子宮内膜症病巣における Angiotensin Ⅱ type1 (AT1), type 2 (AT2) receptors 発現について

子宮内膜症病巣における Angiotensin Ⅱ type1 (AT1), type 2 (AT2) receptors 発現について

日本大学大学院医学研究科博士課程 外科系産婦人科学専攻

仲尾 岳大

修了年 2015 年

指導教員 山本 樹生

子宮内膜症病巣における Angiotensin Ⅱ type1 (AT1), type 2 (AT2) receptors 発現について

日本大学大学院医学研究科博士課程 外科系産婦人科学専攻

仲尾 岳大

修了年 2015 年

指導教員 山本 樹生

ア）概要

【目的】レニン‐アンジオテンシン系rennin-angiotensin system(RAS)は、血管緊張、腎 における血行力学、水電解質バランスを調節し、血圧を変化させている。近年、子宮内 膜組織におけるangiotensin receptorの存在が証明され、子宮内膜間質細胞endometrial stromal cells (ESC)においてangiotensinⅡは、angiotensin Ⅱ type 1(AT1) receptorを介して 調節されていることが報告された。今回、著者は子宮内膜症病巣におけるangiotensin Ⅱ type1(AT1),type2(AT2) receptor発現および、COX-2, mPGES-1との相関を解析し子宮内膜 症の病態と関連しているか検討した。

【方法】Informed consentのもと当施設で手術を受けた子宮内膜症患者29例より摘出し

た子宮内膜症病巣を対象とし、子宮内膜症を伴わない婦人科良性疾患患者15例より摘 出した正所性子宮内膜を対照とした。検体は摘出後に-80℃に凍結保存しqRT-PCRを行 い、AT1,AT2 receptor mRNA発現とCOX-2, mPGES-1 mRNA発現について解析、検討し た。更に免疫組織化学染色を施行しAT1, AT2 receptor蛋白産生についても検討した。

【結果】コントロール群（非子宮内膜症群）の正所性子宮内膜AT1 receptor mRNA発現 は、増殖期に比較し分泌期において有意に増加していた。卵巣子宮内膜症性嚢胞壁にお

けるAT1 receptor mRNA発現はコントロール群の増殖期正所性子宮内膜に比較し有意に

増加していた。卵巣子宮内膜症性嚢胞壁におけるAT1 / AT2 mRNA発現比はコントロー ル群の増殖期正所性子宮内膜および子宮内膜症群の増殖期正所性子宮内膜に比較し有 意に増加していた。子宮内膜症腹膜病変におけるAT1 / AT2 mRNA発現比はコントロー ル群の増殖期正所性子宮内膜に比較し有意に増加していた。

子宮内膜症組織におけるAT1, AT2 receptor mRNA発現はCOX-2と正の相関を認めた。

子宮内膜症組織におけるAT1 / AT2 mRNA発現比はmPGES-1と正の相関を認めたが、

一方で非子宮内膜症群の正所性子宮内膜におけるAT1 / AT2 mRNA発現比はCOX-2,

mPGES-1のいずれも相関を認めなかった。

免疫組織化学染色よりAT1, AT2 receptorは正所性子宮内膜および子宮内膜症病巣に おいていずれも蛋白産生を認めた。

【結論】子宮内膜症組織におけるAT1,AT2 receptorが発現しレニン‐アンジオテンシン 系が子宮内膜症の病態形成に関与する可能性が示唆された。

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イ）緒言

子宮内膜症（endometriosis）とは子宮内膜組織に類似する組織が子宮内腔以外の部位 で発生・発育する類腫瘍として取り扱われる疾患である。病巣は主として骨盤内である。

子宮体部筋層に存在するものを子宮腺筋症（adenomyosis）と呼ぶが子宮内膜症とは区 別される。

子宮内膜症は月経困難症、性骨盤痛、性交痛、排便痛、腰痛といった疼痛だけでなく 不妊の原因、悪性腫瘍の発生母地にもなり得る。妊娠可能女性の約10～15%に合併して いると言われている ¹。近年子宮内膜症患者は増加傾向にあり、社会的関心が高まって いる。

子宮内膜症の病因は未だに確定していない。歴史的には体腔上皮化生説がもっともと 古くより言われている ²。胸膜や腹膜に発生する子宮内膜症などは化生説で説明しやす い。しかし子宮内膜症の好発部位である腹膜に化生が生じやすいのかを裏付ける事実は ない。一方Sampsonにより提唱された移植説が現在最も広く受け入れられている³。月 経血が腹腔内に貯留し、生着可能な子宮内膜細胞が移植することによると考えられてい る。しかし移植した直後の病巣が確認されないことや正常腹膜に連続的に移行すること などから移植説では説明できない点もある。子宮内膜組織が移植する際に新たな血流の 形成は重要であり、子宮内膜症の病態において血管新生や血管リモデリングは重要であ ると考えられている⁴。

異所性子宮内膜はProstaglandin（PG）を産生することが知られている。ＰＧは炎症や 疼痛に関連するだけでなく子宮内膜症の病態に関連していると考えられている ^{5, 6}。特 に PGE2は細胞増殖、アポトーシスの抑制、免疫抑制、血管新生に関連している ⁷。子 宮内膜症病巣ではPGの律側酵素であるCyclooxygenase-2（COX-2）やCOX-2産物であ るPGH2をPGE2へ変換する誘導型microsomal prostaglandin E synthase-1（mPGES-1）が 増殖していることが報告された^8-10。

