生が起こり注目された。その後毎年各地で散発的に発生していたが、1996年 に堺市の小学校を中心とした集団食中毒は、世界的にも類を見ない大規模なものとなり世界中の専門 家から注目された。
0157の感染源および感染経路については、初めて報告されて以来、各国の研究者により精力的に調 査が行われ、ウシが高率に保菌していること、および食中毒原因食品として、牛肉が密接に関与して いることが明らかにされた。
食品における0157の検査法は、培養法やELISA法等数多く報告されている。我が国においては、厚 生労働省から「腸管出血性大腸菌0157の検査法について」（1997）が標準検査法として示されている。
しかし、本検査法は正確な検査結果は得られるが、検査技術を要し迅速性も欠けるため行政検査等で は有効であるが、食品工場の衛生管理上の検査法としては不向きである。そのため、食品工場の衛生 管理上の検査法は、一般的にノボビオシン加mEC培地を用いて増菌培養を行い、その培養液をソルビ
トールマッコンキー培地で分離培養後、平板上に疑わしいコロニーが認められた場合に0157免疫抗体 による凝集試験を行ういわゆる「簡易培養法」が広く汎用されている。しかし、簡易培養法でも、平 板上のコロニーの判定等に経験を要し、迅速性も十分ではない。
そこで、著者は、食品工場の衛生管理上の0157検査を正確で迅速かつ合理的に行うための検査方法 を検討した結果、新たに検査方法を開発するのに要する時間およびコストの面から市販の0157検出キ
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ットを使用することが最善であると考えた。市販の0157検出キットは、大きく分けELISA法を用いた キットとPCR法を用いたキットが市販されている。 ELISA法を用いたキットは、迅速および簡便であ るが、同一抗原を持つ競合菌との交差反応により偽陽性の誤判定になる可能性がある。一方、PCR法 を用いたキットは、検査結果は正確ではあるが操作が煩雑であり経験が必要とされて来たが、最近で は細菌の遺伝子解析等、PCR法を用いた検査がルーチン検査化されてきている。今回著者は、プライ マー、ポリメラーゼおよびヌクレオチドが一つの錠剤に加工され、操作が著しく簡便であり、0157の 有無をPCR反応後、電気泳動で判定する米国のQuaulicon精製「BAX「Mスクリーニングシステム」に 着目し「BAX「Mスクリーニングシステム（以下；PCRキット法）と「簡易培養法」との検出限界を非 加熱および60℃で10秒間加熱ダメージを与えた0157のVT2産生株およびVr1＆2産生株のそれぞれ 2菌株について検討し、また食品の中で特に0157汚染が危惧される食肉における0157検査法として、
0157に汚染されていない4種類の市販食肉（牛肉、豚肉、鶏肉、牛レバー）を用いて0157のVT2産 生株およびVT1＆2産生株の2菌株を接種して検出限界を調査し、その検査所要時間、操作性および検 査コストについて比較し食肉加工工場における衛生管理上の0157検査の実用性を検討した。
また、著者はPCRキット法のみならず0157検査より一層の迅速化および食品製品類等の加熱工程 により加熱ダメージを受けた極小量の0157を確実に増菌させるため、非加熱および60℃で10秒間加 熱ダメージを与えた上記の0157の2菌株を用いて増菌培地（ノボビオシン加mEC培地およびトリプ トソイブイヨン培地）、培養方法（静置培養および振とう培養）、培養温度（37℃および42℃）および 培養時間（5、10および20時間）を組み合わせ、増菌培養の条件を検討した。その結果は以下の通り
である。
1）PCRキット法の0157の2菌株の検出限界は、非加熱および加熱ダメージを与えた菌株は共に 105cfu／mlであった。
2）簡易培養法では、0157の2菌株の非加熱および加熱ダメージを与えた菌株は、104cfu／ml以上でな ければ検出できなかった。
