修 士 学 位 論 文
題 名
胃・腸上皮の分化における
Sox2
とCdxA
の機能解析指 導 教 員 福 田 公 子 准 教 授
令 和 2年 1月 1 0日 提 出
首都大学東京大学院
理 工 学 研 究 科 生 命 科 学 専 攻 学修番号 17881336
氏 名 原 規 司
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学位論文要旨（修士（理学））
論文著者名 原 規司 論文題名：胃・腸上皮の分化におけるSox2とCdxAの機能解析
本文
消化管は、前後軸に沿って機能や形態の全く異なる器官を形成する。例えば胃は腺を 形成し、腺上皮から消化酵素ペプシノゲンを分泌し化学的消化を担う。一方、腸では絨 毛を作り主に吸収を担う。胃や腸はこのような形態形成が起こる前からそれぞれに特異 的な転写因子をコードする遺伝子Sox2（胃），Cdx（腸）が知られている。これらの転写 因子は形態形成時やその後の最終分化マーカー発現時にも発現が続く。また、Sox2 や cdx2 ノックアウトマウス胚ではそれぞれ胃・腸の一部の形態に影響が出ることから、
Sox2とCdxが胃や腸の分化に重要な因子であると考えられている。また，当研究室の 先行研究より、Sox2 と CdxAは相互抑制することが示唆されている。しかし、Sox2 や Cdx が細胞分化や特異的遺伝子発現においてどのように働いているかは明らかになっ ていない。そこで私はSox2、CdxAをニワトリ胚の消化管上皮に強制発現し、消化管上 皮の細胞分化にどのような影響を与えるかを調べることにした。
まず、Sox2、CdxA 発現開始直前の 1.5 日胚の予定胃領域，予定腸領域にエレクトロ ポレーション法で Sox2 や CdxA の発現ベクターを導入した。通常、導入したプラスミ ドは1～2日で分解されてしまうため、tol2-transposon配列の間にニワトリβアクチンの プロモーターとSox2または CdxAを挟んだプラスミドと、ニワトリβ アクチンのプロ モーターにtransposaseを繋いだプラスミドを同時に導入することで、Sox2やCdxA発現 コンストラクトをゲノムに挿入し、長期的に遺伝子を強制発現させる方法を用いた。強 制発現胚を12日胚まで孵卵し，器官ごとに固定、凍結切片にした後、in situ hybridization 法により胃・腸領域のマーカー遺伝子の mRNA を検出した。マーカー遺伝子には、胃 内腔上皮マーカーcSP、胃腺上皮マーカーECPg、腸絨毛マーカーcIFABPを用いた。
Sox2 が強制発現された 12日胚腸上皮では、CdxA の発現が抑えられ、絨毛構造が崩 れていることが確認された。しかし、胃マーカー遺伝子の異所的発現は検出されなかっ た。一方、CdxAを強制発現された12日胃上皮ではSox2や胃上皮マーカー遺伝子の発 現が検出されず、一部でiFABPの発現が検出された。また、正常な胃では複合腺を形成 するが、CdxAの発現場所は単純腺構造を形成した。CdxA強制発現による胃上皮マーカ ーの抑制およびiFABPの発現誘導は，すでにSox2が発現している6日胚の前胃にCdxA
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を導入し、4日培養した組織でも同様にみられた。これより、Sox2はCdxAの発現を抑 制し腸の形態形成に影響を及ぼすが、胃マーカー遺伝子の発現誘導には十分でないこと、
CdxA は Sox2 や胃マーカー遺伝子の発現を抑制し胃の形態形成にも影響を及ぼす可能 性が示唆された。
8日胚より若い胚では，胃・腸上皮の境界付近にSox2とCdxA両方の遺伝子が発現す る領域が存在する。そこで Sox2 と CdxAの共発現が細胞分化に及ぼす影響を調べるた め、 6日胚前胃上皮にSox2とCdxAを導入し2日培養したところ、Sox2、CdxAが強く 発現している場所では cSP の発現が減少および iFABP の発現誘導は見られなかった。
これより、Sox2 と CdxA はお互いの発現を抑制するだけでなく，お互いの機能も抑制 すると考えられる。
4 目次
1. 謝辞………4
2. 要旨………5
3. 要旨（英文）………7
4. 序論………9
5. 材料・方法………11
6. 結果………13
7. 考察………17
8. 図………19
9. 参考文献………31
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1. 謝辞
本研究にあたり、終始ご指導ご鞭撻いただきました福田公子准教授に心より感謝いたし ます。また、研究に必要な議論や様々な意見をくださいました高鳥直士准教授に深く感謝い たします。最後に研究室で一緒に日々を過ごし、時には支え、時にはアドバイスをくれた発 生生物学研究室の皆様に心より感謝いたします。
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2. 要旨
消化管は、口と肛門を結ぶ一本の管だが、前後軸に沿って機能や形態の全く異なる器官を 形成する。例えば胃上皮は腺を形成し、腺上皮から消化酵素ペプシノゲンを分泌し化学的消 化を担う。一方、腸上皮は絨毛構造を作り主に吸収を担う。胃や腸の上皮はこのような形態 形成が起こる前からそれぞれに特異的な転写因子をコードする遺伝子Sox2（胃），Cdx（腸）
