学位論文内容の要旨

氏 名 授 与 し た 学 位 専攻分野の名称 学 位 授 与 番 号 学位授与の日付 学位授与の要件

学位論文の題目

論 文 審 査 委 員

古味 佳子 博 士 歯 学

博甲第５３１７号 平成２８年３月２５日

医歯薬学総合研究科機能再生・再建科学専攻

（学位規則第４条第１項該当）

マウス長管骨創傷治癒過程における宿主骨髄由来間葉系幹細胞がもたらす免疫寛容 性とそのメカニズム

松本 卓也 教授 西田 崇 准教授 窪木 拓男 教授

学位論文内容の要旨

【 背 景 】

骨 髄 由 来 間 葉 系 幹 細 胞 は ， 自 己 複 製 能 や 多 分 化 能 に 加 え て ， 免 疫 調 節 能 を 持 つ 細 胞 群 で あ る 。 こ れ ら の 機 能 を 応 用 し た 組 織 再 生 療 法 や 全 身 性 幹 細 胞 移 植 療 法 の 実 用 化 が 広 く 検 討 さ れ て い る も の の ， 移 植 コ ス ト や 幹 細 胞 の 性 質 の 維 持 等 ， 解 決 す べ き 問 題 が 多 数 存 在 す る の が 現 状 で あ る 。 こ れ ら の 幹 細 胞 移 植 療 法 の 問 題 点 を 改 善 す る 試 み と し て ， 宿 主 免 疫 応 答 の 調 節 や 移 植 幹 細 胞 の 質 の 向 上 の 検 討 が 報 告 さ れ て い る 。さ ら に は ，組 織 損 傷 部 位 に 誘 導・

集 積 す る 事 が 報 告 さ れ て い る 宿 主 未 分 化 間 葉 系 幹 細 胞 を 応 用 す る こ と で ， 組 織 再 生 や 疾 患 の 改 善 に 繋 げ よ う と す る 試 み も 始 ま り つ つ あ る 。 し か し な が ら ， 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン が 豊 富 な 組 織 創 傷 治 癒 部 位 に 集 積 し た 宿 主 幹 細 胞 が ， 損 傷 組 織 中 で ど の よ う な 影 響 を 受 け ， そ の 結 果 ， 幹 細 胞 の 多 分 化 能 や 免 疫 調 節 能 が 組 織 再 生 に ど の よ う に 寄 与 す る の か に つ い て は 十 分 な 理 解 が 得 ら れ て い な い 。 そ こ で 本 研 究 で は ， 創 傷 治 癒 部 位 に お け る 宿 主 間 葉 系 幹 細 胞 の 集 積 ， 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン が 集 積 幹 細 胞 に 与 え る 影 響 ， 宿 主 間 葉 系 幹 細 胞 が 免 疫 寛 容 性 に 寄 与 す る メ カ ニ ズ ム を 検 討 し た 。

【 材 料 お よ び 方 法 】

1. マ ウ ス 創 傷 治 癒 モ デ ル：全 身 麻 酔 下 でC57BL6/Jマ ウ ス の 大 腿 骨 を 露 出 さ せ た 後 ，直 径1.

0 mmの ラ ウ ン ド バ ー を 用 い て ， 大 腿 骨 皮 質 骨 腹 側 を 穿 孔 し た 。 穿 孔 後1，3，5，7日 に 屠 殺 し ， 以 降 の 実 験 に 使 用 し た 。 な お ， 本 研 究 は ， 岡 山 大 学 動 物 実 験 委 員 会 承 認 （OKU -2013397） の も と 実 地 し た 。

2. 組 織 学 的 検 討 ： 創 傷 治 癒 モ デ ル の 大 腿 骨 を 凍 結 包 埋 し ， 川 本 法 に 準 じ て 切 片 を 作 製 し ， HE染 色 ， 免 疫 組 織 化 学 染 色 に て 創 傷 治 癒 過 程 に お け るCD146陽 性 細 胞 な ら び に 炎 症 生 サ イ ト カ イ ン （TNF-） の 組 織 学 的 検 討 を 行 っ た 。

