イネ開花遺伝子Hd3aの機能解析

イ ネ 開 花 促 進 遺 伝 子 Hd3a の 機 能 解 析

玉 置 祥 二 郎

奈 良 先 端 科 学 技 術 大 学 院 大 学

バ イ オ サ イ エ ン ス 研 究 科 植 物 分 子 遺 伝 学 講 座 （ 島 本 功 教 授 ）

目 次

序 論 ---4 材 料 お よ び 方 法 ---14 1.材 料 お よ び 生 育 条 件 ---14 2.方 法 ---15 結 果 ---19 1.Hd3a の 器 官 組 織 別 発 現 解 析 ---19 2.一 過 的 発 現 解 析 ---20 3.組 織 化 学 染 色 ---22 4.Hd3a:GFP タ ン パ ク 質 の 機 能 解 析 ---24 考 察 ---30 1.器 官 組 織 別 発 現 解 析 ---30 2.一 過 的 発 現 解 析 ---32 3.Hd3a:GFP タ ン パ ク 質 の 機 能 解 析 ---34 4.Hd3a タ ン パ ク 質 は フ ロ リ ゲ ン で あ る 可 能 性 が 高 い ---35 5.フ ロ リ ゲ ン Hd3a タ ン パ ク 質 の 植 物 に お け る 機 能 ---36 ま と め ---41

謝 辞 ---42

参 考 文 献 ---43

表 ---50

序 論

植 物 に お い て 花 を つ け 自 ら の 子 孫 を 残 す こ と は 最 も 重 要 な イ ベ ン ト の 一 つ で あ る 。 発 芽 後 の 植 物 の 地 上 部 器 官 は す べ て 茎 の 先 端 に あ る 茎 頂 分 裂 組 織 に お い て 作 ら れ て い る 。 植 物 が 花 を つ け る と い う こ と は 、 茎 頂 分 裂 組 織 に お い て 栄 養 器 官 で あ る 葉 を 作 り 続 け て い る 栄 養 生 長 の 状 態 か ら 、 生 殖 器 官 で あ る 花 芽 を つ く り 始 め る 生 殖 生 長 へ の 移 行 が 起 き た 結 果 で あ る 。 茎 頂 分 裂 組 織 に お い て 葉 を 作 る 栄 養 成 長 か ら 花 芽 を 作 る 生 殖 成 長 へ の 移 行 （ 以 後 本 文 で は 花 成 と す る ） は 環 境 要 因 に よ り コ ン ト ロ ー ル さ れ て い る 。 植 物 の 生 長 に 影 響 を 及 ぼ す こ と が 明 ら か と な っ て い る 環 境 要 因 に は 様 々 な も の が あ る が 、 そ の う ち の 一 つ に 日 長 ま た は 光 周 期 が あ り そ れ ら は 植 物 が 季 節 を 判 断 し 花 成 の タ イ ミ ン グ を 決 め る の に 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る （ Corbesier and Coupland, 2005; Corbesier and Coupland, 2006; Imaizumi and Kay, 2006; Simpson and Dean, 2002; Zeevaart, 2006） 。 植 物 の 花 成 が 日 長 に よ り 制 御 さ れ る こ と は 1923 年 に は じ め て Garner と Allard に よ り 報 告 さ れ た 。彼 ら は 、植 物 が 周 囲 の 日 長 条 件 を 正 確 に 知 覚 し て 花 成 の 誘 導 の 有 無 を 決 定 し て い る こ と を 、 タ バ コ の 変 異 株 Maryland Mammoth を 用 い た 解 析 か ら 明 ら か に し た 。 一 般 的 に タ バ コ の 野 生 株 は 夏 の 間 に 花 を つ け る こ と が 知 ら れ て い た が 、 こ の Maryland Mammoth 変 異 株 は 、 夏 の 間 に は 花 を つ け ず 生 長 し 冬 の 自 然 日 長 条 件 下 に 花 を つ け る 。 彼 ら は 、 夏 に 人 工 的 な 短 日 条 件 を つ く り そ こ で こ の Maryland Mammoth を 育 成 し 、Maryland Mammoth が 夏 に お い て も 短 日 条 件 に お く と 花 を つ け る こ と を 確 認 し た 。こ の 結 果 か ら 、

彼 ら は Maryland Mammoth が 花 を 咲 か せ る 時 期 を 決 め る 要 因 は 日 長 で あ る と 結 論 づ け 、 植 物 が 日 長 を 認 識 で き る こ と を 確 認 し た 。 そ の 後 、 多 く の 植 物 生 理 学 者 が 植 物 の 日 長 応 答 に 関 す る 研 究 を 行 い 、 植 物 が 示 す 日 長 へ の 花 成 反 応 を 基 に 多 く の 植 物 を 短 日 、 長 日 、 中 性 植 物 へ と 大 別 し た 。 短 日 植 物 は 、 夜 （ 暗 期 ） の 長 さ が あ る 一 定 の 長 さ を 超 え る と 花 成 が 促 進 さ れ る 植 物 で 、 イ ネ 、 キ ク 、 ア サ ガ オ 、 先 ほ ど 出 て き た Maryland Mammoth が 短 日 植 物 に 分 類 さ れ る 。一 方 長 日 植 物 は 、昼（ 明 期 ） の 長 さ が あ る 一 定 の 長 さ を 超 え る と 花 成 が 促 進 さ れ る 植 物 で 、 シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ や ド ク ム ギ 、ホ ウ レ ン ソ ウ な ど が 長 日 植 物 に 分 類 さ れ る 。 中 性 植 物 は 、 日 の 長 さ （ 明 期 、 暗 期 の 長 さ ） に ほ ぼ 関 係 な く 決 ま っ た 時 期 に 花 を 咲 か せ る 植 物 の こ と で 、 ト マ ト 、 イ ン ゲ ン マ メ な ど が 中 性 植 物 に 分 類 さ れ る 。 さ ら に 1934 年 に は Knott が ホ ウ レ ン ソ ウ を 用 い て 、植 物 が 日 長 を 知 覚 す る 部 位 が 葉 で あ る こ と を 示 し た 。 長 日 植 物 で あ る ホ ウ レ ン ソ ウ の 葉 の み を 長 日 条 件 下 に 置 い た と こ ろ 、 そ の ホ ウ レ ン ソ ウ は 速 や か に 花 成 が 誘 導 さ れ た 。 一 方 、 茎 頂 分 裂 組 織 の み を 長 日 条 件 に 置 い た と こ ろ そ の ホ ウ レ ン ソ ウ の 花 成 は 促 進 さ れ な か っ た 。 こ の こ と は 、 植 物 が 花 成 を 誘 導 す る 日 長 条 件 で あ る か ど う か を 判 断 す る の は 葉 で あ る こ と と 、 適 当 な 日 長 条 件 で 花 成 が 促 進 さ れ る た め に は 葉 で 受 け 取 っ た 日 長 の 情 報 が 何 ら か の 形 で 茎 頂 へ と 伝 わ っ て い る こ と を 示 し て い る 。 1936 年 に ロ シ ア の 科 学 者 Chailakhyan は 、 短 日 植 物 で あ る キ ク を 用 い て 、Knott と 同 様 の 結 果 を 得 た 。彼 は 花 成 を 誘 導 す る 日 長 条 件 下 に 置 か れ た 植 物 の 葉 で 作 ら れ 、 茎 頂 分 裂 組 織 に お い て 花 芽 の 形 成 を 誘 導 す

る 基 質 も し く は 刺 激 を 、 植 物 に 対 し て 普 遍 的 に 作 用 し 唯 一 で 特 殊 な も の で あ る と し 、 フ ロ リ ゲ ン と 名 づ け た 。 日 長 へ の 花 成 応 答 お よ び フ ロ リ ゲ ン の 実 体 を 明 ら か に す る た め に 、 日 長 に よ り 花 成 が 制 御 さ れ る 植 物 を 用 い て 様 々 な 生 理 学 的 な 実 験 が 行 わ れ た 。 特 に 接 木 実 験 は 花 成 を 誘 導 す る 日 長 条 件 下 に 置 か れ た 植 物 の 葉 が 花 成 誘 導 の シ グ ナ ル を 作 っ て い る こ と を 明 確 に 証 明 す る 実 験 で あ る 。1985 年 に Zeevaart ら は 短 日 植 物 で あ る シ ソ の 葉 を 用 い て 接 木 実 験 を 行 い 、 花 成 誘 導 の シ グ ナ ル が 葉 で 作 ら れ る こ と を 強 く 示 唆 す る 結 果 を 得 た 。 彼 ら は 短 日 条 件 に 置 か れ た シ ソ の 葉 を 長 日 条 件 に 置 か れ た シ ソ の 台 木 に 接 ぎ 、 台 木 に お い て 花 成 が 誘 導 さ れ る こ と を 示 し 、 フ ロ リ ゲ ン が 葉 で 作 ら れ る こ と を 示 し た 。 こ の 実 験 の 結 果 は ま た フ ロ リ ゲ ン が 接 木 処 理 を し た 組 織 を 超 え る こ と が 可 能 で あ る こ と も 示 し て い る 。 タ バ コ に は 先 ほ ど 例 に 挙 げ た Maryland Mammoth と は 異 な り 長 日 条 件 に よ り 花 成 が 誘 導 さ れ る 品 種 Nicotiana sylvestris が 存 在 す る 。 こ の 品 種 に 短 日 植 物 に 分 類 さ れ る Maryland Mammoth を 接 ぎ 、 長 日 条 件 に お い た と こ ろ Maryland Mammoth の 花 成 が 誘 導 さ れ た 。 こ の こ と は 、 長 日 植 物 と 短 日 植 物 と 異 な る 日 長 応 答 性 を 示 す 植 物 に お い て 花 成 を 誘 導 す る 物 質 が 同 一 で あ る こ と を 示 し て い る 。

1968 年 King ら お よ び 1973 年 King お よ び Zeevaart に よ り 植 物 体 に お け る フ ロ リ ゲ ン の 動 き の パ タ ー ン と そ の 速 度 が 調 べ ら れ 、 そ の 結 果 光 合 成 同 化 産 物 が 示 す そ れ と 非 常 に 似 通 っ て い る こ と が 明 ら か と な っ た 。 こ の こ と は 花 成 誘 導 の シ グ ナ ル が 篩 管 を 通 じ て 移 動 し て い る 可 能 性 が 高 い こ と を 示 し て い る 。