を発現することが知られている。これらの転写因子の発現は形態形成時やその後の最終分 化マーカー発現時にも発現が続く。また、Sox2 やCdx2 ノックアウトマウス胚ではそれぞ れ胃・腸の一部の形態に影響が出ることから、Sox2とCdxが胃や腸の分化に重要な因子で あると考えられている。しかし、Sox2やCdxが細胞分化や特異的遺伝子発現においてどの ように働いているかは明らかになっていない。そこで私は Sox2、CdxA をニワトリ胚の消 化管上皮に強制発現し、消化管上皮の細胞分化にどのような影響を与えるかを調べること にした。
まず、Sox2、CdxA 発現開始直前の1.5日胚の予定胃領域，予定腸領域にエレクトロポレ ーション法でSox2やCdxAの発現ベクターを導入した。通常、導入したプラスミドは1～
2日で分解されてしまうため、tol2-transposon配列の間にニワトリ β アクチンのプロモー ターとSox2または CdxAを挟んだプラスミドと、ニワトリ β アクチンのプロモーターに
transposaseを繋いだプラスミドを同時に導入することで、Sox2やCdxA発現コンストラク
トをゲノムに挿入し、長期的に遺伝子を強制発現させる方法を用いた。強制発現胚を12日 胚まで孵卵し，器官ごとに固定、凍結切片にした後、in situ hybridization法により胃・腸領 域のマーカー遺伝子のmRNAを検出した。マーカー遺伝子には、胃内腔上皮マーカーcSP、 胃腺上皮マーカーECPg、腸絨毛マーカーcIFABPを用いた。
Sox2が強制発現された12日胚腸上皮では、CdxAの発現が抑えられ、絨毛構造が崩れて いることが確認された。しかし、胃マーカー遺伝子の異所的発現は検出されなかった。一方、
CdxAを強制発現された 12 日胃上皮ではSox2 や胃上皮マーカー遺伝子の発現が検出され ず、一部でiFABPの発現が検出された。また、正常な胃では複合腺を形成するが、CdxAの 発現場所は単純腺構造を形成した。CdxA 強制発現による胃上皮マーカーの抑制および iFABPの発現誘導は，すでにSox2が発現している6日胚の前胃にCdxAを導入し、4日培 養した組織でも同様にみられた。これより、Sox2はCdxAの発現を抑制し腸の形態形成に 影響を及ぼすが、胃マーカー遺伝子の発現誘導には十分でないこと、CdxAはSox2や胃マ ーカー遺伝子の発現を抑制し胃の形態形成にも影響を及ぼす可能性が示唆された。
8日胚より若い胚では，胃・腸上皮の境界付近にSox2とCdxA両方の遺伝子が発現する 領域が存在する。そこでSox2とCdxAの共発現が細胞分化に及ぼす影響を調べるため、 6 日胚前胃上皮にSox2とCdxAを導入し2日培養したところ、Sox2、CdxAが強く発現して いる場所では cSP の発現が減少および iFABP の発現誘導は見られなかった。これより、
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Sox2とCdxAはお互いの発現を抑制するだけでなく，お互いの機能も抑制すると考えられ る。
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3. Summary
The gastrointestinal tract forms various organs along its anterior-posterior axis that display diverse shapes and functions and forms. For example, the stomach, that epithelium forms glands and secretes a digestive enzyme, pepsinogen, is responsible for chemical digestion. While, the intestine forms villi and absorbs nutrients. Prior to those morphogenesis, transcription factors, Sox2 and CdxA are expressed in the stomach epithelium and the intestinal epithelium, respectively. These genes continue to be expressed during morphogenesis and expression of differentiation makers. In Sox2 or Cdx2 mutant mouse embryos, morphologies of the stomach or the intestine, respectively, are affected, suggesting that Sox2 and CdxA are important for differentiation of the stomach and intestinal epithelium. However, it remains unclear how these genes function in morphogenesis and cell differentiation. In this study, to elucidate the roles of Sox2 and CdxA in the gastrointestinal formation, I analyzed the effect of long-term overexpression of Sox2 and CdxA in the gastrointestinal epithelium.