レニン‐アンジオテンシン系rennin-angiotensin system(RAS)は、血管緊張、腎におけ る血行力学、水電解質バランスを調節し、血圧を変化させる ¹¹。AngiotrndinⅡ receptor はType1（AT1 receptor）、Type2（AT2 receptor）に分類される¹²。AT1 receptorは細胞増 殖や炎症細胞浸潤と関連があると言われている^{13, 14}。一方AT2 receptorは細胞増殖抑制、

抗炎症作用、アポトーシスの誘導と関連があると言われ、概ね AT1 receptor と AT2 receptorは相反する作用を持つと言われている ¹⁵。そのため病態とAT1/AT2 receptor発 現比が注目されている。

ヒト子宮内膜組織においてAT1 receptorおよびAT2 receptorが発現しており、各月経 周 期 で 発 現 が 異 な る こ と が 報 告 さ れ た ^{16, 17}。 ブ タ 子 宮 内 膜 間 質 細 胞 に お い て angiotensinⅡはAT1 receptorを介して細胞内カルシウムの濃度を上昇させることが報告 された ¹⁸。またラットの子宮内膜間質細胞において angiotensinⅡは calcineurin/NFAT signaling pathwayを介してCOX-2を誘導することが報告された¹⁹。

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子宮内膜症の病態は現在も明らかになっていない。子宮内膜組織にAT1, AT2 receptor が発現し、月経周期と関連していることが報告されているが子宮内膜症での検討は未だ されていない。そのため子宮内膜症におけるレニンアンジオテンシン系の関連について 検討することとした。レニンアンジオテンシン系と血管新生や血管リモデリングが関連 することは知られており、AngiotensinⅡが COX-2 を誘導することが報告された。子宮 内膜症の病態に血管新生や血管リモデリングは重要である。そのためレニンアンジオテ ンシン系がアラキドン酸カスケードを介して子宮内膜症の病態に関連していると仮説 を立て検証することとした。

本検討において著者は子宮内膜症病巣におけるAT1 receptor, AT2 receptor mRNA発現 および蛋白産生を解析し、COX-2, mPGES-1 mRNA発現との相間を解析検討した。

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ウ）方法 (1) 対象

当院で2004年から2013年の間に開腹手術または腹腔鏡下手術を施行した婦人科良性 疾患患者を対象とした。日本大学医学部附属板橋病院臨床研究審査委員会の承認（整理 番号：RK-130412-1）を受け対象者には詳細なinformed consentの後に研究を行った。

子宮内膜症患者32人より採取した卵巣子宮内膜症性嚢腫壁組織29検体、正所性子宮 内膜組織 7 検体、子宮内膜症腹膜病変組織5 検体を対象とした。非子宮内膜症患者15 人より採取した子宮内膜組織 15検体をコントロール対象とした。子宮内膜組織の月経 周期を同定した。子宮内膜症患者より採取した正所性子宮内膜組織7検体を増殖期3検 体および分泌期4検体に分類した。非子宮内膜症患者より採取した子宮内膜組織15検 体を増殖期5検体、分泌期5検体、月経期5検体に分類した (Table 1)。

(2) 患者背景

卵巣子宮内膜症性嚢胞患者は29名（median: 39歳、range: 29歳～53歳）、収縮期血圧 はmedian: 112 mmHg、range: 91-156 mmHg、拡張期血圧はmedian: 73 mmHg、range: 56-94 mmHg、心拍数はmedian: 72回/分、range: 56-95回/分であった。29名のうち1名が既往 に本態性高血圧を指摘され持続性カルシウム拮抗薬を内服し基準値140 / 90mmHg未満 にコントロールされていた。2 名が既往に高血圧症を指摘されていないが、血圧 140 /

90mmHgを超えており白衣高血圧と考えられた。10名に高血圧の家族歴を認めた。

非子宮内膜症の婦人科良性疾患患者は15名（median: 43歳、range: 35歳～48歳）、収 縮期血圧はmedian: 116 mmHg、range: 102-156 mmHg、拡張期血圧はmedian: 70 mmHg、 range: 62-94 mmHg、心拍数はmedian: 73回/分、range: 60-115回/分であった。全ての症 例に既往に高血圧を認めなかった。2名が白衣高血圧と考えられた。5 名に高血圧の家 族歴を認めた。非子宮内膜症患者の詳細は子宮筋腫が 13名、子宮頚部上皮高度異形成 が1名、子宮内膜ポリープが1名であった。

両群において、年齢、収縮期および拡張期血圧、心拍数はいずれも両群間に有意差を 認めなかった 。既往に本態性高血圧または白衣高血圧を持つオッズ比は 0.75、95%信

頼区間は0.11-5.06であった。高血圧の家族歴を認めるオッズ比は1.05、95%信頼区間は

0.28-3.94であった(Table 2)。

(3) 免疫組織化学染色

免疫組織化学染色目的に採取した検体は10%ホルマリンで固定処理し、パラフィンに 包埋した。検体を4μmの厚さに薄切し、APS(アミノシラン)コーティングしたスライド グラスに載せた。組織薄切スライドをキシレンで脱パラフィン化し、エタノールで再水 和した。0.3%過酸化水素水とメタノール混合液に30分間浸し、内在性ペルオキシダー ゼ活性を除去した。マイクロウェーブを作動させ抗原を回復させた。5分間の冷却の後