現 在 ま で に 植 物 生 理 学 者 に よ り 行 わ れ た 生 理 学 的 な 解 析 の 結 果 か ら フ ロ リ ゲ ン が 持 つ 特 徴 お よ び 性 質 を 以 下 に 示 す と ① 植 物 の 花 成 が 誘 導 さ れ る 日 長 条 件 下 の 葉 に お い て 作 ら れ る 。 ② 植 物 の 花 成 を 誘 導 す る こ と が 可 能 で あ る 。 ③ 接 木 間 を 移 動 で き る 。 ④ 長 日 植 物 と 短 日 植 物 に お い て 共 通 で あ る 。 ⑤ 篩 管 を 通 じ て 移 動 し て い る と 考 え ら れ る 。 ⑥ 茎 頂 分 裂 組 織 に シ グ ナ ル と し て 伝 わ る こ と が で き る 。 と な る （ Corbesier and Coupland, 2005; Corbesier and Coupland, 2006; Zeevaart, 2006, 瀧 本 , 1998） （ 表 １ 、 図 １ ）。 こ の よ う に そ の 特 徴 お よ び 性 質 が 示 さ れ 、 長 年 そ の 存 在 が 強 く 示 唆 さ れ て い た に も 関 わ ら ず 生 理 学 的 お よ び 生 化 学 的 な 解 析 か ら は フ ロ リ ゲ ン の 実 体 を 明 ら か に す る こ と は で き な か っ た 。 近 年 、 長 日 植 物 の モ デ ル 植 物 で あ る シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ お よ び 短 日 植 物 の モ デ ル 植 物 で あ る イ ネ を 用 い た 分 子 遺 伝 学 的 な 研 究 の 急 速 な 発 展 に よ り 日 長 に よ り 植 物 の 花 成 が 誘 導 さ れ る 分 子 機 構 が 明 ら か に さ れ て き た 。 シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ に お い て 花 成 を 調 節 す る 主 な 反 応 経 路 と し て は 、 日 長 （ 光 周 性 ）、 春 化 、 ジ ベ レ リ ン 、 自 律 経 路 の 四 つ が 知 ら れ て い る 。 そ の う ち シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ の 光 周 性 花 成 経 路 に お い て 機 能 す る 遺 伝 子 と し て は 主 に GIGANTEA （ GI ）、CONSTANS （ CO ）、FLOWERING LOCUS T （ FT ） が 報 告 さ れ て お り 、 こ の な か で 日 長 （ 光 周 性 ） に よ る 花 成 の 制 御 過 程 で 重 要 に な る の は CO と FT で あ る 。GI は 核 局 在 タ ン パ ク 質 を コ ー ド し て お り 、 植 物 の 光 周 性 反 応 と 密 接 に 関 係 す る 概 日 時 計 を 構 成 も し く は そ の 近 傍 に 位 置 す る 遺 伝 子 と し て 知 ら れ て い る （ Fowler et al., 1999; Park et al., 1999） 。CO は 、N 末 端 側 に B-box タ イ プ の Zn finger を C 末 端

側 に CCT と 呼 ば れ る 領 域 を 持 つ タ ン パ ク 質 を コ ー ド し て お り 、CO 遺 伝 子 の 下 流 に 位 置 す る 遺 伝 子 の 発 現 を 制 御 す る 転 写 因 子 と し て 機 能 し て い る と 考 え ら れ て い る （ Putterill et al., 1995; Robson et al., 2001） 。 CO 遺 伝 子 は シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ の 維 管 束 で 特 に 強 い 発 現 を 示 す が 、 茎 頂 で も わ ず か に 発 現 し て い る 事 が 確 認 さ れ て い る （ Takada and Goto, 2003; An et al., 2004）。 花 成 に お い て CO タ ン パ ク 質 の 機 能 が 植 物 の ど こ で 必 要 と さ れ る か を 明 ら か に す る た め に 、co 変 異 体 に 組 織 特 異 的 な 活 性 を 持 つ プ ロ モ ー タ ー を 用 い て CO 遺 伝 子 を 発 現 さ せ た と こ ろ 、CO タ ン パ ク 質 の 機 能 が 必 要 と さ れ る の は 茎 頂 で は な く 維 管 束 篩 部 で あ る こ と が 示 唆 さ れ る 結 果 が 得 ら れ た （ An et al., 2004） 。 FT 遺 伝 子 は CO 遺 伝 子 に よ り 発 現 が 正 に 制 御 さ れ て い る 遺 伝 子 で あ る 。こ の FT の 発 現 制 御 に は CO 以 外 の 新 た な タ ン パ ク 質 の 合 成 を 必 要 と し な い こ と か ら 、 CO に よ る FT の 転 写 制 御 は 直 接 的 な 関 係 で あ る と 考 え ら れ て い る （ Kobayashi et al., 1999） 。 2006 年 に は HAP と 呼 ば れ る タ イ プ の DNA 結 合 能 力 を 持 つ 転 写 因 子 と CO が CCT ド メ イ ン を 介 し て タ ン パ ク 質 間 相 互 作 用 し 長 日 条 件 下 の FT の 転 写 を 促 進 し て い る こ と が 明 ら か と な っ た （ Wenkel et al., 2006） 。 FT 遺 伝 子 が コ ー ド し て い る タ ン パ ク 質 は 、分 子 量 が 20kDa と 非 常 に 小 さ く ホ ス フ ァ チ ジ ル エ タ ノ ー ル ア ミ ン 結 合 タ ン パ ク 質（ PEBP）と よ く 似 て い る こ と は 明 ら か と な っ て い る が 、 そ の 詳 し い 生 化 学 的 機 能 は 不 明 で あ る 。（ Kardailsky et al., 1999; Kobayashi et al., 1999; Suarez-Lopez et al., 2001; Yanovsky and Kay, 2002） 。こ の FT 遺 伝 子 は シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ の 花 成 が 促 進 さ れ る 長 日 条 件 下 に お い て の み CO に よ っ て 発 現 が 誘 導 さ れ 、 花 成 が 抑 制 さ れ る 短

日 条 件 で は そ の 発 現 が ほ と ん ど 検 出 さ れ な い 。 FT 遺 伝 子 の 欠 損 変 異 体 は シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ の 花 成 誘 導 条 件 で あ る 長 日 条 件 に お い て も 花 成 が 遅 延 し 、 逆 に 過 剰 発 現 体 は 早 咲 き 表 現 型 を 示 す こ と が 明 ら か と な っ て い る （ Kardailsky et al., 1999; Kobayashi et al., 1999）。 ま た 、 FT 遺 伝 子 の 花 成 の 促 進 へ 及 ぼ す 効 果 は 、 そ の 発 現 量 に 依 存 的 で あ る （ Kardailsky et al., 1999; Kobayashi et al., 1999）。 FT 遺 伝 子 の シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ に お け る 発 現 部 位 は 、 花 成 に 影 響 し て い る に も か か わ ら ず 葉 の 維 管 束 の み に 限 ら れ て お り 、 茎 頂 分 裂 組 織 で は 検 出 さ れ な か っ た （ Takada and Goto, 2003） 。 変 異 体 が 遅 咲 き 、 過 剰 発 現 体 が 早 咲 き 表 現 型 を 示 す に も 関 わ ら ず 、 そ の 発 現 が 茎 頂 分 裂 組 織 で 認 め ら れ ず 、 葉 の 維 管 束 で の み 発 現 す る FT 遺 伝 子 が ど の よ う に 花 成 を 制 御 し て い る の か は 最 近 ま で 不 明 で あ っ た 。 2005 年 に 、 こ の FT 遺 伝 子 の 過 剰 発 現 体 が 示 す 早 咲 き 表 現 型 を 抑 圧 す る 変 異 体 の ス ク リ ー ニ ン グ お よ び 酵 母 を 用 い た FT タ ン パ ク 質 と タ ン パ ク 質 間 相 互 作 用 す る 遺 伝 子 の 探 索 が 行 わ れ た 結 果 、FD 遺 伝 子 が 単 離 さ れ た （ Abe et al., 2005; Wigge et al., 2005） 。FD 遺 伝 子 は 、1991 年 に す で に 花 成 に 影 響 を 及 ぼ す 遺 伝 子 座 と し て 報 告 さ れ て い た が 、fd 変 異 体 が 示 す 遅 咲 き の 表 現 型 が 比 較 的 軽 微 で あ る た め こ れ ま で あ ま り 解 析 さ れ て こ な か っ た （ Koornneef et al., 1991） 。こ の 遺 伝 子 の 発 現 部 位 は 、茎 頂 分 裂 組 織 に 限 ら れ て お り 、生 育 ス テ ー ジ が 経 つ に つ れ て 日 長 の 区 別 無 く 発 現 量 が 上 昇 し て く る 。FD 遺 伝 子 は bZIP 型 の 転 写 因 子 を コ ー ド し て お り 、細 胞 内 で は 核 に 局 在 し て い る こ と が 明 ら か と な っ て い る 。 酵 母 を 用 い た タ ン パ ク 質 間 相 互 作 用 の 結 果 お よ び 蛍 光 タ ン パ ク 質 を 用 い た 解 析 手 法 の 一 つ で あ る BiFC

analysis を 用 い た 細 胞 内 で の FT お よ び FD の 相 互 作 用 解 析 の 結 果 か ら 、 こ れ ら 二 つ の 遺 伝 子 は 核 に お い て タ ン パ ク 質 レ ベ ル で 相 互 作 用 し 下 流 の タ ー ゲ ッ ト 遺 伝 子 で あ る AP1 や SOC1 な ど の 発 現 を 誘 導 す る こ と で 花 成 を 誘 導 し て い る と 考 え ら れ て い る （ Abe et al., 2005; Wigge et al., 2005; Searle et al., 2006） 。 FD タ ン パ ク 質 が FT タ ン パ ク 質 と 相 互 作 用 す る 事 で 花 成 が 促 進 さ れ る こ と が 明 ら か と な っ た が 、 そ れ ぞ れ の 遺 伝 子 の 発 現 部 位 に は 空 間 的 な 隔 た り が 存 在 す る 。 シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ の 花 成 の 誘 導 条 件 で あ る 長 日 条 件 下 の 葉 の 維 管 束 で 発 現 す る FT 遺 伝 子 が 、 茎 頂 分 裂 組 織 に お い て FD タ ン パ ク 質 と タ ン パ ク 質 間 相 互 作 用 し て 花 成 を 誘 導 す る た め に は 、 FT 遺 伝 子 の 産 物 が 発 現 部 位 で あ る 葉 の 維 管 束 か ら 茎 頂 分 裂 組 織 へ と 移 動 し て い な け れ ば な ら な い こ と を 示 し て い る 。 と こ ろ で 、 興 味 深 い こ と に FT 遺 伝 子 の 産 物 が 葉 か ら 茎 頂 へ と 移 動 し 花 成 を 誘 導 し て い る の で は な い か と い う 仮 定 は 、 本 文 前 半 で 示 し た 植 物 に お い て 花 成 を 誘 導 す る フ ロ リ ゲ ン が も つ 特 徴 お よ び 性 質 と 一 致 す る 。 こ の こ と は 、 長 年 謎 と さ れ て き た フ ロ リ ゲ ン の 実 体 を FT 遺 伝 子 が コ ー ド し て い る 可 能 性 が 高 い こ と を 強 く 示 唆 し て い る 。 FT 遺 伝 子 が フ ロ リ ゲ ン で あ る こ と を 示 す に は 、 FT 遺 伝 子 の 産 物 が 茎 頂 分 裂 組 織 ま で 移 動 し て い る こ と を 示 す 必 要 が あ る 。 こ の FT 遺 伝 子 産 物 の 移 動 に 関 し て は 、 シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ 以 外 の 植 物 を 用 い た 解 析 で い く つ か 結 果 が 示 さ れ て い る 。 2006 年 に Brassica napus の 篩 管 液 の Proteome 解 析 の 結 果 か ら 、篩 管 液 中 の タ ン パ ク 質 の 中 に Brassica napus の FT の 相 同 遺 伝 子 の タ ン パ ク 質 が 含 ま れ る こ と が 示 さ れ た （ Giavalisco et al., 2006）。 こ の こ と は FT

