Effects of ONO-3307, a new synthetic protease inhibitor on endotoxin-induced disseminated intravascular coagulation in rats

新 し く合 成 さ れ た プ ロ テ ァ ー ゼ ィ ン ヒ ビ タ ー

ONO-3307に

よ る エ ン ド トキ シ ンDICの

阻 止 効 果

武

田

諭

司*吉

川

敏

一*内

藤

裕

二*

杉

野

成*

近

藤

元

治*

松

岡

昌

三**

Effects

of ONO-3307,

a new synthetic

protease

inhibitor

on endotoxin-induced

disseminated

intravascular

coagulation

in rats

Satoshi TAKEDA*, Toshikazu YOSHIKAWA*, Yuji NAITO*,

Shigeru SUGINO*, Motoharu KONDO* and

Shozo MATSUOKA**

Key words: Disseminated intravascular coagulation.

Rats. Endotoxin. ONO-3307.

The effects of ONO-3307 (4-sulfamoylphenyl

4-guanidinobenzoate

methanesulfonate),

a new synthetic

protease

inhibitor,

on endotoxin-induced

experimental

disseminated

intravascular

coagulation

(DIC) were studied in rats.

Experimental

DIC was induced

by 4 hour sustained infusion of endotoxin at a dose of 100mg/kg.

The rats were

infu-sed continuously

with ONO-3307 at 1, 10, 100pg/kg/h

into a femoral vein for 4 hour.

Simultaneously

with the agent infusion, endotoxin was administered

into the contralateral

femoral vein.

A protective effect against DIC was noted in the rats treated with 10 or

100pg/kg/h

of ONO-3307 in the following parameters: fibrinogen and fibrin degradation

products, platelet count, fibrinogen level, prothrombin

time, partial thromboplastin

time

and the number of renal glomeruli with fibrin thrombi.

These results demonstrated that

ONO-3307 reduces the extent of changes of the coagulation

parameters caused by DIC.

*京 都 府 立 医 科 大 学 第 一 内 科 〔〒602京 都 市 上 京 区 河 原 町 広 小 路 上 ル 梶 井 町465〕, First Department of Internal dicine, Kyoto Prefectural Univercity of Medicine, Kamigyo-ku, Kyoto, 602 Japan.

**小 野 薬 品 工 業(株)水 無 瀬 研 究 所 〔〒618大 阪 府 三 島 郡 島 本 町 桜 井 三 丁 目一 番 一 号 〕, Minase Research Institure, Ono Pharmaceutical Co. Ltd., Osaka, Japan. 受 付: 1989. 2. 2. 受 理: 1989. 9. 12.

20:518 血 液 と 脈 管 第20巻 第6号

緒 言

播 種 性 血 管 内 凝 固 症 候 群(Disseminated

in-travascular coagulation: DIC)は, 種 々 の 原 因 に よ って, 血 管 内 で 凝 固 系 が 活 性 化 さ れ, 全 身 に 微 小 血 栓 が 起 こ る 一 方 で, 各 種 凝 固 系 因 子 お よ び 血 小 板 が 消 費 さ れ て 減 少 し, 難 治 性 の 出 血 傾 向 を 呈 す る 病 態 で あ る1,2). DICの 治 療 と して は, 基 礎 疾 患 の 改 善 と 同 時 に, 凝 固 充 進 状 態 に よ る 微 小 血 栓 の 形 成 ・進 展 の 防 止 お よ び 溶 解 が 重 要 で, ヘ パ リン や 各 種 プ ロ テ ア ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー が, 臨 床 的 に も用 い ら れ て い る. わ れ わ れ は, エ ン ド トキ シ ン の 持 続 注 入 に よ り, DICモ デ ル を ラ ッ トに 作 成 し3), こ れ を 用 い て 種 々 の 薬 剤 のDIC防 御 作 用 に つ い て 検 討 し て い る4-7). そ こ で, 新 た に 開 発 さ れ た 凝 固 ・線 溶 ・カ リ ク レ イ ン な ど を 強 力 に 阻 害 す る プ ロ テ ア ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー で あ る4-sulfamoylphenyl 4-guani-dinobenzoate methanesulfonate(ONO-3307) (図1)8)が, DICの 発 症, 増 悪 を 防 止 し う る か ど う か を 検 討 し た. 1. 材 料 お よ び 方 法 対 象 動 物 と し て 体 重 約200gのWistar系 雌 ラ ッ トを 用 い た. エ ン ド トキ シ ン はDifco社 製 のEscherichia

coli O55: B5 lipopolysaccharide Bを 用 い た.

