- 59 - 分担研究報告書
平成 25 年度厚生科学研究費補助金（地球規模保健課題推進）研究事業
医療機器規格の国際標準化を支援する体制構築に関する研究（H25‑地球規模‑指定‑008）
分担研究課題名
医用材料規格の新規提案に向けた検証実験に関する研究
研究代表者 新見 伸吾 国立医薬品食品衛生研究所 医療機器部 研究分担者 蓜島 由二 国立医薬品食品衛生研究所 医療機器部
研究協力者
野村祐介 国立医薬品食品衛生研究所 福井千恵 国立医薬品食品衛生研究所 小園 知 国立医薬品食品衛生研究所 河上強志 国立医薬品食品衛生研究所 伊佐間和郎 国立医薬品食品衛生研究所 吉田 緑 国立医薬品食品衛生研究所 井上 薫 国立医薬品食品衛生研究所 森川朋美 国立医薬品食品衛生研究所 市村亮平 国立医薬品食品衛生研究所 前田 潤 国立医薬品食品衛生研究所 高橋美和 国立医薬品食品衛生研究所 小川久美子 国立医薬品食品衛生研究所 中村義一 株式会社リボミック
宮川 伸 株式会社リボミック 金 玲 株式会社リボミック 山﨑佳世 民生科学協会 熊田秀文 神奈川歯科大学 浜田信城 神奈川歯科大学 藤澤彩乃 東京大学 鄭 雄一 東京大学
柚場俊康 川澄化学工業株式会社 坂口圭介 テルモ株式会社 谷川隆洋 テルモ株式会社 犬飼香織 テルモ株式会社 竹ノ内美香 テルモ株式会社 新藤智子 食品薬品安全センター
研究要旨
本研究では、新規規格の提案や国際規格の改定作業を通じて国際標準化に必要な戦略等に関する情 報を収集することを目的として、試験法及び材料開発分野において 3 件のケーススタディを実施した。
試験法分野のケーススタディでは、ISO/TC194/WG9 において実施されている溶血性試験ラウンドロ ビンテストを支援し、我が国の試験法を ISO10993‑4 に取り込むように努力するため、処方を改良した 溶血性試験用陽性対照材料 Genapol X‑080 含有 PVC シートを新たに作製し、その基本性能を検証した 後、ラウンドロビン試験用標準品として提供した。本陽性対照材料の性能は良好であり、今後、
ISO/TC194/WG12 に国際標準品として新規提案する予定である。
材料開発分野におけるケーススタディでは、ISO/TC194/WG11 における代替可塑剤の安全性評価に関 する規格作成に対応するため、我が国が開発を進めている新規血液バッグの代替可塑剤である DOTP のラット亜慢性毒性試験を実施した。その結果、DOTP はいずれの臓器に対しても顕著な影響を与えず、
その無毒性量は 297±12 mg/kg/day 以上と判定された。また、機能性蛋白質を選択的に補足する RNA アプタマーを用いた革新的医用材料の開発研究においては、蛋白質間相互作用解析及び細胞内シグナ ル伝達解析により、生理活性を保持した状態で bFGF を補足する 3 種の RNA アプタマー（1p01、1p02 及び 2p03）を選定したと共に、材料表面への適切な固定化法について検討した。今後、これらの候補 アプタマーを固定化した表面上で培養実験を行い、細胞増殖能への影響等について検証する。
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Ａ．研究目的
本研究では、新規規格の提案や国際規格 の改定作業を通じて国際標準化に必要な 戦略等に関する情報を収集することを目 的として、医療機器関連業界と連携のもと、
試験法分野及び材料開発分野において 3 件のケーススタディを実施している。
試 験 法 分 野 の ケ ー ス ス タ デ ィ で は 、 ISO/TC194/WG9 が実施している溶血性試験 に関する多施設国際共同検証試験（ラウン ドロビンテスト）を支援している。血液に 接触する医療機器には安全性上の不具合 を生じないよう、ISO 10993‑4 において規 定される血液適合性評価が求められてい るが、具体的且つ標準化された試験法が明 記されていない点が大きな課題となって いる。ISO 10993‑4 文書としては、2002 年 及び 2006 年に本体と Amendment がそれぞ れ発行されたが、現在、ISO/TC194「医療 機器の生物学的評価」技術委員会では、WG9 が主体となって同文書の改訂作業を行っ ており、日本も積極的に参画している。溶 血性試験の国際ラウンドロビンテストは、
その一環として行われており、現時点で Pilot Run の第一回目の試験が終了した。