タ ン パ ク 質 が 篩 管 液 に 含 ま れ て 篩 管 を 移 動 し て い る 可 能 性 が 高 い 事 を 示 し て い る 。 ま た 同 年 に ト マ ト を 用 い て 、 FT の 相 同 遺 伝 子 の mRAN は 接 木 間 を 移 動 し な い こ と が 示 さ れ た 。 ト マ ト に お い て FT 遺 伝 子 と 高 い 相 同 性 を 示 す SFT 遺 伝 子 の 欠 失 変 異 体 は シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ の ft 変 異 体 同 様 開 花 遅 延 の 表 現 型 を 示 し 、 35S プ ロ モ ー タ ー に よ る 恒 常 的 な 発 現 は 早 咲 き の 表 現 型 を 示 す 。 こ の 欠 失 変 異 体 に FT を 過 剰 発 現 さ せ た 形 質 転 換 体 を 接 木 さ せ た と こ ろ 、 欠 失 変 異 体 の 遅 咲 き 表 現 型 が 回 復 し た （ Lifschitz et al., 2006）。 こ の と き 接 木 間 の FT mRNA の 移 動 の 有 無 を 確 認 し た と こ ろ FT mRNA の 接 木 間 の 移 動 は 確 認 さ れ な か っ た 。 こ れ ま で に 示 し た FT 遺 伝 子 と そ の 相 同 性 遺 伝 子 に お け る 解 析 の 結 果 、 日 長 に 応 じ た 発 現 誘 導 、 植 物 体 に お い て 葉 で の み 発 現 し て い る こ と 、 茎 頂 分 裂 組 織 に お い て 機 能 す る こ と な ど 、 植 物 に お い て FT 様 遺 伝 子 群 が 長 年 謎 と さ れ て き た フ ロ リ ゲ ン の 実 体 を コ ー ド し て い る 可 能 性 が 高 い こ と を 示 し て い る（ Corbesier and Coupland, 2005; Corbesier and Coupland, 2006; Zeevaart, 2006）。し か し 、FT 様 遺 伝 子 群 が フ ロ リ ゲ ン で あ る と い う 決 定 的 な 証 拠 を 示 す ま で に は い た っ て い な い 。 な ぜ な ら ば 、 現 時 点 に お い て 茎 頂 分 裂 組 織 以 外 の 組 織 で 発 現 さ せ た FT 様 遺 伝 子 の mRNA も し く は タ ン パ ク 質 が 、 FT タ ン パ ク 質 が 実 際 機 能 し て い る と 思 わ れ る 茎 頂 分 裂 組 織 に お い て 検 出 さ れ た 結 果 が 報 告 さ れ て い な い か ら で あ る 。 イ ネ は シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ と は 逆 に 短 日 条 件 で 花 成 が 促 進 さ れ る こ と が 知 ら れ て い る 。イ ネ の 花 成 時 期 の 品 種 間 差 を 決 定 す る QTL（ quantitative trait loci ; 量 的 形 質 遺 伝 子 座 ） 解 析 の 結 果 イ ネ の 日 長 に よ る 花 成 制 御

に 関 与 す る と 思 わ れ る 多 数 の 候 補 遺 伝 子 座 が 示 さ れ た 。 こ れ ら の 一 つ か ら マ ッ プ ベ ー ス ク ロ ー ニ ン グ に よ り 同 定 さ れ た も の が Hd1 遺 伝 子 で あ る （ Yano et al., 2000）。 こ の Hd1 遺 伝 子 は シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ に お け る CO 遺 伝 子 と ア ミ ノ 酸 レ ベ ル で 高 い 相 同 性 を 示 す 。ま た 2003 年 に は 同 じ く QTL 解 析 か ら Hd3a 遺 伝 子 が 同 定 さ れ 、そ の 機 能 が 解 析 さ れ た （ Kojima et al., 2002）。 Hd3a の 発 現 は イ ネ の 花 成 が 誘 導 さ れ る 短 日 条 件 で の み 発 現 が 誘 導 さ れ る （ Hayama et al., 2003; Kojima et al., 2002）。 ま た こ の 遺 伝 子 は シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ の FT と ア ミ ノ 酸 レ ベ ル で 非 常 に 高 い 相 同 性 を 示 し 、 そ の 過 剰 発 現 体 は 早 咲 き 表 現 型 を 示 す （ 図 2B）。 こ の こ と は 、 Hd3a 遺 伝 子 が 短 日 植 物 で あ る イ ネ の 短 日 条 件 に お け る 花 成 の 促 進 に 機 能 し て い る こ と を 示 し て い る 。ま た イ ネ に お い て FT を 、 シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ に お い て Hd3a を そ れ ぞ れ 過 剰 発 現 さ せ た と こ ろ 、 ど ち ら の 植 物 体 も 早 咲 き の 表 現 型 を 示 し た（ Kojima et al., 2002）。こ の 結 果 は 、 こ れ ら の 遺 伝 子 の 機 能 が 両 植 物 間 で 高 く 保 存 さ れ て い る こ と を 示 し て お り 、 短 日 、 長 日 両 植 物 に お い て 花 成 を 誘 導 す る 物 質 が 共 通 で あ る こ と を 示 し て い る 。 さ ら に 同 年 に は 早 間 ら に よ り イ ネ を 用 い て 短 日 植 物 と 長 日 植 物 が 示 す 日 長 応 答 性 の 違 い が ど の よ う に 制 御 さ れ て い る の か そ の 分 子 メ カ ニ ズ ム が 明 ら か に さ れ た 。 長 日 条 件 下 で シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ は CO が FT の 発 現 を 正 に 制 御 し て い る が 、 イ ネ に お い て は CO の 相 同 遺 伝 子 Hd1 が 、イ ネ に お け る FT 相 同 遺 伝 子 で あ る Hd3a の 発 現 を 負 に 制 御 し て お り 、 こ の こ と が イ ネ が 長 日 条 件 下 で 花 成 が 抑 制 さ れ る 原 因 で あ る こ と が 示 さ れ た （ Hayama et al., 2003; Yano et al., 2000） （ 図 2A）。 ま た 短 日 植 物 の 光 周 性 応 答 の 現 象 と し て 知 ら れ て い る 光 中

断 処 理 に よ る 開 花 遅 延 の 表 現 型 の 分 子 メ カ ニ ズ ム も 明 ら か に さ れ 、 暗 期 の 中 央 に お け る 光 照 射 に よ り Hd3a の 発 現 が 転 写 の レ ベ ル で 抑 制 さ れ る こ と が 原 因 で あ る こ と も 明 ら か と な っ て い る （ Ishikawa et al., 2005） 。こ の よ う に イ ネ に お い て も 転 写 レ ベ ル で Hd3a の 解 析 が 進 み 、 Hd3a が イ ネ の 花 成 の 分 子 ス イ ッ チ で あ る こ と が 示 さ れ た が Hd3a の 植 物 体 に お け る 器 官 組 織 別 の 詳 細 な 発 現 解 析 や 、 タ ン パ ク 質 レ ベ ル で の 解 析 は 報 告 さ れ て お ら ず 、 Hd3a が ど の よ う に イ ネ の 花 成 を 促 進 し て い る か は 明 ら か と な っ て い な い 。 先 に 述 べ た よ う に 長 日 植 物 で あ る シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ の FT 遺 伝 子 の 解 析 の 結 果 や 他 の 植 物 の FT 様 遺 伝 子 の 解 析 の 結 果 か ら も 、 植 物 に お い て FT 様 遺 伝 子 が フ ロ リ ゲ ン の 実 体 を コ ー ド し て い る 可 能 性 が 高 く な っ て き て お り 、 イ ネ に お い て も FT 様 遺 伝 子 で あ る Hd3a 遺 伝 子 の よ り 詳 細 な 機 能 解 析 を 行 う こ と が 重 要 と な っ て き て い る 。 そ こ で 本 研 究 で は イ ネ に お け る Hd3a の 発 現 調 節 か ら タ ン パ ク 質 の 挙 動 を 含 め た 機 能 解 析 を 行 う こ と で 、 Hd3a 遺 伝 子 が 長 年 謎 と さ れ て き た フ ロ リ ゲ ン の 実 体 を コ ー ド し て い る か ど う か を 検 証 し た 。

材 料 お よ び 方 法

1． 材 料 お よ び 生 育 条 件

1-1 植 物 材 料

イ ネ （ Oryza sativa L.） 農 林 8 号 （ N-8） を 野 生 型 と し て 使 用 し た 。 Hd3a プ ロ モ ー タ ー （ 以 下 Hd3a と 表 記 ）::Hd3a:GFP、Hd3a::GUS、rolC プ ロ モ ー タ ー （ 以 下 rolC と 表 記 ）::Hd3a:GFP、rolC::GFP、 rolC::Kaede、 RPP16 プ ロ モ ー タ ー （ 以 下 RPP16 と 表 記 ）::Hd3a:GFP、RPP16::GFP、 RPP16::Kaede コ ン ス ト ラ ク ト を 導 入 し た 形 質 転 換 体 を 解 析 に 用 い た 。 こ れ ら の コ ン ス ト ラ ク ト の 作 製 に 用 い た プ ラ イ マ ー を 表 2 に 示 し た 。 形 質 転 換 体 に つ い て は 、 農 林 8 号 に 図 3 の コ ン ス ト ラ ク ト を そ れ ぞ れ ア グ ロ バ ク テ リ ウ ム 感 染 法 に よ り 導 入 す る こ と で 得 た （ Hiei et al., 1994）。 1-2. 生 育 条 件 今 回 用 い た 植 物 体 は 実 験 の 目 的 に 応 じ て 、 湿 度 70 %、 明 期 30 ℃ 8 時 間 、 暗 期 25 ℃ 16 時 間 の 短 日 条 件 お よ び 湿 度 70 ％ 、 明 期 30 ℃ 16 時 間 、 暗 期 25 ℃ 8 時 間 に 設 定 し た 人 工 気 象 機 で 生 育 し た 。 光 は 白 色 蛍 光 灯 （ 400 to 700 nm, 100 µmol·m– 2 ·s– 1） を 用 い た 。 T0世 代 の 開 花 は SD 条 件 処 理 開 始 日 か ら 開 花 日 ま で の 日 数 を 計 測 し た 。 開 花 日 は 第 1 頴 果 が 止 葉 の 葉 耳 か ら 観 察 さ れ た 日 と し た 。 ま た 光 中 断 の 処 理 に は Ishikawaら が 行 っ た 光 中 断 の 実 験 と 同 様 の 方 法 を 用 い た（ Ishikawa et al.,