3）牛肉、豚肉、鶏肉、および牛レバーに0157に2菌株を肉重量25g当たり100〜103cfuの4段階にな るように接種後、ノボビオシン加mEC培地を用いて37℃で20時間至聖培養を行った場合、 PCRキ ット法の検出限界は2菌株ともに、牛肉、豚肉および牛レバーでは肉重量25g当たりのi接種菌量が 100cfuで検出できたが、鶏肉ではやや低く肉重量25g当たりの接種菌量が101cfUであった。
4）牛肉、豚肉、鶏肉および牛レバーに0157の2菌株を肉重量25g当たり100〜103cfuの4段階になる ように接種後、ノボビオシン加mEC培地を用いて37℃で20時間増菌培養を行った場合、簡易培養 法の検出限界は、牛肉では肉重量25g当たりの接種菌量がVT2産生株は102cfu、 VT1＆2産生株は 101c血、豚肉および鶏肉では2菌株とも肉重量25g当たりの接種菌量が101cfu、牛レバーでは肉重量 25g当たりの接種菌量がVT2産生株は103cfu、 VT1＆2産生株は102ch1で検出された。
5）PCRキット法と簡易培養法の実用性を比較検討した結果は、検査所要時間は簡易培養法では40時
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問、 PCRキット法では25時間であり、PCR法は簡易培養法の約2／3の時間で検査が終了した。
また操作性は、簡易培養法は釣菌技術および分離培地に発育したコロニーの判定に経験が必要であ るが、PCRキット法は、主な試薬が錠剤化されているためマイクロピペットの操作が正確に出来れ ば検査ができた。
6）0157の増菌培養の迅速化は、培地種類、培養温度に係わらず振とう培養を行うことが効果的であ つた。
以上のことから、食品工場の衛生管理上の0157検査法として、現在食品工；場で広く汎用されている
「簡易検査法」より米国Qualicon社製の「BAX「Mスクリーニングシステム」を使用することにより正 確で迅速かつ合理的に行えることを明らかにした。また0157検査のなお一層の迅速化として、増菌培 養を行うとき振とう培養を行うことにより増菌培養時間を短縮できることを明らかにした。
論文審査の結果の要旨
腸管出血性大腸菌0157：H7（以下；0157）は、1982年にRi蓋yらが米国のオレゴン州でハンバーガーを 喫食したことを原因とする集団食中毒の患者から初めて分離した。それ以降、0157による感染症は、
カナダおよび英国などの先進国で多発している。そのため世界規模で新興感染症としての監視および 予防対策が求められている。我が国では、小林ら（1985）によってさかのぼり調査が行われ、1984年 に大阪で発生した散発下痢症から分離された株から初めて確認された。その後1990年に埼玉県の幼稚 園で、飲料水中の0157による集団発生が起こり注目された。その後毎年各地で散発的に発生していた が、1996年に堺市の小学校を中心とした集団食中毒は、世界的にも類を見ない大規模なものとなり世 界中の専門家から注目された。また、0157の感染源および感染経路については、各国の研究者により 精力的に調査が行われ、ウシが高率に保菌していること、および食中毒原因食品として、牛肉が密接 に関与していることが明らかにされた。
食品における0157の検査法として、我が国においては、厚生労働省から「腸管出血性大腸菌0157 の検査法について」（1997）が標準検査法として示されている。しかし、本検査法は正確な検査結果は 得られるが、検査技術を要し迅速性も欠けるため行政検査として有効であるが、食品工場における衛 生管理上の検査法としては不向きである。そのため、食品工場の衛生管理上の検査法は、一般的にノ ボビオシン加mEC培地を用いて増高培養を行い、その培養液をソルビトールマッコンキー培地で分離 培養後、平板上に疑わしいコロニーが認められた場合に0157免疫抗体による凝集試験を行ういわゆる
「簡易培養法」が広く汎用れさている。しかし、簡易培養法でも、平板上のコロニーの判定等に経験を 要し、迅速性も十分ではない。