First, DNA constructs encoding Sox2 or CdxA were introduced into the undifferentiated gastrointestinal epithelium in the 1.5 days chicken embryo using electroporation. In this study, constructs with either Sox2 or CdxA sequence was flanked by two Tol2-transposon elements and a construct encoding transposase were used with the aim to integrate Sox2 or CdxA along with chicken β-actin promoter into the genome.
Electroporated embryos were incubated for 12 days and the stomach and the intestines were fixed and sectioned. The Expression of differentiation makers of stomach and intestinal epithelium were detected by in situ hybridization. cSP which is expressed in lumen epithelium of the stomach, ECPg which is expressed in the stomach glands
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epithelium, and iFABP which is expressed in the intestinal epithelium were used as marker genes.
In the duodenum of 12 days embryo overexpressing Sox2, CdxA expression was suppressed, and villi structures were perturbed. However, ectopic expressions of differentiation marker genes of the stomach were not detected. On the other hand, in the stomach of 12 days embryo with overexpressing CdxA, Sox2 and differentiation marker genes of stomachexpressions were suppressed. Also, iFABP expression was detected.
Next, I analyzed the effects of CdxA expression in the epithelium, already expressing Sox2. CdxA was introduced in the proventriculus epithelium of the 6-day embryo.
Thereafter, tissues were cultured for 4 days. CdxA induced the expression of differentiation markers of the intestinal epithelium and inhibited the expression of differentiation marker of the stomach epithelium.
In conclusion, our results suggest that Sox2 suppresses CdxA expression and affects morphogenesis in the intestine, but cannot induce stomach differentiation. CdxA suppresses Sox2 and differentiation marker of the stomach and can induce intestinal differentiation.
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4. 序論
消化管は内胚葉由来の上皮とその周りを囲う中胚葉由来の間充織によって形成される。
ニワトリ胚の消化管は、原腸形成後の最も腹側に内胚葉がシート状に拡がり、前方の内胚葉 の先端が腹側に折れ曲がることで前腸を、後方の端が折れ曲がることによって後腸を形成 する(Romanoff, 1960)。前腸は後方に、後腸は前方に伸長することで一つの管となる。この ようにはじめは単純な管状の消化管は発生が進むにつれ、形態や機能の全く異なる消化器 官へ分化する。例えば、胃は内腔側に粘液を作る上皮と消化液を産生する腺上皮を持ち、消 化に働く(San Roman and Shivdasani, 2011; Yasugi and Mizuno, 1981)。一方、腸の上皮は 絨毛を形成し、栄養の吸収を行う(Burgess, 1975)。ニワトリ胚発生初期の内胚葉で、各消化 器官の予定領域で特異的に発現する遺伝子が同定されている。