2005）。 1-3. 培 養 細 胞 イ ネ Oc 細 胞 は 100 ml 三 角 フ ラ ス コ に 20 ml の R2S 液 体 培 地 を 入 れ 、 培 養 室 の ロ ー タ リ ー シ ェ ー カ ー （ Innova2300 ; サ イ エ ン テ ィ フ ィ ッ ク ・ サ ー プ ラ ス ） を 用 い て 振 と う 培 養 し 、 一 週 間 毎 に 培 地 を 交 換 し 継 代 し た 。R2S の 組 成 は 、2002 年 玉 置 の 修 士 論 文 に よ っ た（ 玉 置 ，2002）。 2. 方 法 2-1. RNA の 抽 出 植 物 体 か ら の RNA 抽 出 に は GTC 法 （ 玉 置 ， 2002） お よ び RNeasy Plant Mini Kit （ QIAGEN） 、 RNAeasy （ TaKaRa） を 用 い た 。 イ ネ の 葉 身 、 葉 鞘 、 基 部 、 根 、 茎 頂 分 裂 組 織 を そ れ ぞ れ 、 指 定 の 時 間 ご と に 採 取 し 2ml の 凍 結 チ ュ ー ブ に 保 存 し た 。 採 取 し た サ ン プ ル を マ ル チ ビ ー ズ シ ョ ッ カ ー を 用 い て 粉 末 上 に 粉 砕 し 、以 下 そ れ ぞ れ の RNA 抽 出 の 手 法 に 準 じ て RNA を 抽 出 し た 。

cDNA へ の ゲ ノ ム DNA の 混 入 を 防 ぐ た め に 、 DNaseI Amplification Grade （ Invitorogen） を 用 い て DNA を 消 化 し た 。

2-2. RT-PCR

DNaseI処 理 し た ト ー タ ル RNA 1 µgを 用 い て Super ScriptT M

II RNase H−Reverse Transcriptase （ Invitrogen） と Oligo dTプ ラ イ マ ー （ dT21）

を 用 い た 。 2-3. 発 現 解 析 逆 転 写 反 応 に よ っ て 得 ら れ た cDNA を テ ン プ レ ー ト に PCR を 行 っ た 。 用 い た プ ラ イ マ ー セ ッ ト は 表 2 に 示 し た 。 2-4. リ ア ル タ イ ム PCR を 用 い た 遺 伝 子 発 現 解 析 解 析 し た 遺 伝 子 の 発 現 量 を 正 確 に 定 量 比 較 す る た め に リ ア ル タ イ ム PCR に 用 い る プ ラ イ マ ー に よ り 増 幅 さ れ た 各 断 片 を 連 結 し 一 つ の 断 片 に 作 製 し た （ Ubq, Hd3a, GFP） 。 こ の 断 片 を 検 量 線 の テ ン プ レ ー ト と な る プ ラ ス ミ ド に TA ク ロ ー ニ ン グ に よ り サ ブ ク ロ ー ニ ン グ し 、 得 ら れ た プ ラ ス ミ ド を シ ー ク エ ン ス し 、 塩 基 配 列 を チ ェ ッ ク し た 。 こ の ベ ク タ ー を 含 ん だ 溶 液 を 100 pg / µl に 調 整 し 、 そ れ を 基 に 希 釈 系 列 を 作 製 し 、リ ア ル タ イ ム PCR に 検 量 線 作 製 の た め に 用 い た 。リ ア ル タ イ ム PCR に 用 い た プ ラ イ マ ー セ ッ ト は 表 3 に 示 し た 。

リ ア ル タ イ ム PCR の 反 応 は ABI PRISM 7700 （ Applied Biosystem Japan）を 用 い て 行 っ た 。PCR 増 幅 産 物 の 定 量 は SYBR Green Mster Mix （ Applied Biosystem Japan） を 用 い て 行 っ た 。 使 用 方 法 は キ ッ ト に 付 属 の プ ロ ト コ ー ル に 準 じ た 。 逆 転 写 反 応 に よ り 得 ら れ た cDNA を テ ン プ レ ー ト に 解 析 を 行 っ た 。

2-5. 一 過 的 発 現 解 析

ク ト を 図 ４ に 示 す 。 プ ロ ト プ ラ ス ト の 回 収 お よ び エ レ ク ト ロ ポ レ ー シ ョ ン 処 理 、 処 理 後 の 解 析 に 関 し て は 玉 置 の 修 士 論 文 （ 2002） お よ び 神 田 の 修 士 論 文 （ 2004） に 記 し て あ る も の に 準 じ た （ 玉 置 ， 2002； 神 田 ，2004）。コ ン ス ト ラ ク ト の 詳 細 に 関 し て は 玉 置 の 修 士 論 文 （ 2002） お よ び 神 田 の 修 士 論 文 （ 2004） に 記 し て あ る も の に 準 じ た （ 玉 置 ， 2002； 神 田 ， 2004）。 2-6. 組 織 化 学 染 色 Hd3a::GUS コ ン ス ト ラ ク ト を 導 入 し た 植 物 体 を 用 い て 行 っ た 。 手 法 は Moritoh et al.（ 2005） に 記 載 さ れ た 方 法 に 準 じ た パ ラ フ ィ ン 切 片 作 製 の た め 、 染 色 後 脱 水 お よ び 置 換 処 理 を 行 い パ ラ プ ラ ス ト に 包 埋 し ULTRACUT UCT ウ ル ト ラ ミ ク ロ ト ー ム （ Laica）で 10 µm の 切 片 を 作 製 し 、 明 視 野 顕 微 鏡 を 用 い て 観 察 し た （ Moritoh et al., 2005）。 2-7. 蛍 光 観 察 2-7-1. 観 察 試 料 の 準 備 蛍 光 顕 微 鏡 で 観 察 す る 試 料 は 、 す べ て 生 き た 試 料 を 適 切 な 濃 度 の ア ガ ロ ー ス ゲ ル に 包 埋 し 、 ビ ブ ラ ト ー ム を 用 い て 50 µm の 厚 さ の 切 片 を 作 製 し た 。 作 製 し た 切 片 を 乾 燥 し な い よ う に 蒸 留 水 を 加 え プ レ パ ラ ー ト を 作 製 し 観 察 に 用 い た 。 2-7-2 蛍 光 顕 微 鏡

蛍 光 タ ン パ ク 質 （ GFP お よ び Kaede） を 含 ん だ コ ン ス ト ラ ク ト を 導 入 し た 形 質 転 換 体 の 蛍 光 タ ン パ ク 質 の 観 察 の た め に 共 焦 点 レ ー ザ ー 顕 微 鏡 LSM510META を 用 い た 。用 い た レ ン ズ は 、対 物 レ ン ズ x10、x20、 x40、x63w を 用 い た 。488 nm ア ル ゴ ン レ ー ザ ー で 励 起 し 、505 nm-550 nm の 波 長 領 域 を 蛍 光 タ ン パ ク 質 が 発 す る 蛍 光 と し て 取 得 し た 。 ま た 、 白 黒 画 像 の 取 得 も 同 時 に 行 っ た 。 2-8. 植 物 体 か ら の タ ン パ ク 質 抽 出 植 物 体 の 葉 身 300 mg を 液 体 窒 素 で 満 た し た 乳 鉢 で 十 分 に 粉 砕 し 、 1 ml の TE 溶 液 に 移 し 、 十 分 に 縣 濁 し た 後 、 PMSF を 2.5 µl 加 え 、 そ の 後 5000 rpm、 4 ℃ 、 15 分 で 遠 心 し 上 清 を 可 溶 性 画 分 と し た 。 タ ン パ ク 質 の 濃 度 を 測 定 し た の ち 、 ス ト ラ タ ク リ ー ン に よ り 濃 縮 し た 。 濃 縮 処 理 後 、 回 収 し た 可 溶 性 画 分 を SDS-PAGE で 分 離 し PVDF メ ン ブ レ ン に ブ ロ ッ テ ィ ン グ し て ウ エ ス タ ン 解 析 を 行 っ た 。1 次 抗 体 に は 500 倍 に 希 釈 し た 抗 GFP 抗 体（ Roche）を 、二 次 抗 体 に は 5000 倍 に 希 釈 し た 抗 マ ウ ス 抗 体 を 用 い た 。ECLPlus（ GE）を 反 応 さ せ た の ち 、LAS1000 （ FUJI） に よ り 感 光 さ せ 画 像 を 取 得 し た 。

結 果

1. Hd3a の 器 官 組 織 別 発 現 解 析

Hd3a は 10 日 間 短 日 処 理 さ れ た 地 上 部 で 発 現 し て い る（ Kojima et al., 2002）こ と や 、短 日 条 件 下 の 葉 身 で 発 現 し て い る（ Ishikawa et al., 2005） こ と が 示 さ れ て い る が 、 イ ネ の 植 物 体 に お け る 器 官 組 織 別 の 詳 細 な 発 現 部 位 の 解 析 は 行 わ れ て い な い 。 そ こ で 、 Hd3a の 詳 細 な 組 織 別 の 発 現 解 析 を 行 っ た 。植 物 体 は 農 林 8 号 を 用 い 播 種 後 30 日 間 長 日 条 件 で 育 成 し た 後 、 短 日 条 件 で 10 日 間 処 理 し 明 期 開 始 時 を ZT0 と し て ZT0-4 の 間 に サ ン プ リ ン グ を 行 っ た （ 図 5A）。 サ ン プ リ ン グ を 行 っ た 器 官 組 織 は 、 葉 身 、 葉 鞘 、 基 部 、 茎 頂 分 裂 組 織 、 根 で あ る 。 こ れ ら の サ ン プ ル か ら RNA を 抽 出 し Hd3a mRNA を リ ア ル タ イ ム RT-PCR を 用 い て 検 出 し た 。そ の 結 果 、Hd3a mRNA は 葉 身 で 高 い 発 現 量 を 示 し 、葉 鞘 に お い て も 発 現 が 検 出 さ れ た 。 そ の 他 の 部 位 特 に 茎 頂 分 裂 組 織 で は ほ と ん ど 検 出 さ れ な か っ た（ 図 5B, C）。今 回 得 ら れ た こ の 結 果 は Hd3a mRNA の 発 現 部 位 が 長 日 条 件 下 の シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ の FT mRNA の 発 現 パ タ ー ン の 報 告 と 同 じ く 葉 特 異 的 で あ り（ Wigge et al., 2005） 、Hd3a は FT と 機 能 だ け で な く 植 物 体 に お け る 発 現 部 位 も ま た 高 く 保 存 さ れ て い る 可 能 性 が 高 い こ と を 示 し て い る 。 こ の こ と は 短 日 植 物 、 長 日 植 物 の 違 い だ け で な く 、 単 子 葉 植 物 、 双 子 葉 植 物 と い う 違 い を 超 え て 、 FT 様 遺 伝 子 の 発 現 部 位 や そ の 機 能 が イ ネ と シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ の 間 で 高 く 保 存 さ れ て い る こ と を 示 し て い る 。 Hd3a の 過 剰 発 現 体 が 早 咲 き 表 現 型 を 示 す こ と や 、 光 中 断 に よ る

