中国への渡航者によるパラチフスの集団 2 事例の分子疫学的解析
横浜市衛生研究所
松本 裕子 山田三紀子 鈴木 正樹 北爪 晴恵 武藤 哲典 鳥羽 和憲
（平成 18 年 6 月 5 日受付）
（平成 18 年 7 月 18 日受理）
Key words : Salmonella enterica serovar Paratyphi A, drug resistance, pulsed-field gel electrophoresis（PFGE）,outbreak
要 旨
2002 年 9 月から 10 月にかけて横浜市内で中国への渡航者の S. Paratyphi A による 2 件の集団事例が発生 した．この 2 つの事例の関連性を調査するために，分離した 6 株についてファージ型別と，Xba I， Bln I，
Spe I， Xho I を用いた PFGE による分子疫学的解析を行った．これらの 6 株は全てファージ型が Untypable となり，4 種の制限酵素を用いた PFGE 法では全ての制限酵素で同一のバンドパターンとなり，その類似度 も 100％ となった．
また，これらの株は薬剤感受性試験ではナリジクス酸，ホスホマイシン耐性で，なおかつフルオロキノロ ン系薬剤について低感受性であった．サイクルシークエンス法により DNA ジャイレースサブユニット A 遺伝子（gyrA）上のキノロン耐性決定領域（QRDR）において，83 位のアミノ酸がセリンからフェニルア ラニンに置換していた．また，トポイソメラーゼ IV 遺伝子（parC）上の QRDR には変異は見られなかった．
患者や家族からの発生状況の調査等に加えて薬剤感受性試験と PFGE 解析により，今回の 2 つの事例は 中国からの輸入事例であり，フルオロキノロン低感受性の株がその地域に蔓延していることが示唆された．
〔感染症誌 80：674〜679，2006〕
序 文
パラチフスは Salmonella enterica subsp. enteica se- rovar Paratyphi A（以下 S. Paratyphi A）によって 起こる感染症で，Salmonella enterica subsp. enteica se- rovar Typhi（以下 S. Typhi）が起こす腸チフスとと もに 2 類感染症に分類されている．当所では年間平均 2，3 株ほど扱っている．
2002 年 9 月から 10 月の約 1 カ月という短期間に横 浜市内某区でパラチフスの患者が 5 名発生した．さら にこれらの患者と共に渡航していた宮城県仙台市在住 の親類 1 名もパラチフスの患者として届出が出されて いた．6 名は親類同士であったことから，同一の集団 事例かと思われたが，患者からの聞き取り調査で渡航 先が異なっていたため別々の事例（事例 A，B）であ ることが判明した．ファージ型別を国立感染症研究所 に依頼したところ，いずれの株もファージ型が Un- typable であった．そのため，制限酵素 4 種類を用い
て Pulsed-field gel electrophoresis（以下 PFGE）を 行い，2 事例を比較した．
また，近年 S. Typhi や S. Paratyphi A においてナ リジクス酸（NA）耐性，フルオロキノロン系薬剤低 感受性菌が問題となっている
１）２）ことから，薬剤感受性 試験を行い，なかでもフルオロキノロン系薬剤につい ては最小発育阻止濃度（MIC）を測定し，さらに gyrA および parC 遺伝子のキノロン耐性決定領域（QRDR）
の遺伝子変異についてもダイレクトシークエンス法に より検索を行った．
対象と方法
1．事例概要
2002 年 9 月 19 日神奈川県某福祉保健事務所に横浜 市某区在住のパラチフス患者発生の届出が県内の医療 機関から提出された．患者（A1）は在日中国人男性 で，同年 7 月 29 日から 8 月 29 日の期間，中国ハルピ ン市に帰省していた．そのため当所で同時に渡航した 家族および親類 6 名，渡航後に食事等を共にした親類 2 名の計 8 名について検便を行った．その結果，患者
原 著別刷請求先：（〒235―0012）横浜市磯子区滝頭 1―2―17 横浜市衛生研究所検査研究課 松本 裕子
Fig. 1 Summary oftwo casesofparatyphoid fever
Fig. 2 Dendrogram ofClusteranalysisoffourenzymesdigested DNA
と共に渡航し，いずれも無症状であった患者の妻（A2）
と義妹（A3）計 2 名から S. Paratyphi A が検出され た．（事例 A）
9 月 24 日に患者（A1）の親戚の男性（B1）から S.