ニワトリ胚の胃と腸のそれぞれの予定領域の内胚葉で特異的に発現する転写因子が知ら れている。転写因子cSox2（SRY-related HMG box-containig gene 2）は1.5日胚から発現 を始め、食道と胃内胚葉に特異的に発現しているため(Okubo, et al., 2005; Ishii, et al., 1998)、
前方消化管上皮の分化に重要であると考えられている(Williamson, et al., 2006; Okubo, et al., 2005; Ishii, et al., 1998)。一方、転写因子CdxA（caudal type homeobox A）は消化管後 方で1.5日胚から発現する。十二指腸、小腸、大腸内胚葉で特異的に発現し、後方消化管上 皮の分化に重要であるとされている(Ishii, et al., 1997)。マウスでも同様に胃を含む前方消 化管内胚葉で Sox2 が、後方の腸内胚葉で Cdx1,2 が発現している(Silberg, et al., 2000)。
Sox2、Cdx2の変異マウスでそれぞれの上皮の形態形成や分化に異常が見られることが報告 されている(Stringer, et al., 2012; Gao, et al., 2009; Que, et al., 2007)。Sox2を低発現する変 異マウスでは、胃の前方の形態が胃後方様な形態になり、前方消化管上皮のマーカーの発現 が減少する(Que, et al., 2007)。また、消化管上皮特異的なCdx2ノックダウンマウスでは、
絨毛構造に異常があり、腸マーカーの発現が減少する(Gao, et al., 2009)。これらのことか ら、Sox2とCdxが胃と腸の器官形成に必要な因子であると考えられる。ここで私はこれら 遺伝子が単独で胃と腸の上皮分化を誘導することができるのか疑問を持った。
当研究室の先行研究で、ニワトリ胚1.5日胚にプラスミドDNAを導入し、予定腸上皮に Sox2を、予定胃上皮に CdxAを強制発現する実験が行われている。1日後の胚で、それぞ れ強制発現が行われた場所において腸上皮でCdxAの発現が、胃上皮でSox2の発現が抑え られた。このことから、Sox2 と CdxA がお互いの発現を抑制することが示唆された
（Watanabe. 修士論文）。しかし、細胞に導入したプラスミドDNAは導入後2日までに分 解されてしまうため、Sox2とCdxAの異所的発現の上皮細胞の分化への影響については調 べられていない。そこで、本研究では異所的なSox2、CdxAの発現が胃上皮や腸上皮を誘導 することができるのか調べることにした。長期的に Sox2 や CdxA を発現させるために、
Tol2トランスポゾンとトランスポゼースを用いた。1.5日胚の予定腸領域にSox2を、予定
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胃領域にCdxAを強制発現させ、12 日胚まで培養し、器官ごとに連続切片を作成し、切片 in situ hybridization法で胃上皮分化マーカーと腸上皮分化マーカーのmRNAの発現を調べ た。十二指腸における異所的なSox2の発現は、CdxAの発現を抑え、絨毛構造を崩した。
しかし、胃上皮分化マーカーの発現は検出されなかった。胃における異所的なCdxAの発現 は、Sox2 の発現を抑え、胃上皮分化マーカーの発現も抑えた。また、一部で腸上皮分化マ ーカーの発現が見られた。これらのことから、Sox2 単独では胃上皮の分化を誘導できない が、CdxA は単独で未分化な消化管を腸上皮へ分化誘導できることが考えられた。そこで、
既にSox2 の発現している消化管の細胞分化をCdxA は変えられるのか調べることにした。
6日胚の前胃にCdxAを強制発現させ、4日組織培養後、連続切片を作成し、分化マーカー の発現を調べた。CdxAを強制発現させた前胃においても、腸上皮分化マーカーの発現が検 出され、胃上皮分化マーカーの発現が抑えられた。これは、Sox2 がすでに発現している消 化管においても、CdxAが腸上皮へと分化誘導を行うことを示唆している。
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5. 材料・方法
ニワトリ胚
ニワトリ（Gallus gallus）の受精卵を、実験に必要な発生段階のニワトリ胚が得られるよ うに、38℃で培養した。発生段階は孵卵器での培養開始からの日数で示す。
Sox2およびCdxAの強制発現実験
CAGGS-td Tomato コンストラクトと CAGGS-transposase(Sato, et al., 2008)、及び
CAGGS-Sox2コンストラクトまたはCAGGS-CdxAコンストラクト（当研究室、福田作成）
を用いた。CAGGS-Sox2とCAGGS-CdxA、CAGGS-td TomatoはそれぞれTol2-transposon 配列によって挟まれており、CAGGS-transposase と共に細胞に導入されることで、Tol2- transposon配列に挟まれた部位がニワトリ胚のゲノムに挿入される(Sato, et al., 2007)。
in ovoエレクトロポレーション
38℃の孵卵器で 40 時間培養した受精卵の気室側の殻と内卵殻膜を破る。Tol2-CAGGS-