Hd3a の 転 写 抑 制 が 開 花 の 遅 延 を 引 き 起 こ す こ と か ら 、 野 生 型 の 葉 に お い て の み 発 現 す る Hd3a の 発 現 が イ ネ の 開 花 に 影 響 を 与 え て い る 要 素 の 一 つ で あ る 可 能 性 が 非 常 に 高 い（ Ishikawa et al., 2005; Kojima et al., 2002） 。こ の こ と は 、葉 身 で の み 発 現 す る Hd3a の 転 写 も し く は 翻 訳 産 物 が 何 ら か の 形 で 茎 頂 分 裂 組 織 へ と シ グ ナ ル と し て 伝 わ っ て 花 成 を 誘 導 し て 可 能 性 が あ る こ と を 示 し て い る 。 今 回 の 解 析 で は イ ネ Hd3a mRNA の 蓄 積 が ピ ー ク と な る 明 期 開 始 時 か ら 4 時 間 に わ た っ て サ ン プ リ ン グ し た に も か か わ ら ず 、 葉 以 外 で は Hd3a mRNA が 検 出 さ れ な か っ た （ 図 5）。 2. 一 過 的 発 現 解 析 よ り 詳 細 な 発 現 部 位 の 解 析 の た め に Hd3a::GUS コ ン ス ト ラ ク ト を 導 入 し た 形 質 転 換 体 の 作 出 を 目 指 し た 。 そ こ で 、 ま ず 今 回 の 解 析 に 用 い る Hd3a の プ ロ モ ー タ ー 領 域 が 、 内 在 Hd3a 遺 伝 子 と 同 様 の 制 御 を 受 け る か ど う か を 確 認 す る た め に 、 イ ネ Oc 細 胞 を 利 用 し た 一 過 的 発 現 解 析 を 行 っ た 。Hd3a は シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ 花 成 促 進 遺 伝 子 FT の イ ネ に お け る 相 同 遺 伝 子 で あ り 、Hd1 は CO の イ ネ に お け る 相 同 遺 伝 子 で あ る （ Kojima et al., 2002; Yano et al., 2000） 。イ ネ に お い て は 、OsGI の 過 剰 発 現 体 に お い て Hd1 mRNA の 発 現 量 上 昇 お よ び Hd3a mRNA の 発 現 量 低 下 が 見 ら れ 、 短 日 条 件 に お い て も 花 成 の 遅 延 が 観 察 さ れ て い る （ Hayama et al., 2003） 。 こ の こ と は 、 シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ に お い て 観 察 さ れ る GI 過 剰 発 現 体 と は 逆 の 表 現 型 で あ る （ Fowler et al., 1999） 。 シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ に お い て GI 過 剰 発 現 体 が 早 咲 き 表 現 型 を 示 す 主 な 原

因 は CO mRNA の 発 現 量 が 増 加 す る こ と が 原 因 で あ る こ と が 明 ら か に さ れ て い る が 、 OsGI 過 剰 発 現 体 に お い て Hd1 の 発 現 量 が 上 昇 し て い る こ と か ら 、イ ネ に お い て は Hd1 が Hd3a の 発 現 を 負 に 制 御 し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ る 。実 際 、Hd1 の 機 能 欠 質 株 は 自 然 日 長 条 件 下 に お い て 花 成 が 促 進 さ れ る こ と か ら も 、Hd1 が 花 成 に お い て 抑 制 的 に 働 く 機 能 を 持 つ こ と が 考 え ら れ る（ Yano et al., 2000）。以 上 の よ う に 、過 剰 発 現 体 お よ び 欠 失 変 異 体 の 解 析 の 結 果 か ら 遺 伝 学 的 に Hd1 に よ る Hd3a の 発 現 制 御 の 機 構 が あ る こ と が 示 さ れ て い る の で 、 イ ネ の プ ロ ト プ ラ ス ト を 用 い て 一 過 的 発 現 解 析 を 行 う こ と で 、Hd1 の 転 写 翻 訳 産 物 に よ る Hd3a の プ ロ モ ー タ ー を 介 し た 転 写 制 御 の 観 察 お よ び そ の 制 御 は 正 負 ど ち ら に な る か を 明 ら か に で き る と 考 え た 。 実 験 に は 、Hd3a プ ロ モ ー タ ー の 下 流 に GUS を 連 結 し た コ ン ス ト ラ ク ト （ 以 下 Hd3a::GUS-t と 記 す ） お よ び 、 35S プ ロ モ ー タ ー の 下 流 に 同 じ く GUS を 連 結 し た コ ン ス ト ラ ク ト（ 以 下 35S::GUS と 記 す ）を レ ポ ー タ ー と し て 用 い 、イ ネ Ubq プ ロ モ ー タ ー の 下 流 に Hd1 cDNA を 連 結 し た コ ン ス ト ラ ク ト （ 以 下 Ubq::Hd1 と 記 す ） お よ び ビ ア ラ ホ ス 耐 性 遺 伝 子 （ Bar.） を つ な げ た コ ン ス ト ラ ク ト （ 以 下 Ubq::Bar と 記 す ） を エ フ ェ ク タ ー と し て 用 い た 。 こ れ ら の コ ン ス ト ラ ク ト を イ ネ Oc 細 胞 由 来 の プ ロ ト プ ラ ス ト に エ レ ク ト ロ ポ レ ー シ ョ ン 法 に よ り 導 入 し 、 一 過 的 発 現 解 析 を 行 っ た 。 な お 内 在 の コ ン ト ロ ー ル と し て 全 て の 処 理 区 に Ubq::Luc コ ン ス ト ラ ク ト を 同 時 に 処 理 し た 。 レ ポ ー タ ー に 35S::GUS を 用 い た 場 合 Ubq::Hd1、Ubq::Bar ど ち ら を エ フ ェ ク タ ー に 用 い た 処 理 区 に お い て も 、GUS 活 性 に 有 意 差 は 見 ら れ

な か っ た（ 図 6A）。一 方 レ ポ ー タ ー に Hd3a::GUS-t を 用 い た 場 合 で は 、 エ フ ェ ク タ ー に Ubq::Bar を 用 い た 処 理 区 に く ら べ Ubq::Hd1 を エ フ ェ ク タ ー に 用 い た 処 理 区 で 、GUS 活 性 が 約 1/3 程 度 低 下 し て い た（ 図 6B）。 今 回 の 解 析 の 結 果 得 ら れ た 結 果 は 、 Hd1 cDNA の プ ロ ト プ ラ ス ト 内 に お け る 転 写 産 物 も し く は 翻 訳 産 物 が 何 ら か の 形 で Hd3a プ ロ モ ー タ ー に 特 異 的 に 作 用 し 、 そ の 活 性 を 低 下 さ せ た た め に 生 じ た 可 能 性 が 高 い こ と を 示 し て い る 。 レ ポ ー タ ー に 35S プ ロ モ ー タ ー を 用 い た 場 合 は 、 有 意 な 差 が 観 察 さ れ な か っ た こ と か ら も 、 Hd1 に よ る Hd3a の 特 異 的 な 制 御 の 存 在 が 示 唆 さ れ る 。 ま た こ の プ ロ ト プ ラ ス ト を 用 い て 示 さ れ た 結 果 は 、OsGI 過 剰 発 現 体 で 観 察 さ れ る Hd3a mRNA の 発 現 量 の 低 下 が 、 Hd1 の 発 現 量 が 上 昇 す る こ と に よ り 、 Hd3a の 転 写 量 が 抑 制 さ れ た こ と が 原 因 で あ る 可 能 性 が 高 い こ と を 示 し て い る （ Hayama et al., 2003）。 3. 組 織 化 学 染 色 Hd3a の 発 現 部 位 を 確 認 す る た め に 一 過 的 発 現 解 析 で 用 い た も の と 同 一 の Hd3a プ ロ モ ー タ ー を 用 い 、そ の 下 流 に GUS 遺 伝 子 を つ な げ た 形 質 転 換 用 コ ン ス ト ラ ク ト（ 以 下 Hd3a::GUS と 記 す ）を 作 製 し 、そ れ を 導 入 し た 形 質 転 換 体 植 物 を 作 製 し 以 後 の 解 析 に 用 い た 。

ま ず 、 導 入 し た Hd3a::GUS の GUS 遺 伝 子 が Hd3a プ ロ モ ー タ ー の 制 御 下 に あ る か を 確 認 す る た め に 、 短 日 、 長 日 、 光 中 断 の そ れ ぞ れ の 条 件 下 で の 形 質 転 換 体 の 内 在 の Hd3a mRNA の 発 現 の 日 周 変 動 お よ び GUS 遺 伝 子 の 発 現 の 日 周 変 動 を 確 認 し た 。 そ の 結 果 、 Hd3a プ ロ モ ー

