実習１： MEGA6 のダウンロードとインストール
MEGA の Web サイトはhttp://www.megasoftware.net/（下図）。正式には、左側の［Windows］ボタンをクリックし、名 前とメールアドレスを入力して［Submit Request］をクリックすると、ダウンロード用のアドレスがメールで送られる。
実習２： 配列データのダウンロードとアライメント
例題データ (data)： Actin gene coding region
１．配列データのダウンロード
（２） Accession number を入力し、[Search] ボタンをクリックする。 （３） 遺伝子全長（1374bp）の配列データが表示される。「CDS」のリンクをクリックすると（①）、CDS の部分だけマークさ れる（②）。右下の「GenBank」をクリックすれば、タンパク質コード領域（1134bp）の配列だけが表示される（③）。ス クロールして配列データを確認する。 ① ② ③ ※CDS （coding sequence）をクリックしないと、イントロンを含むものと含まないものが混在し、アライメントに支障が出る ので注意する。
（４） [Add to Alignment] ボタンをクリックする。
（５） ［Input Sequence Label］ ダイアログボックス（右図）が表示されるので、以下のように選択する。 1．「First word」は種名である「Homo sapiens」を選択する。
2. 「Second word」は遺伝子名である「ACTA1」を選択する。 3. 今回は 「Use Initial for Genus Name」 のチェックを外す。
（６） 同じ要領で以下のデータを全て Alignment Explorer にダウンロードする。（スペースで区切って、複数の番号をク エリにすれば、一度に検索できる。）
gi：5016087: Homo sapiens, actin, alpha 1, skeletal muscle gi：16359157: Homo sapiens, actin, beta
gi：11038618: Homo sapiens, actin, gamma 1
gi：11038625: Homo sapiens, actin, gamma 2, smooth muscle, enteric gi：4501882: Homo sapiens, actin, alpha 2, smooth muscle, aorta
gi：15928833: Mus musculus, actin, alpha 1, skeletal muscle gi：23271068: Mus musculus, actin, gamma, cytoplasmic gi：28277650: Danio rerio, actin, alpha 1, skeletal muscle gi：3044209: Danio rerio. beta-actin
gi：1552221: Oryzias latipes, mRNA for muscle actin
gi：3336983: Oryzias latipes, mRNA for cytoplasmic actin
gi：156772: Drosophila melanogaster, actin gene, complete cds, locus 88F
gi：156758: Drosophila melanogaster, actin gene, complete cds, locus 5C
gi：170985: Yeast (Saccharomyces cerevisiae) actin gene gi：2588915: Pneumocystis carinii mRNA for actin
gi：1049306: Arabidopsis thaliana actin-2
gi：30409355: Oryza sativa gi：6934187: Vigna radiata actin
２．配列データのアライメント
（１） 「Translated Protein Sequences」タブをクリックし、アミノ酸配列を表示する。
（２） 「Ctrl+A」で全配列の全領域を選択し、ClustalW（W）ボタンをクリックし、表示される「ClustalW Parameters」ダイア ログボックスの「OK」ボタンをクリックし、アライメントを行う。 この条件（デフォルト設定）で得られるアライメントの N 末端領域（開始コドンのすぐ下流）のアライメント精度は通 常よくない。アライメントの精度は DNA 配列でも確認してみよう。 （３） アライメントの最上行（灰色）をドラグし、最初の 10 アミノ酸座だけ選択、アライメントしてみる。
（４） 同じ領域について、「Gap Opening Penalty」（Pairwise と Multiple の 2 箇所）を「1」にしてアライメントしてみる。
※理想的には領域毎に適切な「Gap penalty」値を用いてアライメントを行うのがよい。
（５） 「DNA Sequences」タブをクリックし、DNA 酸配列に戻した後、「Save Session」でデータフ ァイルを保存する。