実 験 的DICは, ラ ッ トの 大 腿 静 脈 よ り ポ リエ チ レ ン チ ュ ー ブ を 通 し て11.4mZの 生 理 食 塩 水 に 溶 解 し た エ ン ド トキ シ ン100mg/kgを, 4時 間 持 続 注 入 して 作 成 し た. 注 入 終 了 後, 腹 部 大 動 脈 よ り採 血 し, 各 種 測 定 に 供 し, 腎 臓 を 組 織 学 的 に 検 討 し た. こ の 実 験 的DICに 対 す るONO-3307(4-su-ifamoylphenyl 4-guanidinobenzoate metha-nesulfonate: 小 野 薬 品 工 業)の 各 量1, 10, 100

μg/kg/hを1.76mZの 生 理 食 塩 水 に 溶 解 し,

エ ン ド トキ シ ン 注 入 開 始 と 同 時 に, 反 対 側 の 大

腿 静 脈 よ り 同 様 に4時 間 持 続 注 入 し た.

DICの 状 態 は, 丘brinogen and丘brin

degra-dation products(FDP), 血 小 板 数, フ ィ ブ リ

ノ ー ゲ ン, フ ロ トロ ン ビ ン 時 間(Prothrombin time:PT), 部 分 トロ ン ボ ブ. ラ ス チ ン 時 間(pa-rtial thromboplastin time:PTT)お よ び 腎 糸

球 体 の フ ィ ブ リ ン 血 栓 に よ り 判 定 した. FDP は, ラ テ ッ ク ス 凝 集 反 応(帝 国 臓 器 社 製, 東 京) を 用 い, ヒ ト ・フ ィ ブ リ ノ ー ゲ ン μg/mZに 換 算 して 表 示 し た. PTは, Quick-段 法9)で, PTTはLangdell法10)で, フ ィ ブ リ ノ ー ゲ ン は トロ ン ビ ン 時 間 法 で, そ れ ぞ れ 測 定 し た. 腎 糸 球 体 の フ ィ ブ リン 血 栓 の 程 度 は, 腎 組 織 標 本 を ヘ マ トキ シ リン ・エ オ ジ ン 染 色 で 染 色 後, 顕 微 鏡 下 で 腎 糸 球 体100個 を 数 え, そ の 内 フ ィ ブ リ ン 血 栓 を 有 す る 糸 球 体 の 占 め る 割 合(%glome-rular fibrin deposits: %GFD)11)で 表 現 した.

な お, す べ て の 測 定 値 はmean±SEで 表 示 し た. 有 意 差 は, 11.4mZの 生 理 食 塩 水 に 溶 解 し た エ ン ド トキ シ ン100mg/kgと 生 理 食 塩 水 1.76mZと を 両 側 大 腿 静 脈 よ り そ れ ぞ れ4時 間 に わ た り持 続 注 入 し たcontrol群 と 比 較 し た. ま た, 生 現 食 塩 水11.4mZの み を4時 間 注 入 し た ラ ッ トをnormal群 と した. II. 結 果 (1)FDPに 対 す る 影 響(図2) 実 験 的DICに お け るFDPの 上 昇 が, ONO-3307を 投 与 す る こ と に よ り, ど の よ う に 阻 止 さ れ る か を 検 討 し た. 生 理 食 塩 水 の み を 持 続 注 入 したnormal rat群 で は, FDP値 は, 4.1±0.8 μg/mZで あ る が, エ ン ド トキ シ ン を 投 与 す る と, 42. 6±3.8μ9/mZま で 上 昇 した. 1.76 mZの 生 理 食 塩 水 に 溶 解 し たONO-3307, 1, 10, 100 μg/kg/hを, エ ン ド トキ シ ン と 同 時 に 注 入 す る と, そ れ ぞ れFDP値 は, 35.2±3.6, 24.5± 4. 4, 14.6±3 0μg/mZと 低 値 を 示 し, control群 と 比 較 し て, 10, 100μg/kg/h投 与 群 で, そ の 増 加 が 有 意 に 阻 止 さ れ た.