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にブロッキング液を乗せブロッキングを行った。

一 次 反 応 抗 体 と し て 、AT1 receptor に つ い て は rabbit polyclonal antibody to Anti-Angiotensin Ⅱ Type 1 Receptor (ab133705, Abcam Inc, Cammbridge, MA, USA)を使用 し、AT2 receptor については rabbit polyclonal antibody to Anti-Angiotensin Ⅱ Type 2 Receptor ( ab 19134, Abcam Inc, MA, USA)を使用した。AT1 receptorの1次抗体を200倍 に希釈し37℃60分間、AT2 receptorの1次抗体を250倍に希釈し37℃60分間反応させ た。

二次抗体反応として、ヒストファインシンプルステインMAX-PO (R)（ニチレイバイ オサイエンス, 東京, 日本）を用いて発色させた。

染色された組織標本を3名が別々に鏡検した。腺上皮細胞と間質細胞について、強く 染色されたものを３、中等度染色されたものを２、軽度染色されたものを１、全く染色 されなかったものを０とし4段階で評価した。3名の評価の平均値を元に解析した。典 型例を示す（Figure 1）。

(4) 鋳型DNAの調整および qRT-PCR

Messenger RNA分析を目的に採取した検体は採取直後から分析まで-80℃に凍結し保

存した。検体を粉砕の後、TRIZOL Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)を用いてtotal RNA を抽出した。抽出した total RNA を鋳型にして High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Fostercity, CA, USA)を用いてss-cDNAを作製した。

反応液20μlはtotal RNA 500ngを含み、25℃10分、37℃120分、85℃5分で保温し逆転 写反応を行った。

Quantitative RT-PCRを用いてAT1, AT2 receptor, COX-2, mPGES-1 mRNA発現定量を行 った。Thermal Cyclerは7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)を用い、DNA polymeraseはiQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hecules City, CA, USA)を用いた。Run methodについて、Holding stageは95℃3分、Cycling stage は95℃15秒、annealing temperatureは60℃60秒を合計45サイクル、Melt curve stageは 95℃15秒、60℃1分、95℃30秒、60℃15秒であった。

使用したprimerの塩基配列を以下に示す。

ＡT1 receptor²⁰

Forward 5’-AGC CAG CGT CAG TTT CAA CC-3’

Reverse 5’-ACA AGC ATT GTG CGT CGA AG-3’

AT2 receptor²¹

Forward 5’- AGA ACA GGA TAA CCC GTG ACC-3’

Reverse 5’- AGG ATG GCA AAA GGA AGT GC-3’

COX-2²²

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Forward 5’-TTC AAA TGA GAT TGT GGG AAA ATT GCT-3’

Reverse 3’-AGA TCA CTG CCT GAG TAT CTT-3’

mPGES-1²³

Forward 5’-GGA ACG ACA TGG AGA CCA TCT AC-3’

Reverse 3’-TCC AGG CGA CAA AAG GGT TA

Reference geneにGlyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase(GAPDH)を使用し¹⁴、定量に Pre-Developed TaqMan Assay Reagents Human GAPDH(20X)(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)とTaqMan Universal PCR Master Mix(Roche, Indianapolis, In, USA)を用いた。

mRNA発現量の検討は比較CT法を用いて解析した。mRNA発現のCycle threshold(CT)

値はGAPDHの平均CT値より換算した。mRNA発現量の比較はΔΔCT法により、非子

宮内膜症患者の増殖期正所性子宮内膜組織と比較しfold difference(2-ΔΔct)で表現した²⁴。 今回は非子宮内膜症患者の増殖期正所性子宮内膜組織を基準とし、相対値（fold difference）を示し評価した。

(5) 統計学的解析

統計学的解析について、各群間の有意差検定はMann-Whitney U testを用いて行った。

相関関係の解析はscatter plotよりpearsonの積率相関係数を用いて検討した。Stat view for windows version4.58を用いて解析し、P値<0.05をもって有意差ありと判定した。

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エ）結果

Ⅰ 子宮内膜症病巣患者の卵巣子宮内膜症性嚢胞壁および正所性子宮内膜におけるAT1, AT2 receptor 蛋白産生について

免疫染色結果について代表的な症例を図に示した（Figure 2）。

AT1, AT2 receptorについて非子宮内膜症患者の正所性子宮内膜（増殖期、分泌期）、卵

巣子宮内膜症性嚢胞壁の典型例を列挙した。染色結果は、

AT1 receptor 増殖期正所性子宮内膜（a）: 腺上皮細胞1、間質細胞2 AT1 receptor 分泌期正所性子宮内膜（b）: 腺上皮細胞2、間質細胞1 AT1 receptor 卵巣子宮内膜症性嚢胞壁（c）: 腺上皮細胞1、間質細胞1 AT2 receptor 増殖期正所正子宮内膜（d）: 腺上皮細胞1、間質細胞1 AT2 receptor 分泌期正所性子宮内膜（e）: 腺上皮細胞1、間質細胞1 AT2 receptor 卵巣子宮内膜症性嚢胞壁（f）: 腺上皮細胞1、間質細胞1 であった。

Ⅱ 子宮内膜症病巣および子宮内膜組織におけるAT1, AT2 receptor mRNA発現について 採取した検体を非子宮内膜症患者の子宮内膜（月経期、増殖期、分泌期）、子宮内膜 症患者の正所性子宮内膜（増殖期、分泌期）、卵巣子宮内膜症性嚢胞壁、子宮内膜症腹 膜病変に分け、mRNA発現量を比較検討した。

（1）AT1 receptor mRNA発現について

卵巣子宮内膜症性嚢胞壁は非子宮内膜症患者の増殖期子宮内膜に比較し有意に高値 であった（P<0.05）。一方卵巣子宮内膜症性嚢胞壁と非子宮内膜症患者の分泌期子宮内 膜とでは有意な差を認めなかった。