実習３：分子系統樹の作成
１．近隣結合法による系統樹の作成とブートストラップ・テスト
（１） 作成したアライメントファイルを開き、[Data] – [Phylogenetic Analysis] をクリックする。
（２） メインメニュから [Phylogeny]-[Construct/Test Neighbor-Joining Tree] をクリックする。
（３） 「Analysis Preferences」で以下のように設定し、DNA 塩基配列（下図左）、タンパク質アミノ酸配列（下図右）のそ れぞれ場合について系統樹を作成してみる。配列間の距離は、取りあえず p-distance （proportion of different sites）を用いる（一般的には多重置換を補正する他の方法の方がよい）。
（４） [Compute] をクリックすれば系統樹が作成され、Tree Explorer に表示される（下図）。
（５） Tree Explorer を使って系統樹の形を整える。まず、植物（Arabidopsis、Oryza、Vigna）より、菌類（Saccharomyces、 Pneumocystis）の方が動物に近縁なので、系統樹の根（root）の位置を変え、植物が外群（outgroup）になるように する。
root が付くべき、植物に至る枝をクリックして選択する。(Click on the branch leading to plants.) ↓
ボタンをクリックして root の位置を変更し、同様に、 や を使ってクラスターの順番を整える。
系統樹全体の大きさ、線の太さ、フォントなどは、 をクリックして[Options] ダイアログを表示させ、設定する。
（６） ブートストラップ法によって、系統樹の安定性を検定してみる。「Analysis Preferences」の[Test of Phylogeny] で 「Bootstrap method」を選択する。
（７） Tree Explorer では、 をクリックすると系統樹全体の書式を整えることができる。枝の太さを 2 pt にしてみよう。
さらに、特定のクラスターを選択し、 をクリックすると、選択されたクラスターの属性を設定することができる。脊 椎動物の細胞骨格型のクラスターを青、筋肉型を赤で着色してみよう。
２．最尤法による系統樹の推定
（１） メインメニュから [Models]-[Find Best DNA/Protein Models] をクリックする。
（２） Analysis Preferences の [Substitution Type] で「Amino acid」を選択する。
以下のような結果が出るはず。すなわち、LG+G モデルが最適であると考えられる。
（３） メインメニュから [Phylogeny]-[Construct/Test Maximum Likelihood Tree] をクリックする。
（４）「Analysis Preferences」で以下のように “Best Model” に設定し、系統樹を作成してみる。
（５）得られた最尤系統樹。
３．RelTime による分岐時間推定
（１）ここでは細胞骨格型のアクチン遺伝子のみを用い、種間の分岐年代推定を行ってみる。脊椎動物には paralog が 複数あるので、以下のように Sequence Data Explorer を使って beta actin のみをチェックする。
（２）次に最尤法で系統樹を推定する。モデルは LG+G を用いる。
（４）今回のデータは、進化速度の一定性が乏しく、サイト数も小さいので誤差は求めない。「No」を選択する。
（５）ヒトと酵母の分岐年代を入植するので「Yes」を選択する。
（６）「New」をクリックする。
（７）Taxon A に Homo sapiens、Taxon B に Saccharomyces cerevisiae を選択し、Min および Max Divergence Time に 1216（Time Tree of Life より）を入力し、［Save Change］→［Compute］の順にクリックする（［Compute］の前に［New］ をクリックすれば、他の Min、Max Divergence Time を追加入力することができる）。
（８）以下のような Time Tree に変換される。Human-Drosophila、Saccharomyces- Pneumocystis の分岐年代は「Time Tree of Life 」 （ http://www.timetree.org/ ） で 示 さ れ る も の に 非 常 に 近 い 値 で あ る が 、 Human-Danio 、 Oryza-Arabidopsis は実際よりも大きな値となっている。これは、進化速度の系統間差が大きいことと、基準となる 分岐年代（Human-Yeast： 1216 MYA）が古い年代であるためと思われる（多重置換の補正が十分でないと、古 い分岐年代を起点とすると新しい分岐年代は古め、新しい分岐年代を起点とすると古い分岐年代は新しめにバ イアスして推定される）。