Fig. 1 Structure of ONO-3307 CH3SO3H

(2)血 小 板 に 対 す る 影 響(図3) 生 理 食 塩 水 の み を 注 入 したnormal群 に お い て, 血 小 板 数 は84. 7±6. 7×104/mm3で あ っ た が, エ ン ド トキ シ ン の 注 入 に よ り, 7.3±1.0× 104/mm3ま で 低 下 し た. し か し, ONO-3307 を, 1, 10, 100μg/kg/h投 与 す る こ と に よ り, そ れ ぞ れ, 19.8±4.1, 17.2±2.7, 14.8±2.0× 104/mm3と な り, そ の 減 少 は, 1μg/kg/hで P<0. 05, 10, 100μ9/kg/hでP<0. 01の 危 険 率 で 有 意 に 阻 止 さ れ た. (3)フ ィ ブ リ ノ ー ゲ ン に 対 す る 影 響(図4) normal群 で は, フ ィ ブ リ ノ ー ゲ ン 量 は114. 4 ±5.8mg/dZで あ っ た が, control群 の フ ィ ブ リ ノ ー ゲ ン 量 は, 22.9±5.3mg/dZま で 低 下 し た. こ の 低 下 は, 10, 100μg/kg/hのONO-3307 持 続 注 入 に よ り, そ れ ぞ れP<0.05, P<0.01 で 有 意 に 阻 止 さ れ た. (4)PTに 対 す る 影 響(図5)

Fig. 2 Effect of ONO-3307 on FDP in endotoxin-induced DIC

20:520 血 液 と 脈 管 第20巻 第6号 生 理 食 塩 水 の み を 注 入 し たnormal群 で は, PTが12.7±2.1sec. で あ る の に 対 し て, エ ン ド トキ シ ン を 注 入 したcontrol群 で は, 165.2± 40.0sec. ま で 延 長 した. ONO-3307の 投 与 に よ り, 1μ9/kg/hで は, 62.1±23.8sec. とP<0.05 の 危 険 率 で, ま た, 10, 100μ9/kg/h投 与 群 で は そ れ ぞ れ, 27.1±4. 4, 19.2±2.7sec. とP< 0.01の 危 険 率 で 有 意 にPTの 延 長 が 阻 止 さ れ た. (5)PTTに 対 す る 影 響(図6) normal群 で は, PTTは56.1±3.3sec. で あ る が, エ ン ド トキ シ ン 注 入 に よ り, control群 で は, 296.4±44.8sec. と延 長 し た. ONO-3307 の1μg/kg/hの 投 与 で, PTTは, 254. 9±44. 1 sec. とp<0.05の 危 険 率 で, ま た, 10, 100μg/ kg/hの 投 与 で, そ れ ぞ れ155. 7±34.5, 92.0± 29. 7sec.とP<0.01の 危 険 率 で, 有 意 に 阻 止 さ れ た.

Fig. 4 Effect of ONO-3307 on fibrinogen in endotoxin-induced DIG

(6)腎 糸 球 体 の フ ィ ブ リ ン 血 栓 形 成 に 対 す る 影 響(図7) normal群 で は%GFDは0%で, 腎 糸 球 体 の フ ィ ブ リ ン 血 栓 は 全 く形 成 さ れ て い な か っ た. control群 で は%GFDは76.1±1.7%と 高 率 に, フ ィ ブ リ ン 血 栓 を 有 す る 腎 糸 球 体 が 存 在 した. 一 方, ONO-3307の10, 100μg/kg/h投 与 群 で は, そ れ ぞ れ45.9±1.9, 40.0±2.1%と p<0.001の 危 険 率 で 有 意 に フ ィ リ ピ ン 血 栓 形 成 を 阻 止 した. III. 考 察 1, 10, 100μ9/kg/hの 濃 度 のONO-3307を エ ン ド トキ シ ン と 同 時 に, そ れ ぞ れ 左 右 大 腿 静 脈 よ り4時 間 持 続 注 入 した. ONO-3307を 投 与 せ ず, 生 理 食 塩 水 と エ ン ド トキ シ ン を 同 時 注 入 し た ラ ッ トと 比 較 し, 10お よ び100μg/kg/hの ONO-3307を 投 与 し た ラ ッ トに お い て, 測 定 し