Paratyphi A が検出され，本市内福祉保健センターに 届出が提出された．この親類も在日中国人で 8 月 15 日から 24 日の期間，中国黒龍江省に帰省していた．当
所で同時に渡航した親類 1 名，渡航後に食事等を共に した親類 6 名の検便を行った結果，一緒に渡航した義 弟（B2）から S. Paratyphi A が検出された．また，こ の患者らと共に帰省した宮城県仙台市在住の義兄（B 3）から 9 月 13 日に S. Paratyphi A が検出されてい た．（事例 B）（Fig. 1）
2．対象検体（供試菌株）
Table 1 Drug resistance patterns of two cases MIC（μg/mL）Drug sensitivity StrainNo Source of strainCase LVFXCPFXOFLXNALVFXCPFXOFLXNAFOMGMSTCPCTXKMTCSMABPC 10.54＞256SSSRRSSSSSSSSPatient A1A 10.54＞256SSSRRSSSSSSSSWife of A2A 10.54＞256SSSRRSSSSSSSSSister of A3A 10.54＞256SSSRRSSSSSSSSPatient B1B 10.54＞256SSSRRSSSSSSSSBrother of B2B 10.54＞256SSSRRSSSSSSSSBrother of B（Sendai）3B 21 4＞256SSSRSSSSSSSSSControl 1C1 10.54＞256SSSRSSSSSSSSSControl 2C2
ハルピン市に渡航した感染者から 分 離 さ れ た S.
Paratyphi A 3 株（A1〜3），黒龍江省に渡航した感染 者から分離された S. Paratyphi A 3 株（B1〜3 うち B3 株は仙台市衛生研究所より被分与）を対象検体と した．対照として過去に当所で分離された株のうち，
2002 年 イ ン ド 渡 航 者 静 脈 血 よ り 分 離 さ れ た 1 株
（C1），2004 年インド渡航者静脈血より分離された 1 株（C2）を用いた．この 2 株はいずれもファージ型 別不能株である．
3．方法
（1）ファージ型別検査
ファージ型別検査は，国立感染症研究所細菌第一部 に依頼した．
（2）PFGE 法による DNA パターンの解析
寺嶋らの方法
３）により DNA を抽出し，制限酵素 Xba I（BIO-RAD），Bln I（Takara），Spe I（Takara），Xho I（Promega）でそれぞれ処理した後，PFGE 装置 Gene Path（BIO-RAD）で Program24 を 使 用 し，22 時 間 泳動した．バンドパターンは，Fingerprinting II（BIO- RAD）を用いて解析し，UPGMA 法で系統樹として 表した．
（3）薬剤感受性試験
NCCLS の抗菌薬ディスク感受性試験実施基準
４）に 基づき，センシディスク（日本ベクトンディッキンソ ン）を 用 い て 実 施 し た．供 試 薬 剤 は，ampicillin
（ABPC），streptomycin（SM），tetracycline（TC），
kanamycin（KM），cefotaxime（CTX），chlorampheni- col（CP），sulfamethoxazole-trimethoprim（ST），gen- tamicin（GM），fosfomycin（FOM），nalidixic acid
（NA），ofloxacin（OFLX）， ciprofloxacin（CPFX），
levofloxacin（LVFX）の 13 薬剤である．また，キノ ロン系 薬 剤 で あ る，NA，OFLX，CPFX，LVFX に 対する最小発育阻止濃度を，NCCLS に準拠して，E- test（アスカ純薬）を用いて測定した．
（4）gyrA ，parC キノロン耐性決定領域の解析 gyrA および parC のキノロン耐性決定領域（QRDR）
における塩基配列を解析し，変異の有無を調べた．ま ず，GIRAUD らの報告した方法
５）に準じ， gyrA は，ST gyrA 1（5ʼ-TGTCCGAGATGGCCTGAAGC-3ʼ）お よ び ST gyrA 12（5ʼ-CGTTGATGACTTCCGTCAG-3ʼ）