非子宮内膜症患者の分泌期子宮内膜は増殖期に比較し有意に高値であった（P<0.05）。 その他の群間に有意差を認めなかった（Figure3）。

（2）AT2 receptor mRNA発現について

いずれの群においても有意差を認めなかった（Figure4）。

（3）AT1 / AT2 receptor mRNA発現比について

卵巣子宮内膜症性嚢胞壁は非子宮内膜症患者の増殖期子宮内膜に比較し有意に高値 であった（P<0.05）。

卵巣子宮内膜症性嚢胞壁は子宮内膜症患者の増殖期正所性子宮内膜に比較し有意に 高値であった（P<0.05）。

子宮内膜症腹膜病変は非子宮内膜症患者の増殖期子宮内膜に比較し有意に高値であ った（P<0.05）。

その他の群間に有意差を認めなかった（Figure5）。

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Ⅲ 卵巣子宮内膜症性嚢胞壁組織におけるAT1, AT2 receptor mRNAとCOX-2, mPGES-1 mRNA発現の関連について

採取した卵巣子宮内膜症性嚢胞壁および非子宮内膜症患者の子宮内膜において、AT1, AT2 receptor, COX-2, mPGES-1 mRNA発現量の相関関係を検討した。

(1) 卵巣子宮内膜症性嚢胞壁組織における AT1 receptor mRNA と COX-2, mPGES-1 mRNA発現の関連について

AT1 receptorとCOX-2 mRNA発現にR=0.669、P<0.01と相関を認めた。AT1 receptor とmPGES-1 mRNA発現に相関関係を認めなかった（Figure6）。

(2) 卵巣子宮内膜症性嚢胞壁組織における AT2 receptor mRNA と COX-2, mPGES-1 mRNA発現の関連について

AT2 receptorとCOX-2 mRNA発現にR=0.659、P<0.01と相関を認めた。AT2 receptor とmPGES-1 mRNA発現に相関を認めなかった（Figure7）。

(3) 卵巣子宮内膜症性嚢胞壁組織におけるAT1 / AT2 receptor mRNA発現比とCOX-2,

mPGES-1 mRNA発現の関連について

AT1 / AT2 receptor とCOX-2 mRNA発現に相関を認めなかった。AT1 / AT2 receptorと mPGES-1 mRNA発現にR=0.590、P=0.01と相関を認めた（Figure8）。

（4）非子宮内膜症患者の子宮内膜（全月経周期）におけるAT1 / AT2 receptor mRNA発 現比とCOX-2, mPGES-1 mRNA発現の関連について

AT1 / AT2 receptorとCOX-2、mPGES-1のいずれもmRNA発現に相関を認めなかった

（Figure9）。

オ）考察

今回著者は子宮内膜症の病態におけるレニンアンジオテンシン系との関連を検討し た。

これまでヒト子宮内膜症病巣におけるangiotensin receptorの検討報告はなく、今回著 者は初めてヒト子宮内膜症病巣にAT1, AT2 receptor発現を検討した。ヒト子宮内膜にお けるangiotensin receptorの発現は1989年にWhitebreadらが報告したことに始まる¹⁶。 今回の検討から子宮内膜症病巣におけるangiotensin receptor mRNA発現および蛋白産生 を確認した。

ヒト子宮内膜におけるangiotensin receptorと月経周期との関連については以前より報 告がある。そもそもAT1 receptor は血管収縮作用の引き金となることが知られており、

アルドステロンやバソプレシンを分泌させ血管新生を促進し血管抵抗を増大させる ^12,

8

25。反対にAT2 receptorはブラジキニンやNOを放出させ血管拡張や細胞増殖を抑制す る作用がある^{25, 26}。AT1, AT2 receptorは概ね相反する作用があると言われている¹⁵。AT1,

AT2 receptor と月経周期の関連について Saridogan らは免疫組織化学染色においてヒト

子宮内膜にAT1, AT2 receptor蛋白が産生されており、特に子宮内膜のAT1 receptorはホ ルモンの影響を受けることを報告した¹⁷。AT1 receptorは月経周期のうち月経期から増 殖前期に比較して増殖期後期から黄体期に産生が増加することを報告した。Liらはレニ ンが分泌後期に強く染色されると報告した ²⁷。このことからレニンの代謝産物である angiotensinⅡも分泌期に増加することが推測される。Squires らは angiotensinⅡが PGE2

を介して脱落膜細胞に影響することを報告した²⁸。今回の検討より、AT1 receptor mRNA 発現およびAT1 / AT2 receptor mRNA 発現比において非子宮内膜症患者の分泌期子宮内 膜が増殖期子宮内膜に比較して有意に高値であり、この結果はこれまでの報告に矛盾し ない。AT1 receptor mRNA発現およびAT1 / AT2 receptor mRNA発現比において卵巣子宮 内膜症性嚢胞壁が非子宮内膜症患者の増殖期子宮内膜に比較して有意に高値であった。