材料開発分野におけるケーススタディ としては、代替可塑剤の安全性評価に関す る 研 究 を 行 っ て い る 。 現 在 、 ISO/TC194/WG11 では、PVC 製医療機器の製 造 に 利 用 さ れ る 代 表 的 な 可 塑 剤 で あ る DEHP の毒性、化学分析法及び耐用摂取用 量 を 取 り ま と め た ISO/PDTS 29741 ： Biological evaluation of medical devices
– Development of tolerable
intake values for Di(2‑ethylhexyl) phthalate (DEHP)文書の改訂作業を行っ ている。その一方、DEHP の使用について はリスク回避の観点から欧州を中心に規制が強化される方向にあり、特にフランス 及びデンマークでは 2015 年から DEHP の使 用が禁止される。日本の医療機器分野にお いてもリスク患者群の治療にあたっては 代替機器又は代替可塑剤を利用した製品 への切り替えが推奨されている1)。このよ うな背景のもと、諸外国では安全性に優れ た代替可塑剤を利用した PVC 製品の開発 研究が活発に進められているため、PDTS 29741 文書の改訂作業が完了次第、代替可 塑剤の安全性に関する議論が ISO/TC194/
WG11 において開始されることが容易に予 測される。そこで本研究では、我が国が開 発を進めている新規血液バッグの代替可 塑剤である DOTP の安全性評価を通じて代 替可塑剤に関する国際規格の作成に寄与 することを目的として、同可塑剤のラット 亜慢性毒性試験を実施した。
国際標準化は、日本発の医療機器を世 界的に展開し、国際市場の主導権を握る 手段の一つとして非常に重要である。そ の一方、企業戦略としては知的財産権を 取得し、品質又は技術的優位性をもって 市場を確保することも重要となる。そこ で材料開発分野においては特許取得に係 るケーススタディも実施している。
医用材料を生体内に埋植すると、材料 表面に水やイオンが速やかに吸着し、次 いで生体蛋白質の吸着が起こる。すなわ ち、医用材料と細胞は吸着蛋白質層を介 して相互作用するため、同蛋白質は材料 の機能発現や生体適合性に大きく関与す ると考えられている。通常、材料表面へ の蛋白質吸着は受動的であり、その吸着 挙動は材料表面の物理化学的特性に大き く影響される。成長因子等の生理活性物 質や抗体を固定化し、特定の機能を付与 した表面も開発されているが、現在のと
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ころ、新しい医用材料として実用化には 至っていない。一方、核酸医薬分野では 特定の蛋白質を特異的に捕捉し、その活 性を阻害する RNA アプタマーが医薬品と して上市化されている。
SELEX 法により RNA アプタマー医薬品候 補を検索する際、活性を保持した状態で 標的蛋白質を特異的に捕捉する RNA アプ タマーが多数ヒットする。RNA の生体内寿 命は非常に短いが、相応の化学修飾を施 すことにより、その寿命を延長すること が可能となる。すなわち、適切な RNA ア プタマーを医用材料上に固定化すること により、特定の蛋白質を特異的且つ能動 的に材料表面に補足し、その機能を一定 期間に渡り制御できる可能性が非常に高 い。また、抗体や増殖因子等と異なり、
RNA アプタマーは単独では生理活性を示 さない合成可能な化学物質である利点も ある。そこで本研究では、RNA アプタマー を用いた革新的医用材料の創製を目指し、
生理活性を保持した状態で増殖因子の一 つである bFGF を特異的に補足する RNA ア プタマーを選定すると共に、材料表面へ の適切な固定化法について検討した。
本報告書では、平成 25 年度に実施した 上記 3 件のケーススタディにおいて得ら れた成果を報告する。なお、知的財産権に 係るケーススタディについては、特許出願 の都合上、全データの開示は行わない。
Ｂ．研究方法
(1)ケーススタディ 1：ISO/TC194/WG9 溶 血性試験ラウンドロビンテスト支援 1‑1.溶血性試験用陽性対照材料の調製 表 1 に示した処方に従って、100 パーツ の PVC に対して、1.0、1.5 及び 10 パーツ の Genapol X‑080 を含有する可塑化 PVC
パウダーを調製した。Genapol X‑080 含有 PVC シート（厚さ 0.4 mm）は同パウダー を利用してヒートプレス法（180℃）によ り作製した。