を，parC については，ST parC 1（5ʼ-ATGAGCGATA-
TGGCAGAGCG-3ʼ）および ST parC 2（5ʼ-TGACCGA-
GTTCGCTTAACAG-3ʼ）のプライマーを用い Polym-
erase chain reaction（PCR）法により，各遺伝子の
領域を増幅した．この増幅産物について，ABI PRISM
310（アプライドバイオシステムズ）を用い，ダイター
ミネーター法でサイクルシークエンスを行った．得ら
れた塩基配列を，Gen-Bank に登録してある S. Paraty-
phi A NCTC13 の遺伝子（gyrA -accession no.AB 071871， parC -accession no.AB072700）
６）と比較した．
成 績
1．ファージ型別検査
供試した 6 株，対照とした 2 株はいずれもファージ 型は Untypable であった．
2．PFGE 法による DNA パターンの解析
供試した 6 株は 4 種の制限酵素全てにおいて同一の バンドパターンを示し，系統樹でも同一のクラスター を形成した．これに対し，対照の 2 株はそれぞれ別の バンドパターンを示し，6 株との類似度は，C1 株は 87.5〜94.7，C2 株は 76.5〜89.4 であった．（Fig. 2）
3．薬剤感受性試験
供試した 6 株は全て，FOM，NA 耐性であり，NA の MIC は＞256 であった．KB 法では OFLX，CPFX，
LVFX に感受性であったが，MIC はそれぞれ 4，0.5，
1.0 と，低感受性を示した．対照とした 2 株はいずれ も NA のみ耐性であり，NA，OFLX，CPFX，LVFX の MIC は C1 株は＞256，4，1.0，2 となり C2 株は＞
256，4，0.5，1.0 であった．（Table 1）
4． gyrA ， parC キノロン耐性決定領域の解析 供試した 6 株，対照とした 2 株は，いずれも gyrA の 83 位のコドンが TCC から TTC に変異し，それに 伴いアミノ酸がセリンからフェニルアラニンに置換し ていた．一方 parC には 8 株とも変異箇所は見られな かった．
考 察
今回，当所で扱った 2 事例は，市内の同一区に居住 している親類同士であった．しかし，中国に渡航した 人のみ感染していること，渡航後に発症していること，
A，B2 事例の家族は渡航前後に日本国内でも中国国 内でも接触歴がないことから，それぞれ中国に渡航し た際に別々に感染したのではないかと考えられた．
国立感染症研究所に依頼したファージ型別はいずれ も Untypable であったため，分離された 6 株につい ては菌株間の類似性についての情報は得られなかっ た．
ファージ型別でそのほとんどが型別できる S. Ty- phi に比べて S. Paratyphi A のファージ型は 6 種類と 少なく，年によって差はあるが全国から国立感染症研 究 所 に 送 付 さ れ る 株 の 15〜25％ が Untypable で あ る
７）．そのため，S. Typhi と同様に PFGE による解析 が有用と思われる
８）が，S. Paratyphi A に関する分子 疫学的な解析は事例も少ないことから十分に行われて いない
９）．国内においては近年では 1993〜1994 年に三 重県の民宿利用者に発生した集団事例でファージ型 2 の株について Bln I を用いた PFGE を行っている．そ の結果，患者由来 27 株と海底泥由来 1 株の PFGE パ
ターンが一致したことで菌が検出された海に係留され ていた生ガキが原因食品と推察された
１０）．また，1998 年に千葉県のレストラン利用者に発生した集団事例で フ ァ ー ジ 型 4 の 株 に つ い て Bln I， Xba I を 用 い た PFGE を行っており，患者由来 19 株が同一の PFGE パターンを示したことから患者が利用したレストラン が原因施設と推察された
１１）．今回我々は S. Typhi の PFGE によく用いられる Bln I， Xba I に加え， Bln I，
Xba I で完全に一致した株についても差が見られると 報告されている
１２）Spe I， Xho I も用いてその泳動パ ターンを比較した．