子宮内膜における月経周期とAT1, AT2 receptorの関連については報告があるが、本検討 からレニンアンジオテンシン系が AT1, AT2 receptor を介して細胞増殖や血管新生に影 響することで 月経周期だけでなく子宮内膜症の病態にも関与している可能性を考え た。しかし本検討では、手術による摘出検体であり、病変および周囲を採取しているた め、厳密には卵巣子宮内膜症性嚢胞壁組織においては異所性子宮内膜組織（上皮、間質 を含む）および一部正常な卵巣組織も含まれている。腹膜病変も同様に異所性子宮内膜 組織（上皮、間質を含む）および一部正常な腹膜も含まれている。そのため今後 micro

dissection 等を用いてより正確に組織を単離した検討が望まれる。免疫組織化学染色に

ついて本検討からは月経周期との関係や局在の傾向は明らかでなかった。Angiotensin

receptorには細胞増殖や血管新生等の様々な作用を持っている。腺上皮細胞は増殖期か

ら分泌期にかけて核分裂や迂曲、偽重層化が進行し、一方間質細胞は分泌期中期頃に腺 腔内への分泌物産生増加や間質の浮腫の亢進、月経期には白血球浸潤が亢進することが 知られている。このように月経周期に応じて多様な変化を持つことから蛋白産生の局在 に個体差が見られたと推測される。今後も症例数の蓄積により蛋白産生の局在や mRNA発現との関連についても解析することが望まれる。

子宮内膜症の病態とアラキドン酸カスケードの関連の有無については諸説あるが、著 者をはじめ他の研究者からも子宮内膜症病巣におけるCOX-2およびmPGES-1発現が報 告されており、子宮内膜症の病態にアラキドン酸カスケードとの関連が指摘されている

8-10。レニンアンジオテンシン系とアラキドン酸カスケードの関連について報告がある。

Abraham らはラットの子宮内膜間質細胞において angiotensinⅡが calcineurin / NFAT signaling pathwayを活性化しCOX-2を誘導することを報告した¹⁹。血管内皮についても 報告があり、Brillaらは血管内皮細胞においてangiotensinⅡがCOX-2やその代謝産物で あるPGE2の遺伝子発現を増加させる可能性を報告した²⁹。Francescoらはヒト血管内皮

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について、AT1 receptorのblockerであるIrbesartanを使用することで、血管内皮のplaque

において COX-2 や mPGES-1 の発現が減少することを報告した ¹⁴。腎臓について

hernandezらは腎不全ラットの腎臓組織においてangiotensinⅡがCOX-2 mRNA発現を増 加させることを報告した^{26, 30}。このように以前から多分野でレニンアンジオテンシン系 とアラキドン酸カスケードの関連が報告されていた。今回の検討ではAT1, AT2 receptor

とCOX-2に正の相関を認めた。このことからレニンアンジオテンシン系とPGE2合成系

に関連があることが示唆され、レニンアンジオテンシン系がアラキドン酸カスケードを 介して子宮内膜症の病態に関連がある可能性が考えられた。興味深いことに子宮内膜症 病巣においてAT1 / AT2 receptor mRNA 発現比とmPGES-1 mRNA発現に正の相関を認 める一方で非子宮内膜症患者の子宮内膜において相関を認めなかった。子宮内膜症病巣 と正所性子宮内膜で相関が異なることから、angiotensin receptorが子宮内膜症病態の生 物学的特徴づけている可能性があると思われる。また子宮内膜症病巣においてのみAT1 / AT2 receptor mRNA発現比とmPGES-1が相関していることは子宮内膜症病変における 疼痛の発生や増悪に関連していることが推測される。しかし AT1 receptor, AT1 / AT2 receptor mRNA発現比高値の症例は臨床所見、病理、AT2, COX-2, mPGES-1発現等につ いて特質な所見を認めなかった。レニンアンジオテンシン系と PGE²合成系の関連につ いては、今後細胞培養実験を用いAT1 receptorをブロックして、COX、PGES発現を検 討した実験が必要と考えている。

レニンアンジオテンシン系は血圧や脈拍を調節することが知られている。Shenoy ら は月経周期において血圧や脈拍が変動しないことを報告した³¹。この報告から月経周期

によってangiotensin receptor発現が変動していても全身への影響が少ないことが推察さ

れる。本検討では卵巣子宮内膜症性嚢胞群と非子宮内膜症群で血圧および脈拍に有意差 を認めなかった。卵巣子宮内膜症性嚢胞群に1例高血圧既往患を含み、両群ともに2名 ずつ白衣高血圧症の可能性のある患者が含まれていた。しかし全体として著者は正所性 子宮内膜や子宮内膜症病巣における AT1, AT2 receptor 発現は全身への影響は少なく局 所への影響に留まると考えた。

AngiotensinⅡはレニンアンジオテンシン系において最も強力な生理活性を有する蛋

白である。AngiotensinⅡはangiotensinⅠよりangiotensin converting enzyme（ACE）によ って変換されることは一般的に知られている。近年ACE2が発見され、angiotensinⅠを angiotensin（1-9）へ分解するとともにangiotensinⅡをangiotensin（1-7）へ分解すること が明らかになった^32-34。angiotensin（1-7）は血管拡張作用を有するが、その受容体が癌 遺伝子のmasであることが明らかになった³⁵。Mas受容体はAT1, AT2 receptorと異なる 新たな受容体として注目を集めている。このように新たなレニンアンジオテンシン系の 経路と正所性子宮内膜や子宮内膜症病巣における関連は今後検討する必要がある。

子宮内膜症はホルモン依存性疾患と言われている。一方レニンアンジオテンシン系と エストロゲンの関係は以前より指摘されている。Georgらは卵巣摘出したラットの大動

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脈組織においてエストロゲン増加がAT1 receptorを減少させることを報告した³⁶。Hao らは卵巣摘出したラットの心臓組織においてエストロゲンがACE2やangiotensin（1-7） 発現を抑制することを報告した³⁷。このように心血管系ではエストロゲンとレニンアン ジオテンシン系の関連が報告されており、主にエストロゲンはAT1 receptorに抑制する 作用を持つ。本検討から月経周期とAT1, AT2 receptorの関連を確認した。月経周期に関 連するホルモンであるエストロゲン、プロゲステロンと正所性子宮内膜および子宮内膜 症病巣の関連を今後検討する必要がある。