1‑2.溶血性試験ラウンドロビンテスト 1‑2‑1.試験材料及び方法
ISO/TC194/WG9 から配布された 5 種類
（ Polyethylene, Nitrile glove, Latex glove, EPDM rubber, Buna rubber）の材 料を使用した。各試験法のインキュベー ション時間は、ラウンドロビンテスト用 プロトコルに従い、ASTM 法 2)（直接接触 及び抽出液法）：3 時間、NIH 法3)（直接接 触法）：1 時間、MHLW 法4,5)（抽出液法）：4 時 間 と し た 。 Pilot Run は 米 国
（Medtronic：Santa Rosa 及び PRL）と日 本（テルモ及び食品薬品安全センター）
の 4 施設において実施した。
1‑2‑2.倫理面への配慮
動物血液の採取については、所属機関 が規定する動物実験指針に従い、動物に 対する苦痛が最小となるよう務めた（財 団法人ヒューマンサイエンス振興財団/
動物実験実施施設認証認定番号：食品薬 品安全センター/12‑005、テルモ/12‑030）。 動物実験にあたっては、動物実験倫理委 員会の承認を得て実施した（食品薬品安 全センター/承認番号 1120331A、テルモ/
承認番号 120163）。
(2)ケーススタディ 2：代替可塑剤の安全 性評価/DOTP のラット亜慢性毒性試験 2‑1.動物実験及び病理解析
訓化した 5 週齢の SD 系雄ラット（8 匹/
群）に DEHP（5000 ppm）及び種々の量の DOTP（0, 5, 50, 500, 5000 ppm）を 13
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週間混餌投与した6)。イソフルラン麻酔下、
BD 社製バキュティナ採血管（16 mm SST 採血管血清分離剤入）に断頭採血し、放 血殺後の動物を用いて、全身諸臓器の詳 細な病理肉眼的検査を実施した。脳、胸 腺、心臓、脾臓、肝臓、副腎(両側)、腎 臓(両側)、精巣(片側)、精巣上体(片側) 及び前立腺副葉については重量測定を行 い、絶対及び体重値に対する総体重量を 算出した。
病理肉眼的検査後、精巣(片側)及び眼 球(両側)を除く以下の臓器を 10%中性緩 衝ホルマリン液により固定した。精巣は ブアン液、眼球はダビットソン液を用い て固定した。
【採取臓器一覧】
脳、頭蓋骨（下垂体、三叉神経、舌を 含む）、眼球（両目）、唾液腺（頚部リン パ節含む）、甲状腺・気管・食道・胸部大 動脈・縦隔リンパ節・肺（一括採取）、心 臓、胸腺、肝臓、脾臓、腎臓（右に割）、
副腎、膵臓、胃、小腸、大腸（肛門含む）、 腸間膜リンパ節（一括採取）、大腿筋、坐 骨神経、胸骨、胸椎、精巣、精巣上体、
精嚢・凝固腺・膀胱・前立腺・尿道球腺
（一括採取）、皮膚（乳腺含む）
固定後の各臓器は、切り出し後、常法 に従って脱水、パラフィン包埋して薄切 し、ヘマトキシリン・エオジン(HE)染色 を施して、光学顕微鏡にて病理組織学的 検索を行った。
2‑2.精子数測定
ラット右精巣上体を採取後、PBS（4.5 mL）中で細切し、37%ホルマリンを 0.5 mL 加えて固定化した。同溶液 10
L に 20 M
Hoechst 33258 含有 PBS（90 L）を添加 し、室温下 15 分間放置して細胞核を蛍光 染色した後、キーエンス社製 BZ‑9000 を 利用して細胞数を計測した（測定波長：
Ex 360 nm／Em 460 nm）。
2‑3.ホルモン測定
採取血液を室温下 30 分間放置後、遠心 分離して調製した血清を試料として、テ ストステロン、エストラジオール E2、卵 胞刺激ホルモン（FSH）甲状腺ホルモン
（TSH）を ELISA により定量した。テスト ステ ロン、FSH 及び TSH は Endocrine Technologies 社製キット、エストラジオ ール E2 は Enzo Life Sciences 社製キッ トを利用して測定した。
2‑3.倫理面への配慮
国立医薬品食品衛生研究所が規定する 動物実験に関する指針に従い、動物に対 する苦痛が最小となるよう務めた。動物 実験にあたっては、動物実験倫理委員会 の承認を得て実施した（承認番号 434）。
(3)ケーススタディ 3：RNA アプタマーを 用いた革新的医用材料の創製
3‑1.RNA アプタマー候補の選定