3. 細 胞 表 面 抗 原 解 析 お よ び ア ポ ト ー シ ス 検 出 ： 創 傷 治 癒 モ デ ル 大 腿 骨 骨 髄 の 間 葉 系 幹 細 胞 表 面 抗 原（CD146，CD90，Sca-1）お よ びT細 胞 ア ポ ト ー シ ス を フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー に て 解 析 し た 。

4. 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン の 遺 伝 子 発 現 解 析 ： 創 傷 治 癒 過 程 の 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン （Il-1b，Il -6，Ifn-g，Tnf-a） の 遺 伝 子 発 現 を リ ア ル タ イ ムRT-PCRを 用 い て 検 討 し た 。

5. 細 胞 の 分 離・培 養：C57BL6/Jマ ウ ス 大 腿 骨 か ら マ ウ ス 骨 髄 由 来 間 質 細 胞（mBMSCs）を Friedensteinら の 方 法 に よ っ て 単 離 ， 培 養 し 以 降 の 実 験 に 使 用 し た 。

6. In vitroにおけるTNF-の細胞表面抗原発現に与える影響：TNF-（ -20 ng/mL）のmBMSCsの

細胞表面抗原（CD146）発現に与える影響をフローサイトメトリーにて検討した。

7. In vitroにおける TNF-の細胞増殖能および走化性に与える影響：TNF-のmBMSCs の細胞増殖能

に与える影響をMTS試験にて，走化性に与える影響をスクラッチアッセイ法にてそれぞれ検討した。

8. In vitroにおけるTNF-の免疫抑制能に与える影響：TNF-のmBMSCsの免疫抑制能に与える影響を

検討するために，FasLの発現をフローサイトメトリーならびに免疫細胞化学染色にて解析した。さら に，T細胞と共培養し，T細胞のアポトーシス誘導ならびに制御性T細胞の分化誘導に与える影響を フローサイトメトリーにて検討した。

9. 統計解析：統計学的有意性は，one-way ANOVA, unpaired-t検定にて評価した。

【 結 果 と 考 察 】

1. 創 傷 部 位 に お け るCD146陽 性 細 胞 数 の 増 加

マ ウ ス 大 腿 骨 穿 孔 後 の 大 腿 骨 治 癒 過 程 に お け るCD146陽 性 細 胞 の 集 積 ，CD146，CD90，

Sca-1陽 性 か つ ，Lineage陰 性 細 胞 の 数 は ，穿 孔 後1日 を ピ ー ク に 増 加 し ，そ の 後 減 少 し て い た こ と が 明 ら か と な っ た 。

2. 創 傷 大 腿 骨 のmBMSCsに お け る 幹 細 胞 性 の 検 討

創 傷 治 癒 過 程 の 各 タ イ ム ポ イ ン ト か ら 単 離・培 養 し たmBMSCsのCD146の 発 現 は 有 意 な 差 は 認 め ら れ ず ，細 胞 走 化 性 は 穿 孔 後3日 を ピ ー ク に 移 動 細 胞 数 が 有 意 に 上 昇 し ，穿 孔 後 7日 で は ， 穿 孔 前 と 同 程 度 ま で 減 少 す る 事 が 明 ら か と な っ た 。

3. 創 傷 大 腿 骨 の 骨 髄 細 胞 に お け る 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン の 発 現 解 析

炎 症 性 サ イ ト カ イ ン （Il-1b，Il-6，Ifn-g，Tnf-a） の 遺 伝 子 発 現 は 穿 孔 後1日 目 に 有 意 に 上 昇 し ， そ の 後 減 少 し て い る こ と が 明 ら か と な っ た 。 同 様 に ，TNF-αの 免 疫 組 織 化 学 染 色 に お い て も 穿 孔 後 １ 日 で 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン の 増 加 し て い る 像 が 観 察 さ れ た 。