AT1 receptor作用としては血管新生、細胞増殖、炎症反応やアポトーシスの抑制を促

進する働きがある。近年高血圧症の治療で使用されるangiotensin受容体拮抗薬（ARB） の多くはAT1 receptor阻害薬である。LosartanはAT1 receptor阻害薬の例であるが、VEGF 抑制作用や前立腺癌、乳癌、子宮内膜癌の抑制作用が報告されている^38-40。マウスの子 宮内膜症様病巣においてARBであるtermisartan投与によって、病巣の血管新生や増殖 が抑えられたと報告されている⁴¹。このような観点から今後のさらなる検討によりヒト 子宮内膜症治療にARBの副作用が治療に応用できる可能性がある。しかしARBの主作 用である血圧降下作用の影響に注意しなければならない。またAT1 receptorは卵巣にお ける卵胞発育や分化と関連が指摘されている²⁰。そのためangiotensin receptorは子宮内 膜症における新たな治療法への可能性を含んでいるが、副作用にも十分に検討していく 必要がある。

これらの結果を踏まえ今後は細胞培養実験が必要であると考えられる。細胞培養実験 において、LosartanやterminsartanといったAT1 receptor阻害薬の効果を確認する必要が ある。また近年注目を集めているAngiotensin(1-7)やその受容体であるMas receptorを検 討する必要がある。

カ）まとめ

著者はヒト子宮内膜症病巣においてAT1, AT2 receptor発現を初めて確認した。レニン アンジオテンシン系は子宮内膜症の病態に関連し、PGE²合成系を介して関連している 可能性が考えられた。今後の更なる検討により子宮内膜症の病態解明や、ARB が新た な治療法へ発展する可能性が考えられた。

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謝辞

本研究ならびに学位論文のご指導、御校閲を賜りました日本大学医学部産婦人科学分 野 山本樹生教授、千島史尚准教授、日本大学医学部病理学講座 杉谷雅彦教授 辻村 隆介先生に深く感謝致します。ならびに研究に御協力いただいた産婦人科学分野 鈴木 真美研究員、産婦人科研究室研究員に深く感謝致します。

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Table 1 Patients’ characteristics according to diagnosis at time of surgery

Age

n, median, range Mean

SD Indications for surgery Eutopic endometrium, non-endometriotic controls 15 (43, 35-48) 42.20

3.89

proliferative 5 (43, 35-48) 41.8

5.26 uterine myoma (n= 4)

localized cervical malignancy(n=1) secretory 5 (44, 36-46) 41.60

4.34 uterine myoma (n=5)

menstrual 5 (43, 41-47) 43.40

2.30 uterine myoma(n=4)

endometrial polyp(n=1) Endometriosis patients 32 (38.5, 26-53) 32.21

6.69

Eutopic endometrium, proliferative 3 (47, 31-53) 43.66

11.37 endometriosis(n=3) Eutopic endometrium, secretory 4 (36, 26-48) 35.50

7.76 endometriosis(n=4) Endometriotic cyst 29 (39, 28-53) 38.62

6.47 endometriosis(n=29) peritoneum (red-colored lesion) 5 (30, 26-36) 31.00

4.79 endometriosis(n=5) n = number of patients.

13

Table 2 Clinical characteristics of patients with endometriotic cyst and normal control

Parameters Endoetriosis with endometriotic cyst control p-value (n=29) (n=15)

Age (y/o)

(median, range) 39, 29-53 44, 35-48

(Mean

SD) 38.60

6.48 42.20

3.89

0.068787 Blood pressure (mmHg)

systoric (median, range) 112, 91-156 116, 102-156

(Mean

SD) 119.9

16.1 119.3

13.8

0.73819 diastric (median, range) 73, 56-94 70, 62-94

(Mean

SD) 73.5

9.92 72.4

10.2

0.577469 Heart rate (bpm)

(median, range) 72, 56-95 73, 60-115 0.691994 (Mean

SD) 72.4

9.48 75.6

14.3

0.691994

n = number of patients.