bFGF に特異的に結合する RNA アプタマ ー候補として、合計 10 種の配列（1p01, 1p02, 1p03, 1p07, 1p41, 2p03, 2p04, 2p05, 2p10, 2p11 ） を 選 定 し 、 T7 RNA polymerase を用いた試験管内転写法によ って合成した。また、陽性及び陰性対照 として、bFGF と結合し、その生理活性を 阻害する bFGF Aptamer(bFA)と結合活性の 無いランダム配列である 40N も同様に合 成した。RNA 合成においては、3 末端に 16 nt の Poly A が付加されるようにデザ
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インした。合成標品はポリアクリルアミ ドゲル電気泳動法によって精製した。
RNA アプタマー/bFGF/FGFR1 三者複合体 形成能は、BIAcore 2000 を用いた表面プ ラズモン共鳴（SPR）法によって評価した。
センサーチップとしては、ストレプトア ビジン固定化 SA チップを用いた。同チッ プに 5 末端ビオチン標識 Poly dT（16 nt）
を 100 Resonance Unit (RU)程度結合させ た後、リガンドとなる RNA の 3 末端に存 在する Poly A と dT の結合により SA チッ プに候補アプタマーを固定化した。本 SA チップを利用して、候補アプタマーと bFGF（Peprotech 社）との結合能を評価し た後、FGFR1（R&D 社）を添加して三者複 合体形成能を評価した。また、三者複合 体形成に対するヘパリンの影響も評価し た。
3‑2.bFGF 活性に及ぼす RNA アプタマーの 影響評価
BIAcore 解析において、bFGF との複合 体形成能を有することが認められた候補 アプタマーと bFGF を添加した培地を利用 して、マウス線維芽細胞（NIH3T3）を培 養した。刺激開始から 30 分後に細胞を回 収し、ウェスタンブロッティング法によ り FRS2 及び ERK のリン酸化状況を観察し た。抗体としては、P‑FRS 及び P‑ERK に対 する特異的抗体のほか、抗 Actin 抗体を 利用した。
3‑3.RNA アプタマー固定化用 PEG 表面の作 製と表面解析
両末端にそれぞれ SH 基とカルボキシル 基を有するポリエチレングリコール 5000
（PEG5k）を常法に従って、金コートした ガラス板上に固定化した後、カルボジイ
ミド法により、30 nt の Poly dT を結合さ せた。対照材料として、カルボキシル基 を持たない PEG5k のみを固定化したガラ ス板も作成した。
静的接触角は各材料表面上にミリ Q 水 2
L を滴下し、30 秒後に ERMA 接触角測定
器（G‑1‑1000）を用いて、2/θ法により 測定した。X 線光電子分光分析（XPS）は 島津社製 ESCA3200 を利用して行った。
Ｃ．研究結果
(1)ケーススタディ 1：ISO/TC194/WG9 溶 血性試験ラウンドロビンテスト支援 1‑1.Pilot Run 試験成績
今回の国際ラウンドロビンテストで使 用した Nitrile glove は直接接触法及び 抽出液法ともに溶血を惹起する陽性対照 材料である。Latex glove 及び Buna rubber は直接接触法のみに陽性反応を示す材料 であり、Plyethylene 及び EPDM rubber は 溶血を惹起しない陰性対照材料に相当す る。日本が実施した Pilot Run の結果を 図 1 に 示 し た 。 陽 性 対 照 材 料 で あ る Nitrile glove の溶血性を ASTM 法により 評価した結果、直接接触法及び抽出液法 ともに強い活性が観察された（図 1a）。
Nitrile glove は NIH 法（直接接触法）に おいても 50%前後の溶血率を示したが、
NHLW 法（抽出液法）では顕著な活性が認 められなかった（図 1a）。Latex glove は NIH 法（直接接触法）において 14‑28%程 度の溶血率を示したが、ASTM 直接接触法 の検出感度は同 NIH 法に比較して顕著に 低下した（図 1b）。また、ASTM 抽出液法 及び MHLW 法（抽出液法）による評価では 溶血性陰性と判定された（図 1b）。Buna rubber の溶血誘導能は低く、ASTM 直接接 触法及び NIH 法（直接接触法）における
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溶 血 率 は そ れ ぞ れ 6.8‑9.7% 及 び 3.7‑