4. 非 創 傷 大 腿 骨 か ら 採 取 ， 培 養 し たmBMSCsの 幹 細 胞 性 に 及 ぼ すTNF-刺 激 の 影 響 mBMSCsをTNF-α（10 ng/mL）に て24時 間 刺 激 す る とCD146の 発 現 が 上 昇 し た 。ま た ， TNF-α刺 激 し たmBMSCsは 無 刺 激 と 比 較 し て ，有 意 に 細 胞 増 殖 が 抑 制 さ れ て お り ，細 胞 走 化 性 が 有 意 に 高 い こ と が 明 ら か と な っ た 。 さ ら に ，TNF-α刺 激 群 は 無 刺 激 群 と 比 較 し てFasLの 発 現 上 昇 が 認 め ら れ ，TNF-α刺 激 し たmBMSCsとT細 胞 を 共 培 養 す る とT細 胞 ア ポ ト ー シ ス な ら び に 制 御 性T細 胞 の 分 化 誘 導 が 促 進 さ れ る 事 が 明 ら か と な っ た 。 5. 創 傷 大 腿 骨 骨 髄 に お け るFasL陽 性mBMSCs数 とT細 胞 ア ポ ト ー シ ス の 変 化

創 傷 大 腿 骨 骨 髄 に お け るFasL陽 性 幹 細 胞 は 穿 孔 後1日 目 を ピ ー ク と し て 有 意 に 増 加 し ， そ れ に 伴 っ て ア ポ ト ー シ スT細 胞 の 増 加 ，T細 胞 数 が 減 少 す る こ と が 明 ら か と な っ た 。 創 傷 治 癒 部 位 に お け る 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン は 組 織 損 傷 後 に 増 加 し ， 同 時 に 宿 主 間 葉 系 幹 細 胞 が 集 積 す る 事 が 確 認 さ れ た 。In vitroに お け るTNF-が ，mBMSCsの 増 殖 能 を 抑 制 し ，

走 化 性 を 促 進 す る こ と か ら ，炎 症 性 サ イ ト カ イ ン に よ っ て 損 傷 部 位 周 囲 の 宿 主 間 葉 系 幹 細 胞 の 集 積 が 誘 導 さ れ た 可 能 性 が 考 え ら れ る 。そ し て ，FasLの 発 現 を 促 進 す る こ と で 宿 主T 細 胞 の ア ポ ト ー シ ス を 誘 導 し ， 炎 症 を 調 節 し て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 し か し な が ら ， 創 傷 治 癒 部 位 で の 抗 炎 症 作 用 が ど の よ う に 組 織 再 生 の 効 率 化 に つ な が る か ，集 積 間 葉 系 幹 細 胞 がT細 胞 の ア ポ ト ー シ ス を 誘 導 し た 後 ， ど の よ う な 運 命 を た ど る の か 等 ， 今 後 の 十 分 な 検 討 が 必 要 で あ る と 考 え る 。

【 結 論 】

マウス大腿骨創傷治癒過程において，穿孔1日後に宿主間葉系幹細胞が集積することが確認された。炎 症性サイトカインのひとつであるTNF-は，in vitroにおいてmBMSCsのCD146とFasLの発現を上昇さ せることが明らかとなった。また，創傷治癒過程においては穿孔１日後にFasL陽性細胞数の増加を認 め，３日後にT細胞アポトーシスの誘導が促進されたことから，集積間葉系幹細胞による創傷治癒部位の 免疫調節作用発現の可能性が示唆された。