14

Figure 1

a b

c

a b

c

15

Figure 2

AT1 receptor

AT2 receptor

Eutopic endometrium

Proliferative phase Eutopic endometrium

Secretory phase Endometriotic cyst

e f d

b c

a

16

Figure 3

0 50 100 150 200 250 300 350

0 2 4 6 8 10 12 14

＊

＊

AT1 Fold difference

Non-endometriosis Endometriosis

＊： P<0.05

17

Figure 4

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

0 2 4 6 8 10 12 14

AT2 Fold difference

Non-endometriosis Endometriosis

18

Figure 5

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

0 2 4 6 8 10 12 14

AT1/AT2 Fold difference

Non-endometriosis Endometriosis

＊ ＊

＊

＊： P<0.05

19

Figure 6

-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

AT1

-5 0 5 10 15 20 25 30

COX-2

AT1 = -.428 + 4.555 * COX-2; R^2 = .447 散布図

-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

AT1

-5 0 5 10 15 20 25 30

mPGES-1

AT1 = 18.397 - .504 * mPGES-1; R^2 = .007 散布図

R=0.669

P<0.01 R=-0.085

P=0.6717

a b

20

Figure 7

-10 0 10 20 30 40 50 60 70

AT2

-5 0 5 10 15 20 25 30

COX-2

AT2 = -.773 + 1.666 * COX-2; R^2 = .434 散布図

-10 0 10 20 30 40 50 60 70

AT2

-5 0 5 10 15 20 25 30

mPGES-1

AT2 = 6.205 - .206 * mPGES-1; R^2 = .009 散布図

R=-0.659

P<0.01 R=-0.093

P=0.6401

a b

21

Figure 8

-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

AT1/AT2

-5 0 5 10 15 20 25 30

COX-2

AT1/AT2 = 47.133 - 1.959 * COX-2; R^2 = .043 散布図

-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

AT1/AT2

-5 0 5 10 15 20 25 30

mPGES-1

AT1/AT2 = 19.403 + 6.216 * mPGES-1; R^2 = .348 散布図

R=--0.208

P=0.3004 R=-0.590

P<0.01

a b

22

Figure 9

-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80

AT1lAT2

-10 0 10 20 30 40 50 60

COX-2

AT1lAT2 = 2.019 + .448 * COX-2; R^2 = .188 散布図

-10 0 10 20 30 40 50 60 70 80

AT1lAT2

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

mPGES1

AT1lAT2 = 10.336 - 1.433 * mPGES1; R^2 = .062 散布図

R=0.433 P=0.1082

R=-0.249 P=0.3788

a b

23

Figure legends

FIG. 1. A standard for judgement of immunohistochemical staining in endometriosis or endometrium. (Original magnification, x400)

a) Scores of glandular epithelium and stroma were categorized as 3, 2.

b) Scores of glandular epithelium and stroma were categorized as 2, 2.

c) Scores of glandular epithelium and stroma were categorized as 1, 1.

FIG. 2. Representative immunohistochemical staining of AT1 and AT2 receptor in proliferative (a and d) and secretory (b and e) phases of eutopic endometrium and

endometriosis lesion (c and f), respectively. (Original magnification, x200)

b) Scores of glandular epithelium and stroma were categorized as 1, 1.

c) Scores of glandular epithelium and stroma were categorized as 1, 1.

d) Scores of glandular epithelium and stroma were categorized as 1, 1.

e) Scores of glandular epithelium and stroma were categorized as 1, 1.

f) Scores of glandular epithelium and stroma were categorized as 2, 1.

FIG. 3. The expression levels of AT1 receptor mRNA in eutopic endometria of non-endometriotic patients and in eutopic endometrium and endometriotic lesions of endometriosis patients. Horizontal lines represent the median. The expression level of AT1 receptors mRNA of secretory phase was significantly higher than that of

proliferative phase in non-endometriosis control (p<0.05). The expression level of AT1

24

mRNA in endometriotic cysts was significantly increased compared to their levels in the eutopic endometrium in the proliferative phase in controls (p<0.05).

Fig. 4. The expression levels of AT2 receptor mRNA in eutopic endometria of non-endometriotic patients and in eutopic endometrium and endometriotic lesions of endometriosis patients. Horizontal lines represent the median.

Fig. 5. The AT1/AT2 ratio in eutopic endometria of non-endometriotic patients and in eutopic endometrium and endometriotic lesions of endometriosis patients. Horizontal lines represent the median. The AT1/AT2 ratio in endometriotic cysts was significantly increased compared to those levels in the eutopic endometrium in the proliferative phase in not only controls (non-endometriosis) (P<0.05), but also endometriosis patients (P<0.05). In addition, the AT1/AT2 ratio in peritoneal endometriosis was significantly increased compared to those levels in the eutopic endometrium in the proliferative phase in controls (non-endometriosis) (P<0.05), not in endometriosis patients

Fig. 6. Correlations observed among the mRNA expression levels of AT1 receptor, COX-2 and mPGES-1 in endometriotic cysts.

25

There was a tendency of relationship between AT1receptor and COX-2, but without significance (r=0.669, p<0.01) (a). There was no correlation between AT1receptor and mPGES-1 (r=-0.085, p=0.6717) (b)

Fig. 7. Correlations observed among the mRNA expression levels of AT2 receptor, COX-2 and mPGES-1 in endometriotic cysts.

There was a relationship between AT2 receptor and COX-2 (r=0.659, p<0.01) (a). There was no significant relationship between AT2 and mPGES-1 (r=-0.093, p=0.6401) (b).

Fig. 8. Correlations observed among the AT1/AT2 ratio, COX-2 and mPGES-1 mRNA expression in endometriotic cysts.

There was no significant relationship between the mRNA expression of AT1/AT2 ratio and COX-2 mRNA (r=-0.208, p=0.3004) (a). There was a significant relationship between the AT1/AT2 ratio and mPGES-1 mRNA (r=0.590, p<0.01) (b).

Fig. 9. Correlations observed among the AT1/AT2 ratio, COX-2 and mPGES-1 mRNA expression in eutopic endometrium of non-endometriotic control.

There was no significant relationship between the mRNA expression of AT1/AT2 ratio

26

and COX-2 mRNA (r=0.433, p=0.1082) (a). There was no relationship between the mRNA expression of AT1/AT2 ratio and mPGES-1 mRNA (r=-0.249, p=0.3788) (b).

27

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2014 May;29(5):1011-24.