5.4％であり、ASTM 抽出液法及び MHLW 法
（抽出液法）では顕著な活性を示さなか っ た （ 図 1c ）。 陰 性 対 照 材 料 で あ る Plyethylene 及び EPDM rubber はいずれの 方法においても顕著な溶血性を示さなか った。また、米国が実施した 2 施設の試 験においてもほぼ同様の結果が得られた。
1‑2.Genapol X‑080 含有 PVC シートの性能 評価
Genapol X‑080 含量の異なる 3 種の PVC シートを作製し、その溶血誘導能を評価 した結果、図 2 に示したとおり、直接接 触法を利用した ASTM 法及び NIH 法では、
Genapol X‑080 添加量に比例して溶血率が 増加した。抽出液法を利用した場合、1.5 及び 10 パーツ添加標品は ASTM 法及び MHLW 法ともに完全溶血を惹起したが、1.0 パ ー ツ 添 加 標 品 の 溶 血 率 は そ れ ぞ れ 86.8%及び 49.9%であり、1.5 及び 10 パー ツ添加標品と比較して溶血性が低いこと が確認された（図 2）。
(2)ケーススタディ 2：代替可塑剤の安全 性評価/DOTP のラット亜慢性毒性試験 2‑1.体重及び摂餌量の変動
図 3 に示したとおり、投与期間中の発 育状況は全群ともに良好であり、体重推 移及び摂餌量については各実験群間に有 意差が認められなかった。なお、DOTP 5000 ppm 投与群の DOTP 平均摂取量は 297±12 mg/kg/day であった。
2‑2.臓器重量
表 2 及び表 3 に示したとおり、DOTP 投 与群は、対照群（DOTP 0 ppm）と比較し て、全群ともに各臓器の絶対重量及び相
対重量に有意な変動を示さなかった。
DEHP 投与群では、いずれの臓器も絶対 重量に有意差は認められなかったが、相 対重量において、肝臓では 18%、腎臓では 14%程度の軽度な増加が観察された。
2‑3.病理肉眼的検査
投与による病理肉眼所見はいずれの臓 器ともに認められなかったが、脂肪肝を 示す個体が対照群を含むいずれの群にお いても散見された。
2‑4.病理組織学検査
図 4 に示したとおり、病理組織学的検 査において、DEHP 群の肝臓に軽度なびま ん性肝細胞肥大が 8 例中 7 例認められた。
この肝細胞肥大は統計学的に有意な増加 であった。また、肝細胞肥大を示す肝細 胞は、やや顆粒状で好酸性を呈していた。
対照群（DOTP 0 ppm）及び DOTP 5000 ppm 投与群においては異常が認められなかっ た（図 4）。
DOTP 5000 ppm 投与群の精巣病理所見を 図 5 に示した。精巣については、いずれ の群においても正常な精子形成像が認め られ、精子形成ステージの構成細胞にも 投与による異常は認められなかった。
図 6 に示したとおり、精巣上体につい ては、精巣上体管腔内に細胞残差が散見 される個体が観察された。DEHP 群では 3 例であったが、対照群においても 2 例認 められた。また、変化の程度は、いずれ も管内に数個以下と軽度であった。この 細胞残差は正常でも 1 個程度は認められ る（図 6）。
相対重量で有意な増加が認められた腎 臓については、皮質及び髄質いずれの部 位においても投与による変化は認められ
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なかった（図 7）。
その他、比較的発生頻度の高かった病 理組織学的変化として、小葉周辺性の肝 細 胞 脂 肪 化 (Fatty change, diffuse/
microvesicular)、肝臓のマクロファージ や リ ン パ 球 を 主 と す る 単 核 球 浸 潤 (Infiltration, mononuclear cells)、前 立 腺 の び ま ん 性 / 限 局 性 リ ン パ 球 浸 潤 (Infiltration, mononuclear cells, di‑
ffuse/focal) 、 限 局 性 心 筋 炎 (Infilt‑
ration, neurtrophils, focal)がいずれ の群にも認められた。しかし、いずれも 対照群と同程度の発生であり有意差は認 められなかった。
2‑5.精子数及びホルモン変動
右精巣上体中に存在する精子数を計測 した結果、個体毎のばらつきが大きく、
各実験群間に有意差は認められなかった