Sox2またはTol2-CAGGS-CdxAが3 µg/µl、Tol2-CAGGS-td Tomatoが2 µg/µl、CAGGS- transposaseが1.25 µg/µl になるようにTEに溶かし、1％Fast Greenと2.5％スクロースを 加えて調整したDNA溶液をキャピラリーで内胚葉の腹側に注入した(Simkin, et al., 2014;
Fukuda, 2009)。胚の腹側下層に陰極を差し込み、背側に陽極を重ね、CUY21（BEX CO.,
LTD）エレクトロポレーターで10 Vの電気パルスを50 msecで5回、900 msecごとに与
えた。卵はスコッチテープで封をし、38℃で孵卵開始12日後まで培養した。
エレクトロポレーションによる前胃上皮へのプラスミドDNAの導入
ガラスディッシュに白金電極を固定し、縦5 mm、横8 mm、高さ7 mmのチャンバーを 電極と樹脂で作成する。1％ アガロース/TE のゲル容器をチャンバーに入れ、ゲル容器内 にDNA溶液を10 µl 入れる。ゲル容器とチャンバーの間はTEで満たす(Sakamoto, et al., 2000)。
6日胚を解剖し前胃を取り出す。前胃を切り開いて、前胃の上皮が陰極に向くようにDNA 溶液を入れたゲル容器に入れる。DNA 溶液には Tol2-CAGGS-CdxA が 200nM、Tol2- CAGGS-td Tomatoが65 nM、CAGGS-transposaseが65 nMになるようにTEに加えた。
CUY21エレクトロポレーターで30 Vの電気パルスを50msecで10回、75 msecおきに与 えた。組織はパネートコンプテン液で洗い、4日組織培養した。
13 組織培養
2つの前胃を並べてNucleoporeフィルター（Whattman, 110409）に置く。12穴のculture ディッシュの上に格子状のステンレスの台を置き、その上にフィルターを乗せる。組織を埋 めないようにフィルターに届く量の50％ embryo extractを含む199培地（Gibco）を入れ、
CO2インキュベーターを用い37℃、5％ CO2 95% airで4日培養した。培地は2日ごとに 新しい培地に交換した(Urase, et al., 1996)。
切片in situ hybridization
12日胚の器官や、人工培養組織をPBSに溶かした4％ アルデヒド溶液で、4℃で一晩固 定した。その後、PBS に溶かした 30％スクロースに 4℃で置換した。O.C.T.compound
（Sakura Finetechnical Co., Ltd.）で包埋し、-80℃で凍結した。クライオスタット（Thermo Fisher Scientific, NX70）で12 µm の凍結切片を作成した。切片はVECTERBOND（Vector laboratories）コーティングしたスライドグラスにのせた。
cDNAを元に精製したジゴキシゲニン（DIG）でラベリングされたアンチセンスRNAプ ローブに、抗DIG抗体を用いることでmRNAを検出した (Ishii, et al., 1997)。CdxA (Ishii, et al., 1997)、iFABP (MRC Geneservice, Cambridge)、Sox2 (Uwanogho, et al., 1995)、
cSP(Tabata and Yasugi, 1998)、ECPg (Hayashi, et al., 1988a)のプローブを用いて切片in situ hybridizationを行った。
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6. 結果
12日胚における胃・腸上皮分化マーカー遺伝子の発現パターン
強制発現実験を行うにあたり、遺伝子の導入された消化管上皮の細胞分化への影響を調 べるため、胃・腸上皮の分化マーカーの発現パターンを確認した。
まず胃上皮の分化マーカーとしてcSP、ECPgの発現を調べた。cSP（chicken spasmolytic polypeptide）はニワトリ胚の内腔上皮で発現している(Sakamoto, et al., 2000; Tabata and Yasugi, 1998)。ECPg（embryonic chicken pepsinogene）は前胃の腺上皮で分泌するペプシ ノゲンの遺伝子である(Yasugi, et al., 1991; Hayashi, et al., 1988a; Hayashi, et al., 1988b)。
次に腸上皮の分化マーカーとして iFABP の発現を調べた。小腸脂肪酸結合タンパク質
（intestinal fatty acid binding protein：iFABP）はシステインを多く含む低分子のタンパク 質で、分化した十二指腸、小腸上皮で発現している(Hiramatsu and Yasugi, 2004)。
これらの胃・腸上皮の分化マーカーの発現を12日胚の前胃、砂嚢、十二指腸、小腸で それぞれ連続切片を作成し、in situ hybridization法で検出した（Fig.1）。12日胚の胃の前 胃、砂嚢の上皮でSox2が発現していた（Fig.1C,H）。胃上皮の分化マーカーであるcSPは 前胃と砂嚢の内腔上皮で発現しており（Fig.1D,I）、ECPgは前胃の腺上皮において発現が 検出された（Fig.1E）。腸上皮ではcSPやECPgの発現は検出されなかった
（Fig.1N,S,O,T）。腸の十二指腸と小腸上皮でCdxAの発現が見られる（Fig.1K,P）。 iFABPは小腸上皮で発現が検出されたが（Fig.1Q）、12日胚ではまだ十二指腸の上皮での 発現は検出されなかった（Fig.1L）。また、前胃・砂嚢上皮でのiFABPの発現は見られな かった。本実験の結果はこれまでの報告と同様であり、本研究では胃上皮の分化マーカー としてcSPとECPgを、腸上皮の分化マーカーとしてiFABPを用いて、以下の実験を行 った。