Fig. 6 Effect of ONO-3307 on PTT in endotoxin-induced DIC

20:522 血 液 と 脈 管 第20巻 第6号 た す べ て の 数 値 に 対 して 有 意 差 を 認 め, 実 験 的 DICの 阻 止 効 果 を 示 し た. 今 回 検 討 した 濃 度 で は, FDP, フ ィ ブ リ ノ ー ゲ ン, PT, PTT, %GFDに お い て 濃 度 依 存 性 に, DICに 対 して 阻 止 効 果 を 認 め た. 血 小 板 に お い て は, 平 均 値 は1μg/kg/hの 投 与 群 が 最 も 高 値 で あ っ た が, 同 群 の 各 数 値 は, 4.2×103か ら35.5×103と 偏 差 が 大 き く, 統 計 的 に は10お よ び100μ9/kg/h投 与 群 の 方 が, よ り 危 険 率 の 低 い 有 意 差 が 検 定 さ れ た. わ れ わ れ は こ れ ま で に も, gabexate mesilate やnafamostat mesilateな ど の 各 種 プ ロ テ ア ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー に お い て も, 同 モ デ ル を 用 い て DICの 阻 止 効 果 を 検 討 し て い る が5,6), こ れ ら は, DICに 対 して, 投 与 量 が 多 く て も少 な くて も効 果 が 最 大 と な らず, 適 当 量 が 必 要 で あ る こ と が 示 唆 さ れ て い る. こ れ ら薬 剤 と 同 様 に, 抗 トロ ン ビ ン 作 用 と, 抗 プ ラ ス ミ ン 作 用 を あ わ せ も つ, 新 し い 合 成 プ ロ テ ア ー ゼ イ ン ヒ ビ タ ー で あ るONO-3307も, そ の 作 用 か ら, 適 当 量 が 存 在 す る と 考 え られ た が, 今 回 検 討 した 三 つ の 濃 度 で は, 濃 度 依 存 性 にDICに 対 す る 阻 止 効 果 を 認 め た. ONO-3307を, よ り 高 濃 度 で 投 与 し た 場 合 で のDICに 対 す る 阻 止 効 果 に つ い て は, 今 後 の 検 討 が 待 た れ る. in vitroで のONO-3307の 血 液 凝 固 線 溶 系 に 対 す る 作 用 は, gabexate mesilateと 比 較 し

て, human plasmaに 対 す るIC50値 が, PTで

約5倍, PTTで 約17倍, フ ィ ブ リ ン 溶 解 時 間

で 約33倍 と, よ り 強 力 な 阻 害 作 用 を 有 し, 親

和 性 に 関 して も, そ のKi値 はONO-3307,

Ga-bexate mesilateが, お の お の, thrombinに 対

して0.18μMと1. 5μM, plasminに 対 して0.37 μMと1.9μMと 後 者 よ り強 く, ま たplasmin よ りthrombinに 対 し て 高 い 親 和 性 を 有 して い る8). そ の 強 力 な 阻 害 作 用 に よ り, 低 濃 度 で, DICに 対 す る 阻 止 効 果 が 出 現 す る も の と 考 え ら れ る. DICの 病 態 と 補 体 は 密 接 な 関 連 性 を 有 し て い る12,13). ま た, 本 動 物 モ デ ル に お け る血 小 板 の 減 少 は, 高 濃 度 の エ ン ド トキ シ ン に よ る 補 体 の 活 性 化 に よ る 可 能 性 も強 く, 今 回 の 実 験 の 血 小 板 減 少 抑 制 は, 必 ず し もONO-3307の 止 血

機 構 活 性化 抑 制 だ け に よ る も ので はな い と考 え

られ る. 今 回 の結 果 や, 他 の プ ロ テア ー ゼ イ ン

ヒビタ ー と の 構造 の 類似 性 か ら もONO-3307

に抗補 体 作 用 が あ る も の と予 想 され るが, そ の

詳 細 な検 討 は, 未 だ な され て い な い.

ONO-3307の

投 与 方 法 で, わ れ わ れ が 用 い た

の は持 続 注 入 で あ る. このONO-3307の

代 謝

はか な り速 く, 半 減 期 が 約50分 で, 作 用 時 間 も

短 い こ と とな る. した が って, 実 際 臨床 的 に投

与 す る場 合 な ど に も, 持 続 的 あ るい は頻 回 な る

投 与 方 法 を用 い る方 が よ り効果 的 で あ る と思 わ

れ る.

以 上 の よ うに, ONO-3307は

低 濃 度 の投 与

で, 実 験 的DICに

対 して, 著 明 な阻 止 効 果 を

示 し, 臨 床 的 に も こ の薬 剤 がDIC予

防や 治 療

に有 効 で あ る可 能 性 が 示 唆 され た.

文

献

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