（図 8）。また、血清中に存在するテスト ステロン、エストラジオール E2、FSH 及 び TSH 量を ELISA により定量した結果、
実験群を問わず、いずれのホルモンとも に大きな変動は観察されなかった（図 9）。
(3)ケーススタディ 3：RNA アプタマーを 用いた革新的医用材料の創製
3‑1.RNA アプタマー候補の選定
試験管内転写法によって合成したいず れの RNA アプタマーともに、BIAcore 解析 に必要な量と純度が得られた。
bFGF との相互作用を解析した結果、bFA 及び 1p01 に bFGF を添加することにより RU 値が増加したことから、これらのアプ タマーは bFGF に結合することが確認され た。また、これらの複合体に FGFR1 を添 加した際、RU 値が若干上昇したことから、
アプタマー/bFGF/FGFR1 三者複合体も形
成されることが確認された（図 10a）。
ヘパリン存在下での相互作用解析を行 った結果、bFA 及び 1p01 ともに bFGF との 結合能力が顕著に低下した。FGFR1 を添加 して三者複合体形成状況を検討した結果、
bFA では FGFR1 添加による RU 値変動は観 察されなかったが、1p01 では bFGF 添加前 と同程度まで RU 値が顕著に低下した（図 10b）。bFGF/FGFR1 結合にはヘパリンが重 要な役割を果たしていることが知られて いるため、その他の RNA アプタマー候補 についても同様の実験を行った結果、い ずれも 1p01 と類似した性状を示した（図 11）。これらの結果から、RNA アプタマー 候補として、1p01、1p02、1p07、2p03、
2p05 及び 2p11 を選択し、細胞に対するシ グナル伝達阻害能を評価することとした。
3‑2.bFGF 活性に及ぼす RNA アプタマーの 影響評価
BIAcore を利用した bFGF/FGFR1 結合能 解析結果に基づいて、bFA、40N、1p01、
1p02、1p07、2p03、2p05 及び 2p11 の bFGF 細胞刺激阻害能の評価を行なった。その 結果、bFA、1p07、2p05 及び 2p11 では P‑FRS2 抗体と P‑ERK 抗体を用いたウエス タンブロットによりバンドが確認されな かったが、40N、1p01、1p02 及び 2p03 で は FRS2 と ERK のリン酸化体が検出された
（図 12 上段，中段）。Actin は、いずれの 試料ともに抗 Actin 抗体を用いたウエス タンブロットにより問題なく検出された
（図 12 下段）。これらの結果から、1p01、
1p02 及び 2p03 は、bFGF の生理活性を保 った状態で bFGF を補足する RNA アプタマ ーであることが判明した。
3‑3.RNA アプタマー固定化用 PEG 表面の作
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製と表面解析
金コートしたガラス板のほか、同基材 上に PEG5k 又は PEG5k‑poly dT を結合さ せた材料表面の静的接触角を測定した結 果、金表面は 86の接触角を有していたが、
PEG5k 及び PEG5k‑poly dT 固定化表面の接 触角はいずれも低下し、それぞれ 37及び 51を示した（図 13）。XPS 解析を行った結 果、リン元素のピークが PEG5k‑poly dT 固 定化表面のみに検出されたことから、
PEG5k‑poly dT が基板上に存在しているこ とが確認された（図 14）。
Ｄ．考 察
(1)ケーススタディ 1：ISO/TC194/WG9 溶 血性試験ラウンドロビンテスト支援 ラウンドロビンテストのプロトコルは、
医療機器の溶血性試験のために国際的に 広く用いられている ASTM 法、NIH 法及び MHLW 法の 3 法から構成されている。Pilot Run においては、溶血性の異なる 5 種類の 試料を用いて各試験法の性能が評価され たが、試験法毎に得られるデータが相違し、
中でも MHLW 法の検出感度が比較的低い成 績が得られた。これは試料の特性に由来す ることが懸念されたため、我々が開発した 溶血性試験用陽性対照材料 Genapol X‑080 含有 PVC シート 7,8)の処方を改良し、その 基本性能を検証した。その結果、同陽性対 照材料は Genapol X‑080 添加量に応じて弱 溶血性又は強溶血性を示すことが確認さ れたことから、ラウンドロビンテスト用標 準品として提供した。