長期的な遺伝子強制発現実験方法の検討
Sox2やCdxAを異所的に強制発現させた先行研究では、1.5日胚にウイルス由来のエン ハンサーとプロモーターの下流にSox2、CdxAをそれぞれ繋げたコンストラクトを持つプ ラスミドDNA（pME18S-Sox2（Ishii, unpublished）, pME18S- CdxA（Koike,
unpublished））をin ovoエレクトロポレーションで内胚葉に導入し、遺伝子の強制発現を
行っていた。一般的に、プラスミドを導入するだけでは、一時的に強制発現はできるが、
導入したプラスミドDNAは1日から2日で分解されてしまうため、導入した遺伝子の発 現を長期的に維持することができない(Sato, et al., 2007)。そこで本研究では、Tol2トラン スポゾンとトランスポゼースを用いた。この方法では、Tol2トランスポゾン配列で挟んだ
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遺伝子を、トランスポゼースにより切り出し、ニワトリ胚のゲノムに挿入する(Sato, et al., 2007)。サイトメガロウイルスのエンハンサーとニワトリβアクチンプロモーターを繋げ たCAGGSプロモーターの下流に目的の遺伝子（Sox2、CdxA、EGFP、td Tomato）を繋 げたコンストラクトをTol2トランスポゾン配列で挟んだプラスミドDNAと、CAGGSプ ロモーターの下流にトランスポゼースを繋げたプラスミドDNAをエレクトロポレーショ ン法で細胞に一緒に導入することによって、目的の遺伝子がゲノムに挿入されると考えら れる。このTol2トランスポゾンとトランスポゼースを用いた方法により、Sox2とCdxA が長期的に異所的発現をし続けることが可能であると考えた。実際にTol2トランスポゾ ンとトランスポゼースを用いてtd TomatoやSox2、CdxAを導入したところ、これらの遺 伝子が導入10日後でも消化管上皮に発現していることが示された（fig.2A,G,J
Fig.3A,G,H,M,N Fig.4A,G,H）。
12日胚の十二指腸上皮におけるSox2の強制発現の影響
胃上皮で発現するSox2を未分化の予定腸領域で長期間強制発現することで、その部位 の細胞分化へ影響を与えるか調べるため、1.5日胚の胃/腸境界付近の内胚葉にTol2- CAGGS- Sox2とTol2-CAGGS-td Tomato、CAGGS-transposaseをin ovoエレクトロポ レーション法により同時に導入した。その後、12日胚まで培養し、解剖して消化管を取り 出し、固定した。蛍光実体顕微鏡で腸にtd Tomatoの蛍光が見られたもののみ、凍結切片 を作成した。
Sox2を強制発現させた十二指腸の胃上皮分化マーカーと腸上皮分化マーカーの発現を切 片in situ hybridization法で調べた（Fig.2）。コントロールとして、Sox2の代わりにTol2-
CAGGS-EGFPベクターを強制発現させた胚の実験結果を提示した（Fig.2A-F）。Sox2を
強制発現させた（Sox2 OE）胚で、td Tomatoの蛍光が見られた細胞の近傍でSox2の異所 的な発現が見られた（Fig.2J）。また、CdxAの発現が減少していることが見られた
（Fig.2H ; 例数: 9/9）。12日胚の十二指腸では腸上皮の分化マーカーであるiFABPがまだ 発現しておらず、コントロール胚とSox2 OE胚のどちらにおいても発現は検出されなかっ た（Fig.2I ; 9/9）。Sox2の発現細胞の近傍で、胃上皮の分化マーカーであるcSP、ECPg の発現の上昇は確認されなかった（Fig.2K,L ; 9/9）。一部のSox2発現場所で絨毛が崩れ、
上皮が厚くなっているのが確認された（Fig.2J ; 3/9）。しかし、胃上皮で特徴的に見られる 腺構造は見られなかった（Fig.1C, Fig.2J）。
結果をまとめると、異所的なSox2単独の発現は、十二指腸上皮においてCdxAの発現 を減少させるが、腸上皮の分化への影響は分からなかった。また、腸上皮の構造である絨 毛は崩れたが、腺構造は誘導しなかった。
16 12日胚の胃上皮におけるCdxAの強制発現
次に、腸上皮で発現するCdxAを未分化の予定胃領域で長期間強制発現することで、そ の部位の細胞分化へ影響を与えるか調べるため、1.5日胚の胃/腸境界付近の内胚葉に Tol2-CAGGS-CdxAとTol2-CAGGS-td Tomato、CAGGS-transposaseをin ovoエレクト ロポレーション法により同時に導入した。
CdxAの強制発現させた（CdxA OE）12日胚の前胃と砂嚢の組織切片を調べた
（Fig.3,4）。コントロールとして、CdxAの代わりにTol2-CAGGS-EGFPベクターを強制 発現させた（Fig.3A-F, Fig.4A-F）。CdxA OE胚の前胃と砂嚢において、td Tomatoの蛍光 が見られた細胞の近傍でCdxAの異所的な発現が見られた（Fig.3G,H ,Fig.4G,H ）。CdxA OE胚の胃域おいて、CdxAの発現細胞の近傍でSox2の発現が抑えられていた（Fig.3J ;
5/5, Fig.4J ; 2/2）。また、同部位において胃上皮の分化マーカーであるcSP、ECPgの発現