タ ー の 下 流 に 連 結 さ れ た GUS 遺 伝 子 は ど の 日 長 条 件 下 に お い て も 内 在 の Hd3a mRNA の 発 現 パ タ ー ン と ほ ぼ 同 様 の 発 現 パ タ ー ン を 示 し た （ 図 7, 8）。 特 に 内 在 の Hd3a mRNA の 発 現 は 連 続 短 日 条 件 下 で 育 成 し た 後 、 暗 期 に 一 度 の 光 中 断 の 処 理 を し た 翌 日 の 明 期 開 始 時 に お い て そ の 発 現 の 抑 制 が 観 察 さ れ る が 、 今 回 解 析 に 用 い た Hd3a::GUS の GUS 遺 伝 子 の 発 現 に お い て も 同 様 の 結 果 が 得 ら れ た（ Ishikawa et al., 2005）。 Hd3a::GUS 形 質 転 換 体 の 短 日 条 件 下 に お け る 開 花 日 を 評 価 し た と こ ろ 、 野 生 型 と ほ ぼ 同 じ 日 数 を 開 花 ま で に 要 し た （ data not shown）。 こ れ ら の 植 物 体 を 用 い て X-Gluc に よ る 組 織 化 学 染 色 行 っ た 。そ の 結 果 GUS 遺 伝 子 は 維 管 束 で 発 現 し て い る 結 果 が 得 ら れ た（ 図 9）。こ の 結 果 は シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ の FT 遺 伝 子 の プ ロ モ ー タ ー 解 析 の 結 果 と 同 じ で あ る （ Takada and Goto, 2003）。 一 方 茎 頂 分 裂 組 織 お よ び そ の 周 辺 に お い て は 、 Hd3a mRNA の 結 果 と 同 様 組 織 化 学 染 色 に よ っ て GUS 遺 伝 子 の 発 現 を 確 認 す る こ と が で き な か っ た（ 図 9）。こ の 結 果 も ま た シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ の FT 遺 伝 子 の プ ロ モ ー タ ー 解 析 の 結 果 と 同 じ で あ る （ Takada and Goto, 2003）。こ れ ら の こ と か ら 、Hd3a mRNA の 発 現 は 葉 特 異 的 で あ る 可 能 性 が 高 い 事 が 強 く 示 唆 さ れ る （ 図 5B, C）。 イ ネ の 葉 身 の 維 管 束 に お い て GUS 遺 伝 子 が 発 現 し て い る 領 域 を さ ら に 詳 し く 観 察 す る と GUS 遺 伝 子 が 篩 部 柔 組 織 に 特 異 的 に 発 現 し て い る と 思 わ れ る 結 果 が 示 さ れ た 。 こ の 組 織 は 篩 管 と 密 に 連 絡 し て い る と 言 わ れ て い る こ と か ら Hd3a の 転 写 産 物 も し く は 翻 訳 産 物 も ま た 篩 管 を 通 じ て 茎 頂 分 裂 組 織 を 始 め さ ま ざ ま な と こ ろ に 運 ば れ て い る 可 能 性 は 高 い と 考 え ら れ る 。

4. Hd3a:GFP タ ン パ ク 質 の 機 能 解 析 4-1 Hd3a::Hd3a:GFP 形 質 転 換 体 の 解 析 Hd3a タ ン パ ク 質 の 植 物 内 で の 機 能 を 確 認 す る た め に Hd3a タ ン パ ク 質 の C 末 端 に GFP タ ン パ ク 質 を つ な げ た キ メ ラ タ ン パ ク 質 を 、Hd3a プ ロ モ ー タ ー の 下 流 に つ な げ た コ ン ス ト ラ ク ト（ 以 下 Hd3a::Hd3a:GFP と 記 す ） を 作 製 し た 。 こ の コ ン ス ト ラ ク ト を 導 入 し た 形 質 転 換 体 を 作 製 し 以 後 の 解 析 に 用 い た 。す で に 2003 年 の 松 尾 に よ り Hd3a タ ン パ ク 質 の N 末 端 に GFP タ ン パ ク 質 を つ な げ た コ ン ス ト ラ ク ト を 植 物 体 に 導 入 し た 場 合 そ の 機 能 が 観 察 さ れ な い こ と が 示 さ れ て お り 、 本 解 析 で は Hd3a:GFP の み を 解 析 に 用 い た （ 松 尾 , 2003）。

ま ず 、 先 ほ ど の GUS 実 験 と 同 様 に Hd3a:GFP が Hd3a プ ロ モ ー タ ー の 制 御 下 に あ る か ど う か を 確 認 す る た め に 短 日 条 件 に お け る Hd3a:GFP の 発 現 の 日 週 変 動 お よ び 内 在 の Hd3a mRNA の 発 現 を 確 認 し た 。そ の 結 果 Hd3a:GFP お よ び Hd3a ど ち ら の mRNA と も に ほ ぼ 同 様 の 発 現 パ タ ー ン が 得 ら れ た （ 図 10）。 こ の 形 質 転 換 体 の 短 日 条 件 に お け る 開 花 日 を 評 価 し た と こ ろ 、 同 様 に 育 成 し た WT に 比 べ て 約 10 日 ほ ど 早 咲 き を 示 し た（ 図 11）。こ の こ と は 、 導 入 し た コ ン ス ト ラ ク ト が 機 能 的 で あ る こ と を 示 し て い る 。 し か し 、 以 前 報 告 さ れ た 35S::Hd3a が 示 す 開 花 の 表 現 型 よ り も 開 花 日 が 遅 く な っ て い る （ Kojima et al., 2002） が 、 こ れ は、35S プ ロ モ ー タ ー と Hd3a プ ロ モ ー タ ー の プ ロ モ ー タ ー 活 性 の 違 い お よ び 今 回 の 解 析 で は Hd3a の C 末 端 側 に GFP タ ン パ ク 質 を 融 合 さ せ た た め だ と 思 わ れ る 。ま た 形 質 転 換 体 の す べ て の 系 統 に お い て 矮 性 の 表 現 型 を 示 し た が 、

こ れ は FT の 過 剰 発 現 体 お よ び Hd3a の 過 剰 発 現 体 に お い て 観 察 さ れ た 結 果 と 同 じ で あ る と 考 え ら れ る （ Kardailsky et al., 1999; Kobayashi et al., 1999; Kojima et al., 2002）。

い く つ か の 系 統 に よ っ て は 節 間 の 伸 長 、 分 げ つ 数 の 増 加 と い っ た 表 現 型 を 示 し た 。 分 げ つ 数 が 増 加 し 植 物 体 の 草 型 が 野 生 型 と 比 べ て 変 化 す る 表 現 型 は 、ト マ ト の SFT の 過 剰 発 現 体 に お い て も 観 察 さ れ て い る こ と か ら （ Lifschitz and Eshed, 2006; Lifschitz et al., 2006）、 FT 様 遺 伝 子 群 の 植 物 体 に お け る 機 能 は 開 花 の 促 進 だ け で な い こ と を 示 唆 し て い る（ Teper-Bamnolker and Samach, 2005）。ま た 観 察 さ れ た 穂 に お い て は 、 一 次 枝 梗 の み が 観 察 さ れ 二 次 枝 梗 は ほ ぼ す べ て の 形 質 転 換 体 の 系 統 で 観 察 さ れ な か っ た（ 図 11A）。こ の 表 現 型 は 、FT の 過 剰 発 現 体 が terminal flower の 表 現 型 を 示 す こ と と 同 様 の 結 果 で あ る と 考 え ら れ る （ Kardailsky et al., 1999; Kobayashi et al., 1999）。

次 に こ の 形 質 転 換 体 を 用 い て Hd3a:GFP タ ン パ ク 質 の 植 物 内 で の 局 在 を 解 析 し た 。 ま ず 茎 頂 分 裂 組 織 に Hd3a:GFP タ ン パ ク 質 が 局 在 す る か ど う か を 確 認 す る た め に 、茎 頂 分 裂 組 織 を 含 ん だ 縦 断 切 片 を 作 製 し 、 共 焦 点 レ ー ザ ー 顕 微 鏡 で Hd3a:GFP タ ン パ ク 質 の 蛍 光 を 観 察 し た 。 そ の 結 果 、Hd3a:GFP タ ン パ ク 質 は 茎 頂 分 裂 組 織 に お い て 観 察 さ れ た（ 図 12）。 ま た Hd3a:GFP タ ン パ ク 質 は 茎 頂 分 裂 組 織 だ け で な く 、 そ の 直 下 に 位 置 す る 節 お よ び 節 間 と 呼 ば れ る 組 織 に お い て も 観 察 さ れ た （ 図 12A-D）。次 に 植 物 組 織 内 に お け る Hd3a:GFP タ ン パ ク 質 の 細 胞 内 局 在 を 観 察 し た と こ ろ 、 茎 頂 分 裂 組 織 周 辺 に お い て は 主 に 核 に 局 在 し て お り 、 維 管 束 組 織 に お い て は 、 細 胞 質 と 核 に 局 在 し て い る 結 果 が 観 察 さ

れ た （ 図 13）。 2003 年 の 松 尾 の 報 告 に も Hd3a:GFP タ ン パ ク 質 の 細 胞 内 局 在 が 細 胞 質 と 核 で あ る こ と が イ ネ プ ロ ト プ ラ ス ト を 用 い た 解 析 の 結 果 か ら 報 告 さ れ て い る 。 さ ら に Hd3a:GFP タ ン パ ク 質 の 局 在 を 茎 頂 分 裂 組 織 近 傍 の 維 管 束 か ら 観 察 す る と Hd3a:GFP タ ン パ ク 質 の 蛍 光 は 茎 頂 分 裂 組 織 近 傍 の 維 管 束 か ら 茎 頂 分 裂 組 織 へ と 向 か っ て 途 切 れ る こ と な く 連 続 し た 形 で 観 察 さ れ た （ 図 12G, H）。 こ の こ と は Hd3a:GFP タ ン パ ク 質 が 茎 頂 分 裂 組 織 近 傍 の 維 管 束 か ら 積 み 下 ろ さ れ た 後 、 な ん ら か の 制 御 を 受 け な が ら 茎 頂 分 裂 組 織 へ と 向 か っ て 運 ば れ て い る 可 能 性 が 高 い 事 を 示 し て い る 。 こ の 茎 頂 分 裂 組 織 へ の 移 行 に 関 し て は ど の よ う な 経 路 で 通 っ て 移 行 し て い る の か 、 移 行 の た め に 必 要 と な る Hd3a タ ン パ ク 質 と 相 互 作 用 す る 因 子 の 探 索 と い っ た 未 知 の 部 分 が 数 多 く 残 っ て お り 今 後 の 課 題 で あ る 。 4-2 維 管 束 特 異 的 プ ロ モ ー タ ー を 用 い た 形 質 転 換 体 の 解 析 Hd3a が 維 管 束 で 発 現 し て い る こ と が Hd3a::GUS 植 物 体 の 解 析 の 結 果 示 さ れ た の で 、rolC お よ び RPP16 と い っ た 維 管 束 特 異 的 な プ ロ モ ー タ ー の 下 流 に Hd3a:GFP、GFP、Kaede と い っ た 蛍 光 タ ン パ ク 質 を つ な げ た コ ン ス ト ラ ク ト を 導 入 し た 形 質 転 換 体 を 用 い て さ ら に 解 析 を 行 っ た 。rolC プ ロ モ ー タ ー は 維 管 束 特 異 的 な 活 性 を 持 つ こ と が す で に 明 ら か と な っ て い る が 、 イ ネ に お い て も 同 様 に 特 異 的 な 活 性 を 示 す か を 確 認 し た （ Guivarc'H et al., 1996; An et al., 2004）。 ま た RPP16 プ ロ モ ー タ ー は イ ネ を 用 い た 解 析 結 果 が す で に 報 告 さ れ て い る が 、 茎 頂 分 裂 組