(2)ケーススタディ 2：代替可塑剤の安全 性評価/DOTP のラット亜慢性毒性試験 SD 系雄ラットを用いて DOTP 及び DEHP を 13 週間混餌投与した結果、投与による
影響は、肝臓に肝相対重量の増加に対応 し、びまん性の肝細胞肥大として DEHP 群 にのみ観察された。DOTP 投与群には同様 の変化は認められなかった。同変化は、
肝細胞が顆粒状/好酸性でびまん性に肥 大していると共に、DEHP が PPARα作用を 有することが明らかになっていることか ら、Peroxisome の増加に起因することが 示唆された。小葉周辺性の肝細胞脂肪化 は、本試験において使用した SD 系ラット の雄で体重増加及び加齢により増加する 変化である。対照群及び DOTP 群のみに認 められた脂肪化は、通常の 13 週間反復投 与毒性試験の背景値と比較して若干進行 していると考えられた。肝細胞脂肪化は、
高脂肪食や高カロリー摂取で観察される ことから、この脂肪化は飼料に起因する 可能性が示唆された。また、DEHP 群では 脂肪化が殆ど認められなかったが、これ は上記のとおり、投与による肝肥大が誘 発されているためと考えられた。
本試験では、DEHP 及び DOTP 投与群とも に、精巣における病理組織学的変化は観 察されなかった。精巣上体管腔は、軽度 な精子形成異常や精細管変性が生じた場 合、変性した精上皮細胞が腔内に増加す ることから、精巣毒性を検出する鋭敏な 部位とされているが、今回いずれの投与 群においても精巣上体に精巣への影響を 示唆する所見は認められなかった。これ らの結果から、今回の投与条件下では、
DOTP 及び DEHP ともに精巣への影響は認め られないと結論した。我が国において定 められた DEHP の経口摂取 TDI 値は 40‑140
g/kg/day であり、その上限値と下限値は
それぞれ Poon ら及び Lamb らの報告に基 づいて決定された6,9,10)。本研究は Poon ら の報告に準拠して実施したが、DEHP が精- 67 -
巣/生殖毒性を発現する用量は報告毎に 異なっているため、今後実施する代替可 塑剤の毒性試験においては、Lamb らの報 告に従って投与量を設定する。
その他の各臓器に認められた病理組織 学的変化については、対照群と同程度で あり有意差は認められなかったことから、
投与に関連した増加とは考えられなかっ た。肝細胞脂肪は肉眼的な脂肪肝に対応 する変化と考えられた。
(3)ケーススタディ 3：RNA アプタマーを 用いた革新的医用材料の創製
本研究では、特許戦略を考慮した製品 開発に係るケーススタディとして、RNAア プタマーを用いた革新的医用材料の創製 を目指し、生理活性を保持した状態で増 殖因子であるbFGFを補足するRNAアプタ マーを選定すると共に、材料表面への適 切な固定化法を確立することを試みた。
BIAcoreによる相互作用解析の結果、
RNAアプタマー、bFGF及びFGFR1間の相互 作用はヘパリンの存在の有無により大き く影響された。bFGFはヘパリン結合性増 殖因子であり、ヘパリンがbFGF/FGFR1間 の結合を安定化することが知られている。
ヘパリンは核酸と同様に負電荷を帯びて いる。一方、bFGFは正電荷に富んでいる ため、ヘパリンとbFGFとの間には静電相 互作用が働いている。それ故、ヘパリン 非存在下において検出されたRNAアプタ マー/bFGF相互作用には静電効果による 非特異的な結合も含まれていたと考えら れる。また、ヘパリン非存在下では、RNA アプタマー/bFGF/FGFR1三者複合体が形 成される成績が得られたが、ヘパリン非 存在下ではbFGF/FGFR1の相互作用が弱い ため、ここで確認された三者複合体形成
も静電相互作用等による非特異的結合で あることが示唆された。
ヘ パ リ ン 存 在 下 で も RNA ア プ タ マ ー /bFGF間に非常に弱い相互作用が確認さ れた。これは、bFGFがヘパリン結合部位 を持っているため、bFGFへの結合に関し てヘパリンとRNAアプタマーが競合した ことに由来すると思われる。一方、RNAア プタマー/bFGF複合体にFGFR1を添加した 際、各因子間の相互作用はRNAアプタマー 候補毎に異なる挙動を示した。bFA/bFGF の場合、RU値に変化が観測されなかった ことから、同複合体にFGFR1が結合できな かったことが確認された。これは、bFAが bFGFのFGFR1結合部位又は同部位近傍に 強く結合してbFA/bFGF複合体を形成する ことにより、bFGF/FGFR1間の相互作用を bFAが阻害し、bFA/bFGF/FGFR1三者複合体 形成されないことに由来すると思われる。