論文審査結果の要旨

本 論 文 は ，マ ウ ス 大 腿 骨 穿 孔 モ デ ル を 用 い て ，創 傷 治 癒 部 位 に 集 積 す る 宿 主 間 葉 系 幹 細 胞 の 役 割 と 創 傷 治 癒 過 程 で 産 生 さ れ る 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン が 集 積 間 葉 系 幹 細 胞 に 与 え る 影 響 を 明 ら か に し た 研 究 で あ り ， 宿 主 間 葉 系 幹 細 胞 の 機 能 で あ る 免 疫 調 節 機 構 の 分 子 メ カ ニ ズ ム の 一 端 を 解 明 し た 極 め て 新 規 性 の 高 い 論 文 で あ る 。 こ れ ま で 幹 細 胞 研 究 は ， そ の 多 分 化 能 を 応 用 し た 組 織 再 生 療 法 に 焦 点 が 当 て ら れ て き た が ， 近 年 ， 幹 細 胞 に 宿 主 免 疫 を 調 節 す る 機 能 が あ る こ と が 明 ら か に な り つ つ あ り ， こ の 幹 細 胞 の 新 機 能 の 解 明 に 幹 細 胞 研 究 の 焦 点 が 移 り つ つ あ る 。 し か し な が ら ， 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン の 豊 富 な 創 傷 治 癒 部 位 に 集 積 し た 宿 主 幹 細 胞 が ， ど の よ う な 影 響 を 受 け ， 宿 主 免 疫 の 抑 制 に ど の よ う に 寄 与 す る の か に つ い て は 十 分 な 理 解 が 未 だ 得 ら れ て い な い 。本 論 文 は ，こ の 問 題 点 を 解 明 す べ く ，炎 症 性 サ イ ト カ イ ン の 代 表 で あ るTNF-と 宿 主 間 葉 系 幹 細 胞 の 関 係 を 詳 細 に 検 討 し ， 創 傷 治 癒 過 程 に お け る 免 疫 調 節 の メ カ ニ ズ ム に つ い て 新 た な 知 見 を 報 告 し て い る 。 以 下 に そ の 知 見 を 示 す 。 マ ウ ス 創 傷 治 癒 モ デ ル と し て ，全 身 麻 酔 下 でC57BL6/Jマ ウ ス の 大 腿 骨 を ラ ウ ン ド バ ー に て 穿 孔 し ， 穿 孔 後1，3，5，7日 で 安 楽 死 さ せ ， 組 織 を 採 取 し た 。 未 穿 孔 群 を コ ン ト ロ ー ル 群 と し て 比 較 し た 。

1. 創 傷 治 癒 部 位 に お け る 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン（TNF-）は 組 織 損 傷 後1日 で 増 加 し ，TNF -に よ っ て ，CD146陽 性 宿 主 間 葉 系 幹 細 胞 が 集 積 す る 事 を 免 疫 組 織 染 色 な ら び に フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー 解 析 で 明 ら か に し た 。さ ら に ，IL-1, IL-6, IFN-, TNF-の 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン の 遺 伝 子 発 現 レ ベ ル を リ ア ル タ イ ムRT-PCR法 に て 解 析 し ， 穿 孔 後 １ 日 で 上 昇 し て い る 事 を 明 ら か に し た 。

2. In vitroに お い て ，TNF-刺 激（10 ng/mL, 24時 間 ）は マ ウ ス 骨 髄 間 質 細 胞（mBMS Cs）の 増 殖 能（MTS法 に て 評 価 ）を 抑 制 し ，移 動 能（ ス ク ラ ッ チ ア ッ セ イ 法 に て 評 価 ） を 促 進 し た 。さ ら に ，TNF-で 刺 激 さ れ たmBMSCsで は 免 疫 抑 制 作 用 に 重 要 なFasLの 発 現 が 促 進（ フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー に て 評 価 ）さ れ ，そ の 結 果 と し て 共 培 養 し たT細 胞 の ア ポ ト ー シ ス を 誘 導 す る こ と を 明 ら か に し た 。

3. マ ウ ス 創 傷 治 癒 モ デ ル で は ，穿 孔 後 １ 日 でFasL陽 性 宿 主 幹 細 胞 が 増 加 し ，穿 孔 後 ３ 日 で はCD3陽 性T細 胞 数 の 減 少 及 び ア ポ ト ー シ スT細 胞 の 増 加（ フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー に て 評 価 ） が 確 認 さ れ た 。

以上の結果から，創傷治癒部に集積した宿主間葉系幹細胞は炎症性サイトカイン（TNF-）の影響によ りFasL発現を上昇させ，隣接するCD3陽性T細胞のアポトーシスを誘導することで宿主免疫の抑制作用 を増強することが示唆された。本論文は創傷治癒部に集積した宿主幹細胞の免疫調節作用におけるメカニ ズムに新たな知見をもたらしており，審査委員会は本論文を博士（歯学）の学位論文として十分な価値が あることを認める。