織 に お け る 報 告 は 無 い た め 、 今 回 の 解 析 を 行 う 前 に そ の プ ロ モ ー タ ー 活 性 を 確 認 し た （ Asano et al., 2002）。 Kaede タ ン パ ク 質 は 、 近 年 使 用 が 報 告 さ れ 始 め た 光 変 換 の 性 質 を 持 つ タ ン パ ク 質 で あ る が 、 そ の 分 子 量 は 生 体 内 で 四 量 体 を 形 成 す る た め 非 常 に 大 き く そ の 分 子 量 は 116kDa と な る （ Ando et al., 2002; Arimura et al., 2004）。 こ の Kaede タ ン パ ク 質 を そ れ ぞ れ 、 rolC お よ び RPP16 プ ロ モ ー タ ー の 下 流 に つ な げ た コ ン ス ト ラ ク ト を 作 製 し 、 そ れ を 導 入 し た 形 質 転 換 体 （ 以 下 rolC::Kaede 、 RPP16::Kaede と 記 す ） を 用 い て 解 析 を 行 っ た 。 維 管 束 組 織 に お け る 蛍 光 を 観 察 し た と こ ろ ど ち ら の 植 物 体 も Kaede タ ン パ ク 質 の 蛍 光 が 観 察 さ れ た （ 図 17I-J， 18I-J）。 一 方 、 茎 頂 分 裂 組 織 に お い て 蛍 光 を 観 察 し た と こ ろ 、 Kaede タ ン パ ク 質 の 蛍 光 は 観 察 さ れ な か っ た（ 図 17G, H，18G, H）。こ の こ と は 今 回 解 析 に 用 い た 両 プ ロ モ ー タ ー が 茎 頂 分 裂 組 織 で は 活 性 を 持 っ て い な い こ と を 示 し て い る 。 次 に 、 こ れ ら 両 プ ロ モ ー タ ー の 下 流 に Hd3a:GFP お よ び GFP を つ な げ た コ ン ス ト ラ ク ト を 作 製 し （ 以 下 rolC::Hd3a:GFP 、 rolC::GFP 、 RPP16::Hd3a:GFP、 RPP16::GFP と 記 す ）、 こ れ ら の コ ン ス ト ラ ク ト を 導 入 し た 形 質 転 換 体 を 作 製 し 以 後 の 解 析 に 用 い た 。 ま ず 、 こ れ ら の 形 質 転 換 体 の 短 日 条 件 に お け る 開 花 日 を 計 測 し た と こ ろ 、 Hd3a:GFP を 導 入 し た 植 物 体 に お い て の み 早 咲 き の 表 現 型 が 観 察 さ れ た （ 図 14， 15）。 こ の こ と は 、 こ れ ら の 形 質 転 換 体 に お い て も Hd3a:GFP が Hd3a::Hd3a:GFP 形 質 転 換 体 同 様 、 機 能 的 で あ る こ と を 示 し て い る 。 ま た GFP の み を 導 入 し た 植 物 体 に お い て は 出 穂 日 に 影 響 は 無 か っ た （ 図 14， 15）。

次 に こ れ ら の 形 質 転 換 体 に お い て Hd3a:GFP タ ン パ ク 質 を ウ エ ス タ ン 解 析 で 検 出 し た 。 rolC::Hd3a:GFP お よ び rolC::GFP、 野 生 型 の 葉 身 か ら そ れ ぞ れ タ ン パ ク 質 を 抽 出 し て 抗 GFP 抗 体 を 用 い て 検 出 し た と こ ろ 、rolC::Hd3a:GFP の 抽 出 液 を 泳 動 し た レ ー ン で は Hd3a:GFP の 推 測 さ れ る 分 子 量 で あ る 47kDa 付 近 に 、 rolC::GFP の 抽 出 液 を 流 し た レ ー ン で は GFP の 推 測 さ れ る 分 子 量 で あ る 26kDa 付 近 に シ グ ナ ル が 検 出 さ れ 、 WT か ら の 抽 出 液 を 流 し た レ ー ン で は シ グ ナ ル は 検 出 さ れ な か っ た （ 図 16）。 rolC::Hd3a:GFP 形 質 転 換 体 の 葉 身 の 横 断 切 片 を 共 焦 点 レ ー ザ ー 顕 微 鏡 で 観 察 し た と こ ろ 、 大 維 管 束 の 篩 部 周 辺 に お い て Hd3a:GFP タ ン パ ク 質 の 蛍 光 が 観 察 さ れ た 。 こ れ ら の こ と か ら 、 rolC::Hd3a:GFP に お い て 観 察 さ れ る GFP 蛍 光 は Hd3a:GFP タ ン パ ク 質 に よ る も の だ と 考 え ら れ る （ 図 17A, B ）。 さ ら に こ の 結 果 か ら RPP16::Hd3a:GFP、Hd3a::Hd3a:GFP に お い て も 同 様 の こ と が 言 え る と 考 え ら れ 、実 際 RPP16::Hd3a:GFP に お い て は 葉 身 横 断 切 片 の 維 管 束 に お い て Hd3a:GFP タ ン パ ク 質 の 蛍 光 が 観 察 さ れ て い る （ 図 18A, B）。 rolC::Hd3a:GFP お よ び RPP16::Hd3a:GFP の 植 物 体 の 茎 頂 分 裂 組 組 織 を 含 む 形 で 縦 断 切 片 を 作 製 し 、 こ れ ら の 切 片 に お け る Hd3a:GFP タ ン パ ク 質 の 局 在 を 観 察 し た 。 そ の 結 果 、 rolC::Hd3a:GFP お よ び RPP16:: Hd3a:GFP と も に 茎 頂 分 裂 組 織 に お い て Hd3a:GFP タ ン パ ク 質 の 蛍 光 が 観 察 さ れ た （ 図 17C-F， 18C-F）。 こ の 結 果 か ら 、 異 な る 3 種 類 の 維 管 束 特 異 的 な プ ロ モ ー タ ー を 用 い て 行 っ た 解 析 で Hd3a:GFP タ ン パ ク 質 の 蛍 光 が 茎 頂 分 裂 組 織 に お い て 観 察 さ れ た こ と と な り 、 Hd3a:GFP タ ン パ ク 質 が 発 現 部 位 で あ る 維 管 束 か ら 茎 頂 分 裂 組 織 へ と 移 動 し て い

る 可 能 性 が 高 い こ と が 示 さ れ た 。 ま た rolC::Hd3a:GFP お よ び RPP16::Hd3a:GFP 形 質 転 換 体 に お い て も ま た Hd3a::Hd3a:GFP 同 様 、 節 間 の 伸 長 お よ び 分 げ つ 数 の 増 加 と い っ た 表 現 型 が 観 察 さ れ た （ 図 15）。 こ れ ら の 結 果 か ら も 異 な る 3 種 類 の プ ロ モ ー タ ー を 用 い て 同 様 の 結 果 が 得 ら れ た こ と か ら、Hd3a:GFP を 導 入 し た 影 響 に よ る 可 能 性 が 高 い こ と を 示 し て い る と 考 え ら れ る 。

考 察

本 研 究 は 、 イ ネ の 開 花 遺 伝 子 で あ る Hd3a の 発 現 調 節 か ら 転 写 さ れ た mRNA お よ び Hd3a タ ン パ ク 質 の 植 物 体 に お け る 挙 動 を 解 析 す る こ と で 、 ど の よ う に Hd3a が イ ネ の 花 成 を 誘 導 し て い る の か を 明 ら か に す る こ と を 目 的 と し た 。 今 回 の 一 連 の 研 究 を 通 じ て 得 ら れ た 結 果 か ら Hd3a 遺 伝 子 が コ ー ド し て い る タ ン パ ク 質 こ そ が 長 年 に わ た り 謎 と さ れ て き た フ ロ リ ゲ ン の 実 体 で あ る 可 能 性 が 非 常 に 高 い こ と が 示 さ れ た 。 1. 器 官 組 織 別 発 現 解 析 イ ネ に お い て Hd3a mRNA の 発 現 す る 器 官 組 織 を 詳 細 に 解 析 す る た め に 、 組 織 別 の 発 現 解 析 を リ ア ル タ イ ム PCR と Hd3a::GUS コ ン ス ト ラ ク ト を 導 入 し た 形 質 転 換 体 を 用 い て 解 析 を 行 っ た 。解 析 の 結 果 Hd3a mRNA は 葉 の み で 検 出 さ れ 、 茎 頂 分 裂 組 織 に お い て は ほ と ん ど 検 出 さ れ な か っ た （ 図 5B, C）。 プ ロ モ ー タ ー 活 性 も ま た 茎 頂 分 裂 組 織 お よ び そ の 周 辺 で は ま っ た く 観 察 さ れ な か っ た 事 か ら 、Hd3a mRNA が 茎 頂 分 裂 組 織 に お い て 存 在 し て い る 可 能 性 は 非 常 に 低 い と 思 わ れ る（ 図 5B, C， 9C）。こ の 結 果 と 同 じ 結 果 が シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ に お い て も 示 さ れ て お り 、 両 植 物 に お い て FT 様 遺 伝 子 の 機 能 だ け で な く 発 現 部 位 も 高 く 保 存 さ れ て い る 可 能 性 が 高 い こ と を 示 し て い る （ Wigge et al., 2005） 。 2005 年 に Ishikawa ら は 短 日 条 件 に 置 か れ た イ ネ が 光 中 断 処 理 に よ り Hd3a の 転 写 が 抑 制 さ れ 、 そ れ に よ り 花 成 が 遅 延 す る 現 象 を 報 告 し た 。 こ の