一方、1p07/bFGF複合体にFGFR1を添加し た際、RU値が若干低下した。これは、FGFR1 によって1p07/bFGF複合体からbFGFが若 干解離したことが原因であると考えられ る。その他のアプタマー及び40Nに関して は、FGFR1の添加により、RU値がRNAアプ タマー単独の場合と同程度まで減少して い る 。 こ れ は ヘ パ リ ン 存 在 下 で は bFGF/FGFR1相互作用が強く、FGFR1添加に 伴いbFGF/FGFR1複合体が優先的に形成さ れ、bFGFが完全にRNAアプタマーから解離 したことを示唆している。
生体内において、bFGF/FGFR1 間の相互 作用にはヘパリンが重要な役割を果たし ているため、RNA アプタマーの機能解析は 実験レベルでもヘパリン存在下で行うこ とが重要となる。bFA はヘパリン存在下に おいても bFGF/FGFR1 間の相互作用を阻害 したが、今回選定した RNA アプタマー候
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補と bFGF との相互作用は、bFGF/FGFR1 相 互作用よりも弱く、RNA アプタマー/bFGF 複合体に FGFR1 を添加した際、bFGF から RNA アプタマーが解離した。本来の目的と しては、RNA アプタマー/bFGF/FGFR1 三者 複合体が安定して形成されることが理想 的であるが、RNA アプタマー/bFGF 複合体 形成によって材料表面に補足された bFGF が細胞膜上に存在する FGFR1 と結合した 後に RNA アプタマーから解離した場合で も、bFGF シグナル伝達が正常に稼働する 環境であれば機能性材料としての性能は 確保される。NIH3T3 細胞に対する bFGF の 細 胞 刺 激 阻 害 試 験 を 行 っ た 結 果 、 bFGF/FGFR1 相互作用を阻害することが知 られている bFA のほか、1p07 及び 2p11 も FRS2 及び ERK のリン酸化を強く阻害した。
1p07 及び 2p11 は、それぞれ異なるプール から選別されたアプタマーであるが，両 者の配列相同性が高いため、同様の性質 を示したものと考えられる。一方、1p01、
1p02 及び 2p03 は FRS2 及び ERK のリン酸 化を阻害しないことが確認された。これ らの結果は BIAcore 解析において得られ た成績とも一致していることから、今後、
この 3 種類の RNA アプタマーを利用して 機能性材料の開発を進めて行く。
Ｅ．結 論
(1)ケーススタディ 1：ISO/TC194/WG9 溶 血性試験ラウンドロビンテスト支援 Pilot Run において配布された各種材料 は、陰性対照を除き、ASTM 法、NIH 法及 び MHLW 法によりそれぞれ異なる溶血挙動 を示した。一方、我々が開発した Genapol X‑080 含有 PVC シートの性能は良好であり、
いずれの試験法においても類似した溶血 性が観察されたことから、同 PVC シート
をラウンドロビンテスト用標準品として 提供した。
(2)ケーススタディ 2：代替可塑剤の安全 性評価/DOTP のラット亜慢性毒性試験 代替可塑剤の安全性を評価する一環と して、SD 系雄ラットを用いて DOTP 及び DEHP を 13 週間混餌投与した結果、投与に よる影響は、DEHP 投与群の肝臓にのみ観 察された。DOTP については、いずれの臓 器においても投与による影響は認められ ず、その無毒性量は 297±12 mg/kg/day 以上と判定された。
(3)ケーススタディ 3：RNA アプタマーを 用いた革新的医用材料の創製
RNA アプタマーを用いた革新的医用材 料の創製を目指し、生理活性を保持した 状態で bFGF を補足する RNA アプタマーを 選定した結果、1p01、1p02 及び 2p03 が機 能性材料として利用できることが確認さ れた。本研究においては、金コートした ガラス板上への RNA アプタマー固定化法 も確立した。
Ｆ．健康危険情報 特になし。
Ｇ．研究発表等
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