著者は、上述のことから食品工場の衛生管理上の0157検査を正確でより迅速に行う検査方法を検討 するため、今回、従来のPCR法に比べ、プライマー、ポリメラーゼおよびヌクレオチドが一つの錠剤 に加工されているため、操作が著しく簡便な米国のQuaulicon社製「BAX「Mスクリーニングシステム」
に着目し「BAX「Mスクリーニングシグテム（以下；PCRキット法）」と「簡易培養法」との検出限界
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を比較検討した。0157のVT2産生株およびVT1＆2産生株の2株を非加熱処理した条件と60℃で10 秒間加熱ダメージを与えた条件でそれぞれ用い、0157に汚染されていない4種類の市販食肉（牛肉、
豚肉、鶏肉、牛レバー）に0157のVT2産生株およびVT1＆2菌株をそれぞれ接種して検出限界を測定 した。その検査所要時間、操作性および検査コストについて比較し食肉加工工場における衛生管理上 の0157検査の実用化を検討した。また、0157検査をより一層の迅速化を図るため、増菌培地（ノボ ビオシン加mEC培地およびトリブトソイブイヨン培地）、培養方法（静置培養および振とう培養）、培 養温度（37℃および42℃）および培養時間（5、10および20時間）を組み合わせ、増菌培養の迅速化
を確立した。その概要は以下の通りである。
1）PcRキット法で非加熱および加熱ダメージを与えた0157の2菌株（vT2株、 vr1／vT2株）はいず れの条件においても菌量は105cfu／m1、簡易培養法でもPCRキット法と同様にいずれの条件でも菌 量は104cfu／m1でなければ、それぞれ本菌の検出は不可能であった。
2）牛肉、豚肉、鶏肉および牛レバーに0157の2菌株を10一103c血／25gの4段階になるように接種し、
ノボビオンシン加mEC培地を用いて37℃で20時間増菌培養した。その試料を用い、 PCRキット法 で検出限界を検討したところ、供試した2菌株はともに、牛肉、豚肉および牛レバーでは
100cfu／25gから検出されたが、鶏肉ではやや低く101cfu／25gから検：出された。一方、簡易培養法の
検出限界は、牛肉ではVT2産生株が102cfu／25g、 VT1＆2産生株が101cfu／25g、豚肉および鶏肉で は2菌株ともに101cfu／25g、牛レバーではVT2産生株が103cfu／25g、 VT1＆2産生株が102cfu／25g から検出された。
3）PCRキット法と簡易培養法の実用性を比較検討したところ、検査所要時間において簡易培養法では 40時間、PCRキット法では25時間であり、 PCR法が培養法に比べ、約2／3の時間で検査が終了し た。また操作性では、簡易培養法は釣菌技術および分離培地に発育したコロニーの判定に経験など の煩雑性があるため、操作法に問題がある。これに対し、PCRキット法は、主な試薬が錠剤化され ているため、的確に検査試料を加えマイクロピペットの操作が正確に出来れば検査ができた。
4）0157の増菌培養の迅速化を試みたところ、培地種類や培養温度に係わらず振とう培養を行うこと が効果的であった。
以上の研究成績から、食品工場の衛生管理上の0157検査法として、現在食品工場で広く汎用されて いる「簡易培養法」に比較し、米国Qualicon社製の「BAX「Mスクリーニングシステム」を使用するこ とが正確でより迅速に行えることが明らかにされた。また、0157検査のなお一層の迅速化として、増 菌培養法において、静置培養に比べ、振とう培養の方が優位に菌量の増加が見られることから振とう 培養法を取り入れることにより0157の検査時間を短縮できることが明らかにされた。
以上のように本研究は食品からの腸管出血性大腸菌0157：H7の検査法の迅速化に関する研究として、
細菌学上、公衆衛生学上高く評価される業績であり、博士（学術）の学位授与に値するものと認める。
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