結 果 と 今 回 の 器 官 組 織 別 発 現 解 析 の 結 果 を 照 ら し 合 わ せ る と 、 光 中 断 処 理 に よ る Hd3a の 発 現 抑 制 が 原 因 で あ る 花 成 遅 延 の 現 象 は 、 葉 に お け る Hd3a の 発 現 が 光 中 断 に よ り 抑 制 さ れ た 結 果 引 き 起 こ さ れ て い る こ と を 示 し て い る 。こ の こ と は 、Knott に よ り 示 さ れ た 植 物 が 葉 に お い て 日 長 条 件 を 知 覚 す る こ と で 花 成 を 制 御 し て い る 結 果 と 一 致 す る 。 さ ら に イ ネ に お い て も 他 の 植 物 同 様 、 葉 で の Hd3a の 発 現 が シ グ ナ ル と し て 茎 頂 分 裂 組 織 へ と 伝 わ り 花 成 を 引 き 起 こ し て い る こ と を 示 し て い る 。こ れ ま で 提 唱 さ れ て き た フ ロ リ ゲ ン の 概 念 と 一 致 す る も の で あ り 、 イ ネ に お い て も ま た FT 様 遺 伝 子 群 が フ ロ リ ゲ ン で あ る 可 能 性 が 高 い こ と を 示 し て い る （ Chailakhyan, 1936）。 イ ネ に お け る FT 様 遺 伝 子 群 は 、現 在 ま で に 11 個 イ ネ の ゲ ノ ム 中 に 存 在 し て い る こ と が 明 ら か と な っ て お り 、そ の う ち 解 析 が 行 わ れ て い る も の は 、Hd3a 、RFT 、FTL の 三 種 類 の み で あ る （ Izawa et al., 2002; Kojima et al., 2002; Ishikawa et al., 2005; Tamaki et al., 2007）。こ の 三 種 類 の FT 様 遺 伝 子 の う ち 小 宮 ら は Hd3a お よ び RFT を RNAi 法 で 発 現 を 抑 制 し た 発 現 抑 制 個 体 を 用 い て 解 析 を 行 っ た 。短 日 条 件 に お い て Hd3a RNAi 個 体 は 開 花 が 遅 延 し 、 Hd3a お よ び RFT の 両 方 を RNAi で 発 現 を 抑 制 し た 形 質 転 換 体 で は 、 短 日 条 件 で 300 日 以 上 経 過 し て も 開 花 し な か っ た（ 小 宮 ，私 信 ）。こ の こ と は 、 イ ネ に お い て 短 日 条 件 で 花 成 が 誘 導 さ れ る た め に は Hd3a お よ び RFT が 必 須 で あ る こ と を 示 し て い る 。こ れ ら の こ と か ら も 、イ ネ に お い て FT 様 遺 伝 子 群 が フ ロ リ ゲ ン の 役 割 を 果 た し て い る 可 能 性 が 高 い こ と を 示 し て い る 。 シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ に お い て FT 遺 伝 子 は 茎 頂 分 裂 組 織 に お い て FD 遺 伝 子 と タ ン パ ク 質 相 互 作 用 し AP1 遺 伝 子 の 発

現 を 誘 導 し て い る こ と か ら Hd3a 遺 伝 子 も 同 様 な 機 構 で イ ネ の 花 成 を 促 進 し て い る 可 能 性 は 高 い と 考 え ら れ る 。 今 回 の 解 析 の 結 果 は Hd3a mRNA が 茎 頂 分 裂 組 織 へ と 運 ば れ て 花 成 促 進 に 貢 献 し て い る 可 能 性 は 非 常 に 低 い こ と を 示 唆 し て い る 。 2. 一 過 的 発 現 解 析 イ ネ Oc 細 胞 由 来 の プ ロ ト プ ラ ス ト を 用 い て 一 過 的 発 現 解 析 を 行 い Hd1 に よ る Hd3a の 転 写 制 御 の 解 析 を 行 っ た 。そ の 結 果 、Hd1 を 同 時 に 処 理 し た 場 合 の み 、 Hd3a プ ロ モ ー タ ー の 転 写 活 性 能 が 抑 制 さ れ た （ 図 6B）。 こ の こ と は 、 Hd1 タ ン パ ク 質 が 細 胞 内 で Hd3a プ ロ モ ー タ ー の 転 写 活 性 を 何 ら か の 形 で 抑 制 す る 機 能 を 持 つ こ と を 示 し て い る 。 CO 遺 伝 子 は 転 写 因 子 と し て FT 遺 伝 子 の 発 現 を 制 御 し て い る と 考 え ら れ て い る が 、イ ネ に お け る Hd1 も ま た 転 写 因 子 と し て 働 い て い る と 考 え ら れ る 。実 際 、Hd1 タ ン パ ク 質 の 細 胞 内 の 局 在 を N 末 端 C 末 端 そ れ ぞ れ に GFP タ ン パ ク 質 を つ な げ た コ ン ス ト ラ ク ト を 作 製 し 、 イ ネ プ ロ ト プ ラ ス ト 内 で の 局 在 を 確 認 し た と こ ろ GFP:Hd1、 Hd1:GFP と も に 蛍 光 が 核 で 観 察 さ れ る こ と か ら 、 Hd1 も ま た 核 に 局 在 し 転 写 因 子 の 一 部 と し て 機 能 し て い る と 考 え ら れ る （ data not shown）。 今 回 の 解 析 の 結 果 か ら Hd1 の 転 写 活 性 抑 制 能 は Hd3a プ ロ モ ー タ ー に 対 し て の み 特 異 的 に 観 察 さ れ た こ と か ら 、 今 回 用 い た Hd3a の プ ロ モ ー タ ー 領 域 に Hd1 タ ン パ ク 質 が 特 異 的 に 認 識 し 作 用 す る シ ス 配 列 が 含 ま れ て い る と 思 わ れ る 。し か し 今 回 の 解 析 の 結 果 か ら は Hd1 の 認 識 配 列 は 不 明 の ま ま で あ り 、 今 後 明 ら か に す べ き 課 題 だ と 思 わ れ る 。

イ ネ に お い て 短 日 条 件 下 で Hd3a が 発 現 す る た め に は Hd1 の 機 能 が 必 要 で あ る こ と は す で に 示 さ れ て い る （ Ishikawa et al., 2005 ）。 Hd3a::GUS お よ び Hd3a::Hd3a:GFP は 短 日 条 件 下 で Hd3a::GUS は 短 日 、 長 日 、 光 中 断 処 理 下 に お い て も 内 在 の Hd3a mRNA と ほ ぼ 同 じ 発 現 パ タ ー ン を 示 し た （ 図 7， 8， 10）。 こ の 結 果 は 、 今 回 の 解 析 で 用 い た プ ロ モ ー タ ー 領 域 に 、 植 物 体 に お い て Hd3a の 発 現 が 日 長 条 件 に 応 答 し て 正 し く 制 御 さ れ る た め に 必 要 な 制 御 領 域 が 含 ま れ て い る こ と を 示 し て い る 。 し か し 、 今 回 の 一 過 的 発 現 解 析 で は Hd3a プ ロ モ ー タ ー に 対 す る Hd1 の 短 日 条 件 下 の 植 物 体 で 観 察 さ れ る よ う な 正 の 制 御 効 果 は 観 察 さ れ な か っ た 。短 日 条 件 に お い て も 花 成 の 遅 延 と Hd1 の 発 現 量 の 増 加 が 観 察 さ れ る OsGI 過 剰 発 現 体 や 野 生 型 に Hd1 を 過 剰 発 現 さ せ た 植 物 体 の 解 析 の 結 果 と 一 致 す る （ Hayama et al., 2003 ; 青 木 , 2007） 。 こ の 結 果 は 、 Hd1 に よ る Hd3a の 発 現 抑 制 の 機 構 は 細 胞 内 に お け る Hd1 の 発 現 量 も し く は タ ン パ ク 質 の 量 の 増 加 に よ り 引 き こ さ れ る 比 較 的 単 純 な 機 構 に よ る も の で あ る 可 能 性 が 高 い こ と を 示 唆 し て い る 。 一 方 Hd1 に よ る Hd3a の 発 現 の 正 の 制 御 は PhyB 光 受 容 体 の 関 与 と い っ た よ り 複 雑 な 機 構 に 依 存 し て い る と 思 わ れ る が 、 不 明 な 点 が 多 く 今 後 明 ら か に す べ き 課 題 だ と 思 わ れ る （ 青 木 , 2007） 。 3. Hd3a : GFP タ ン パ ク 質 の 機 能 解 析 Hd3a タ ン パ ク 質 の 植 物 に お け る 挙 動 を 明 ら か に す る た め に 、 Hd3a:GFP を 3 種 類 の 異 な る 維 管 束 特 異 的 な 活 性 を 持 つ プ ロ モ ー タ ー を 用 い て Hd3a:GFP を 植 物 内 で 発 現 さ せ 解 析 を 行 っ た 。

茎 頂 分 裂 組 織 に お い て Hd3a:GFP タ ン パ ク 質 の 蛍 光 が ど の プ ロ モ ー タ ー を 用 い た 場 合 で も 観 察 さ れ た こ と は、Hd3a:GFP タ ン パ ク 質 が 3 種 類 の プ ロ モ ー タ ー が 活 性 を 持 つ 維 管 束 で 発 現 し た 後 、 何 ら か の 方 法 で 茎 頂 分 裂 組 織 へ と 移 行 し て い る こ と を 強 く 示 唆 し て い る（ 図 12， 17, 18）。 先 に 行 っ た Hd3a mRNA の 発 現 解 析 な ど で Hd3a mRNA が 植 物 組 織 間 を 移 動 す る 可 能 性 が 低 い と 思 わ れ る こ と か ら 、 イ ネ に お い て は Hd3a:GFP タ ン パ ク 質 が 茎 頂 分 裂 組 織 近 傍 の 維 管 束 か ら 茎 頂 分 裂 組 織 へ と 移 行 し て い る 可 能 性 が 高 い と 考 え ら れ る 。 こ の こ と は 、 茎 頂 分 裂 組 織 近 傍 の 維 管 束 か ら 茎 頂 分 裂 組 織 ま で Hd3a:GFP タ ン パ ク 質 の 蛍 光 が 途 切 れ る こ と な く 連 続 し た 形 で 観 察 さ れ た こ と か ら も 推 測 さ れ る （ 図 12G, H， 17E, F， 18E, F）。 今 回 の 解 析 の 結 果 か ら Hd3a は 、 短 日 条 件 下 に お い て 葉 身 維 管 束 組 織 特 異 的 に 発 現 し 、 翻 訳 さ れ タ ン パ ク 質 と し て 維 管 束 内 を 移 動 し 、 茎 頂 分 裂 組 織 近 傍 の 維 管 束 で 積 み 下 ろ さ れ た 後 、 茎 頂 分 裂 組 織 へ と 移 動 し 、 花 成 を 促 進 し て い る と 推 測 さ れ る 。 こ の こ と は 、 花 成 の 誘 導 条 件 に 置 か れ た 植 物 の 葉 特 異 的 に 作 ら れ 、 篩 部 を 通 じ て 運 ば れ 茎 頂 分 裂 組 織 に お け て 花 成 を 誘 導 す る フ ロ リ ゲ ン の 特 徴 お よ び 性 質 と ほ と ん ど 一 致 し て お り 、 イ ネ に お い て Hd3a タ ン パ ク 質 が こ れ ま で に 謎 と さ れ て き た フ ロ リ ゲ ン の 実 体 で あ る 可 能 性 が 高 い こ と を 強 く 示 唆 し て い る （ Tamaki et al., 2007） 。 4． Hd3a タ ン パ ク 質 は フ ロ リ ゲ ン で あ る 可 能 性 が 高 い Hd3a の 機 能 解 析 を 通 じ て 今 回 明 ら か に な っ た こ と を 示 す と 、