その結果，6 株は 4 種類の制限酵素全てで同一パ ターンを示した．制限酵素の違いによる対照株との類 似度の差や泳動像を見ると，Bln I を用いた場合に対 照株との類似度の差が大きく現れることから，この酵 素が S. Paratyphi A を分類するのに適していると思 われ，このことは依田らの報告
１２）と同じであった．ま た， S. Paratyphi A は由来やファージ型が異なっても，
PFGE 解析で同一または類似性の高いパターンを示 し，極めて限られた数のクローンがパラチフス症を起 こしているとの報告
９）もあり，そのクローンが国ごと に特有であるとの報告
８）もある．これらの報告と同様，
著者らは海外の同一国（ネパール）に渡航した別々の 患者から 10 年近く年月が経過してから同一の PFGE パターンを示す株が分離された例を経験している（未 発表）．これらを総合的に考え，また，今回の事例に ついて患者等からの聞き取り調査によると帰省先では パラチフスは珍しい疾患ではないということ，ハルピ ン市は黒龍江省内にあることなどから，当該地域に同 一クローン由来の菌が蔓延しており，感染源は不明で あるが 2 つの家族は渡航した際に別々に感染したと推 察された．発症していない感染者が保菌していた可能 性もあるが，最近日本国内に長期滞在している外国人 が，東南アジア，インド亜大陸，中国など自国に一時 帰国した際に感染し，日本で発症するケースも増えて いる
７）ことから今回の 2 事例もこのようなケースでは ないかと思われた．
国際化に伴いチフス症の流行地である，インド亜大 陸，東南アジアとの往来が日常的となっている現在，
海外から入ってくる保菌者や輸入食品を通じていつ集 団発生を起こしてもおかしくない状況である．現に国 内でのパラチフスの発生数は，2002 年 35 例，2003 年 41 例，2004 年 85 例と近年増加傾向にあり，そのほと んどが海外からの輸入事例である
７）．
そのなかでも最近では薬剤耐性菌が問題視されてお
り，2004 年には感染研に送付される菌株の 77％ が
NA 耐 性 と な り，フ ル オ ロ キ ノ ロ ン 系 薬 剤 で あ る
OFLX 耐性株がインドへの渡航者より検出されてい
る
７）．また，本市でも 2002 年に尿路感染症治療のため CPFX を長期間投与されていた S. Paratyphi A 保菌 者の胆嚢から，フルオロキノロン高度耐性菌が分離さ れている
１３）．NA 耐性菌にはチフス症の第一選択薬で あるフルオロキノロン系薬剤による治療が無効である か，効果が弱い
１）２）．今回の 2 事例でも，当初は感染者 の治療には LVFX が用いられていたが，薬剤が効か ないということで途中で ST に変更された．（妊婦に アモキシシリンが投与された 1 例は除く）
S. Paratyphi A は，まず gyrA の 83 位もしくは 87 位のアミノ酸に一点変異が起こり，次いで gyrA の 83 位と 87 位のアミノ酸に二点変異が起こることによっ て，フルオロキノロン系薬剤に耐性を獲得していく
６）． さらに parC の 84 位のアミノ酸にも変異が起こること で高度耐性株となっていく
６）．今回用いた株は gyrA の 83 位のアミノ酸に一塩基置換を起こしていたがこ のような株がさらに変異を起こし，高度耐性株となっ ていくのではないかと思われる．広瀬らも述べている とおり
６），治療に影響を及ぼす NA 耐性菌に対して継 続的な監視を行う必要性は増している．とりわけ gyrA の変異については重要であり，引き続き調査を行っ ていきたい．
謝辞：稿を終えるにあたり，菌株を分与していただいた 仙台市衛生研究所微生物部の沼田昇先生および横浜市立市 民病院の相楽裕子先生，並びにファージ型別をしていただ いた国立感染症研究所細菌第一部の廣瀬健二先生に深謝い たします．
文 献
1
）Hirose K, Tamura K, Sagara H, Watanabe H：
Antibiotic Susceptibilities of Salmonella enterica Serovar Typhi and S. enterica Serovar Paratyphi A Isolated from Patients in Japan. Antimicrob Agents Chemother 2001；45：956―8.