が抑えられているのが確認された（Fig.3K,L ; 5/5）。胃上皮分化マーカーの発現の減少は 砂嚢でも確認された（Fig.4K ; 2/2）。また、CdxA OE胚の前胃において、CdxA発現細胞 に隣接して腸上皮分化マーカーであるiFABPの発現が検出された（Fig.3O ; 2/5）。しか し、CdxAの強制発現で胃上皮が絨毛を作ることは確認できなかった（Fig.3H,N, Fig.4H）。
以上の結果から、CdxA単独の発現により、Sox2の発現は抑制され、胃上皮の形態形成 も抑制することが考えられる。また、腸上皮分化マーカーを発現させることから、未分化 な消化管上皮を腸上皮細胞へと誘導することが示唆された。
6日胚の前胃へのCdxAの強制発現
CdxAは単独で未分化な消化管上皮細胞を腸細胞へ誘導することが示唆されたため、
CdxAの発現がSox2を既に発現している消化管上皮細胞も腸細胞へ誘導することができる のか調べることにした。Sox2は発現しているが、まだ分化マーカーの発現していない6日 の前胃にTol2-CAGGS-CdxAとTol2-CAGGS-td Tomato、CAGGS-transposaseをエレク トロポレーション法で導入した。遺伝子導入を行った前胃は、4日組織培養を行い、固定 をした後、凍結切片にした。
6日胚の前胃にCdxAを強制発現させた組織を切片in situ hybridization法で胃上皮分化 マーカーと腸上皮分化マーカーの発現を調べた（Fig.5, 6）。コントロールには、CdxAの
代わりにTol2-CAGGS-EGFPベクターを用いた。4日培養した組織でCdxAの発現が観察
され、隣接した切片で腸上皮の分化マーカーであるiFABPの発現が検出され、胃上皮分化 マーカーであるcSPの発現が減少しているように見えた。（Fig.5H,I,K）。しかし、本実験 で用いた凍結切片は12umの厚さのため、２枚以上離れた切片ではCdxAが導入された細 胞の近隣であるということが難しいため、CdxAとiFABPの発現、およびCdxAとcSPの
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発現が本当に近隣で起こっているかを確認する必要がある。そこで、２つの遺伝子の発現 を隣あった切片で観察を行った。
2つの遺伝子のみを調べた隣接切片においても、CdxA発現細胞の隣の切片でiFABPの発 現が観察された（Fig.6B, C）。また、胃上皮分化マーカーであるcSPの発現が減少してい るのが確認された（Fig.6E, F）。
以上の結果から、CdxAは既にSox2が発現している消化管上皮でも、腸上皮分化マーカ ーを誘導し、胃上皮分化マーカーの発現を抑制できることが分かった。
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7. 考察
本研究では消化管上皮にSox2やCdxAを異所的に強制発現させ、細胞分化への影響を調 べた。その結果、Sox2の単独での発現は腸上皮において、CdxAの発現を抑制するが胃上皮 への分化を誘導できないことが示唆された。また、CdxA単独の強制発現は未分化な消化管 及びSox2の発現している消化管において、Sox2の発現や胃への分化を抑制し、腸上皮へと 分化を誘導しうることが示唆された。
Sox2 を低発現する変異マウスにおいて消化管前方の形態が変異し、分化マーカーの発現 の減少が見られることから(Que, et al., 2007)、Sox2は食道や胃の分化に必要であることが 考えられる。今回の結果で、未分化の消化管上皮においてSox2を単独で強制発現させた時 に、腸上皮を胃上皮へ細胞分化させることはできなかった。眼においてSox2が転写調節因 子をコードする Pax6 とダイマーを形成して、レンズを誘導することが知られている (Kamachi, et al., 2000)。似たようなことが消化管上皮でも起きていると考えると、胃上皮に おいても他の転写調節因子、例えばGATA５(Sakamoto, et al., 2000; Laverriere, et al., 1994) とダイマーを形成して、胃上皮の分化を誘導している可能性がある。また、消化管特異的な Cdx2ノックアウトマウスでは、Cdx2の発現が抑えられた腸上皮でSox2の発現が上昇する が(Gao, et al., 2009)、Sox2 の低発現マウスでは，Cdxの発現は誘導されない(Que, et al.,
2007)。これらの結果と合わせると、消化管上皮にもともと Sox2 が発現するコンピテンス
があり、Cdxによりその発現が抑えられていること、Sox2はさらに別の因子とともに胃の 上皮分化を調節することが考えられる。
CdxAを消化管特異的にノックアウトしたマウスにおいて、絨毛が乱れ、腸のマーカー遺 伝子の発現が減少していることから(Gao, et al., 2009)、CdxAが腸上皮の分化において必要 であることが考えられる。今回の結果と合わせ、CdxA単独の発現が未分化な消化管上皮と Sox2 の発現している消化管上皮を腸上皮へ細胞分化を誘導するのに十分であることが示唆 された。
今回の実験では、Sox2 とCdxAの強制発現では、胃上皮の腺構造や腸上皮の絨毛を作る ことは出来なかった。上皮と間充織の組み合わせ実験により、上皮の形態形成や分化に間充 織が関わることが報告されている(Kim, et al., 2005; Hiramatsu and Yasugi, 2004; Yasugi, et al., 1991; Hayashi, et al., 1988b; Ishizuya-Oka and Mizuno, 1984; Yasugi and Mizuno, 1974)。