31

研究業績

仲尾 岳大

Ｉ 発表 ①一般発表 14 ②特別発表 なし

Ⅱ 論文 ①原著論文 1 (単 1) ②症例報告 1 (共 1) ③総説 なし

Ⅲ 著書 1 (共 1)

以上

32

Ⅰ 発表

①一般発表

1. 仲尾岳大, 加藤恵利奈, 市川剛, 千島史尚, 髙田眞一, 松浦眞彦, 山本樹生: 遊走腎 の診断の上で子宮腺筋症に対して単純子宮全摘出術を施行したところ術中骨盤腎を 認めた一例, 第63回日本産科婦人科学会学術講演会, 大阪, 2011年8月

2. 仲尾岳大, 松浦眞彦, 小林祐介, 澤田晃子, 加藤恵利奈, 中村晃和, 東裕福, 林忠佑, 青木洋一, 佐々木重胤, 山本樹生: 帝王切開術後の血栓予防に用いた低分子ヘパリ ン投与後に脳出血をきたした1例, 第64回日本産科婦人科学会学術講演会, 兵庫, 2012年4月

3. 仲尾岳大, 東裕福, 中山琢生, 春日晃子, 中村晃和, 佐々木重胤, 松浦眞彦, 山本樹 生: 全身麻酔下帝王切開手術における分娩所要時間とApgar scoreの関連について の後方視的検討, 第65回日本産科婦人科学会学術講演会, 北海道, 2013年5月 4. 仲尾岳大, 千島史尚, 林忠佑, 鈴木真美, 市川剛, 椙田賢司, 山本樹生: 子宮内膜症

病巣におけるangiotensinⅡ type 1 (AT 1), type 2 (AT 2) receptor mRNAの発現 について, 第66回日本産科婦人科学会学術講演会, 東京, 2014年4月

5. 仲尾岳大, 市川剛, 青木淳子, 椙田賢司, 千島史尚, 髙田眞一, 山本樹生: 婦人科領 域の手術において経験した骨盤腎の2症例, 第122回関東連合産科婦人科学会総 会・学術集会, 神奈川, 2011年10月

6. 仲尾岳大, 東裕福, 佐々木重胤, 松浦眞彦, 山本樹生: 小児期の骨盤放射線照射後に 自然妊娠し、生児を得た一例, 第125回関東連合産科婦人科学会総会・学術集会, 東 京, 2013年6月

7. 仲尾岳大, 椙田賢司, 小林祐介, 春日晃子, 髙田眞一, 山本樹生: 長期寛解後の再発 診断に遺伝子解析が有用であった卵巣癌の一例, 第126回関東連合産科婦人科学会 総会・学術集会, 東京, 2013年10月

8. 仲尾岳大, 東裕福, 中山琢生, 春日晃子, 中村晃和, 佐々木重胤, 松浦眞彦: 全身麻 酔下帝王切開分娩における分娩所要時間と新生児の転帰についての後方視的検討, 第366回東京産科婦人科学会例会, 東京, 2013年5月

9. 仲尾岳大, 千島史尚, 中村晃和, 市川剛, 椙田賢司, 髙田眞一, 山本樹生: 異所性妊 娠より発見された過大着床部様症例, 第19回日本胎盤学会学術集会, 東京, 2011年 9月

10. 仲尾岳大, 千島史尚, 林忠佑, 鈴木真美, 市川剛, 椙田賢司, 山本樹生: 子宮内膜症 病巣におけるangiotensinⅡ type 1 (AT 1), type 2 (AT 2) receptor mRNAの発現に ついて, 第28回日本生殖免疫学会総会・学術集会, 兵庫, 2013年11月

11. 仲尾岳大, 千島史尚, 林忠佑, 鈴木真美, 市川剛, 椙田賢司, 山本樹生: 子宮内膜症 病巣におけるangiotensinⅡ type 1 (AT 1), type 2 (AT 2) receptor mRNAの発現に ついて, 第35回日本エンドメトリオーシス学会, 鹿児島, 2014年1月

33

12. 仲尾岳大, 椙田賢司, 髙田眞一, 山本樹生, 楠美嘉晃: Malignant mesodermal

mixed tumor (MMMT)との鑑別を要した類内膜腺癌と診断された卵巣癌の1例, 第

52回日本婦人科腫瘍学会学術講演会, 東京, 2012年7月

13. Takehiro Nakao, Fumihisa Chishima, Chuyu Hayashi, Manami Suzuki, Go Ichikawa, Kenji Sugita, and Tatsuo Yamamoto: Expression of angiotensin receptors type1 (AT1), type2 (AT2) mRNA in local endometriosis lesions, 12^th World Congress on Endometriosis 2014, Brazil, May 2014

14. Takehiro Nakao, Fumihisa Chishima, Masahiko Sugitani, Chuyu Hayashi, Manami Suzuki, Go Ichikawa, Kenji Sugita, and Tatsuo Yamamoto: Expression of angiotensin receptors type 1 (AT 1), type 2 (AT 2) mRNA in local

endometriosis lesions, 34^th American Society for REPRODUCTIVE IMMUNOLOGY (ASRI) meeting, USA, Jun 2014

②特別発表 なし

Ⅱ 論文

① 原著論文

1. 仲尾岳大, 東裕福, 高橋英幹, 春日晃子, 中村晃和, 佐々木重胤, 松浦眞彦, 山本樹 生: 全身麻酔下帝王切開分娩における分娩所要時間と新生児の転帰についての後方 視的検討, 東京産科婦人科学会会誌, 62: 552-556, 2013.

② 症例報告

1. 椙田賢司, 髙田眞一, 仲尾岳大, 小林祐介, 山本樹生: 血栓症を繰り返すTrousseau 症候群の1例, 東京産科婦人科学会会誌, 61: 145-149, 2012

③ 総説 なし

Ⅲ 著書

1. 山本樹生, 仲尾岳大, 小林祐介: 【腎疾患治療薬マニュアル2013-14】 腎疾患に対 する薬剤の使用方法 妊娠高血圧症候群, 腎と透析, 74: 241-245, 2013

34