2
）Chandel DS, Chaudhry R, Dhawan B, Pandey A, Dey AB：Drug-Resistant Salmonella enterica Se- rovar Paratyphi A in India. Emerg Infect Dis 2000；6：420―1.
3
）寺嶋 淳，泉谷秀昌，渡辺治雄：菌株レベルの
同定：パルスフィールドゲル電気泳動法による 菌株のサブタイピング．腸内細菌学雑誌 2004；
18：117―22.
4
）The National Committee for Clinical Laboratory Standards：Performance Standard for Antimi- crobial Disk Susceptibility Tests；Approved Standard 7th Ed. 2000；20（1）.
5
）Giraud E, Brisabois A, Martel J.L, Chaslus- Dancla E：Comparative Studies of Mutations in Animal Isolates and Experimental in Vitro- and In Vivo-Selected Mutants of Salmonella spp.
Suggest a Counterselection of Highly Fluoroquinolone-Resistant Strains in the Field.
Antimicrob Agents Chemother 1999；43：
2131―7.
6
）Hirose K, Hashimoto A, Tamura K, Kawamura Y, Ezaki T, Sagara H, et al.：DNA Sequence Analysis of DNA Gyrase and DNA Topoisom- erase IV Quinolone Resistance-Determining Re- gions of Salmonella enterica Serovar Typhi and S.
enterica Serovar Paratyphi A. Antimicrob Agents Chemother 2002；46：3249―52.
7
）国立感染症研究所・厚生労働省健康局結核感染
症課：＜特集＞腸チフス・パ ラ チ フ ス 2001〜
2004．病原微生物検出情報 2005；26：87―8.
8
）Goh YL, Puthucheary SD, Chaudhry R, Bhutta ZA, Lesmana M, Oyofo BA, et al.：Genetic di- versity of Salmonella enterica serovar Paratyphi A from different geographical regions in Asia. J appli Microbol 2002；92：1167―71.
9
）Matsumoto M, Miwa Y, Hiramatsu R, Yamazaki M, Saito M, Suzuki Y： Salmonella Paratyphi A Is More genetically Homogenous than Salmo- nella Typhi, as Indicated by Pulsed-Field Gel Electrophoresis. 感染症誌 2000；74：143―9.
10
）Sugiyama A, Nakano Y, Iwade Y, Yamauchi A, Sakurai N, Nakayama O, et al.：Epidemiological Studies of an Outbreak of Paratyphoid Fever in the Shima Area of Mie Prefecture. Jpn J Infect Dis 1999；52：253―5.
11
）国立感染症研究所・厚生労働省健康局結核感染
症課：＜情報＞千葉県内で発生したパラチフス の 集 団 事 例 に つ い て．病 原 微 生 物 検 出 情 報 2001；22：168―9.
12
）依田清江，内村眞佐子：千葉県における腸チフ
ス・パラチフスの発 生 状 況（1971-2004）―33 年 間 の 変 遷 と 現 在 の 問 題 点―．千 葉 衛 研 報 告 2004；28：30―4.
13