例えば、ニワトリの2日胚の予定胃上皮と6 日胚の小腸間充織を組み合わせた時に絨毛様 構造が見られスクラーゼを発現しており、予定腸上皮と 6 日の前胃間充織を組み合わせた 時、腺構造を作ることが分かっている(Yasugi, et al., 1991)。このことから、胃や腸の上皮に おける形態形成には、胃・腸の間充織からの作用が大事であり、そのためSox2やCdxAを 異所的に発現させた今回の実験では形態の変化が得られなかったと考えている。
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本研究は、発生生物学研究において、消化器官を形成する上でSox2とCdxAが正常な位 置で発現することの重要性を示唆した。この位置の決定にSox2とCdxAがお互いの発現を 抑制する働きが関わると考えている。しかし、ニワトリの 8 日胚より若い胚で胃と腸の境 界において、Sox2 と CdxAが同細胞で共発現していることが分かっており（Kurishita, 修 士論文, Watanabe, 修士論文）、この領域の運命の決定についてはより詳しい研究が必要で ある。
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Figure 1 胃・腸上皮分化マーカーの発現パターン
12日胚の前胃、砂嚢、十二指腸、小腸上皮における、胃上皮分化マーカー（cSP、ECPg） の発現と腸上皮分化マーカー（iFABP）の発現を示す。それぞれの器官ごとに連続切片で並 んでいる。前胃の上皮では、Sox2が発現しており（C）、内腔上皮ではcSPが、腺上皮では ECPgが発現している（D,E）。砂嚢上皮でも、Sox2が発現しており、内腔上皮ではcSPの 発現している（H,I）。cSPとECPgは十二指腸、小腸では発現していない（N,O,S,T）。
腸上皮において、CdxAが発現している（K,P）。小腸上皮において、iFABPが発現してお り、十二指腸上皮では発現していない（L,Q）。胃域では腸上皮の分化マーカーの発現は見 られなかった（B,G）。Scale bar = 200 µm。
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Figure 2 12日胚の十二指腸におけるSox2の強制発現
1.5日胚の消化管上皮にSox2を強制発現させた12日胚の十二指腸の連続切片を示した。
Sox2を強制発現させたものをSox2 OEとし（G-L）、Sox2の代わりにEGFPを導入したも
のをtd Tomato OEとした（A-F）。十二指腸においてSox2が強制発現され、近傍の細胞で
CdxAの発現が減少した（H,J）。Sox2発現細胞の近傍で胃上皮分化マーカーの発現は見られ なかった（K,L）。Scale bar = 200 µm。
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24 Figure 3 12日胚の前胃におけるCdxAの強制発現
1.5 日胚の消化管上皮に CdxA を強制発現させた 12 日胚の前胃の連続切片を示した。
CdxAを強制発現したものをCdxA OEとし（G-O）、CdxAの代わりにEGFPを導入したも のをtd Tomato OEとした（A-F）。前胃でCdxAが発現しており、近傍でSox2の発現が減 少した（H,J）。cSP、ECPgの発現が減少した（K,L）。CdxA発現細胞に隣接してiFABPが 発現した（N,O）。Scale bar = 200 µm。
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26 Figure 4 12日胚の砂嚢におけるCdxAの強制発現
1.5日胚の消化管上皮にCdxAを強制発現させた12日胚の砂嚢の連続切片を示した。砂嚢 において、CdxAの発現した細胞の近傍で、Sox2とcSPの発現が減少した（J,K）。Scale bar
= 100 µm。
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28 Figure 5 6日胚前胃にCdxAを強制発現した組織
6 日胚前胃にCdxA を強制発現させ、4 日組織培養した組織の連続切片を示した。CdxA を強制発現したものをCdxA OE とし（G-R）、CdxAの代わりにEGFPを導入したものを td Tomato OEとした（A-F）。Scale bar = 100 µm。
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30 Figure 6 6日胚前胃にCdxAを強制発現した組織
6 日胚前胃にCdxA を強制発現させ、4 日組織培養した組織の連続切片を示した。CdxA を発現した細胞に隣接した切片における腸上皮分化マーカー（A-C）と胃上皮分化マーカー
（D-F）の発現を調べた。CdxA発現細胞と隣り合った切片でiFABPの発現している（B,C）。 CdxA発現した細胞の隣の切片でcSPの発現が減少した（E,F）。Scale bar = 100 µm。
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