学位論文内容の要旨

博 士 （ 医 学 ） 中 村 智 晴

学 位 論 文 題 名

L ーアルギニン由来Nitric Oxide の冠動脈・心筋問質構築の恒常性維持 および交感神経活動制御への関与に関する研究

学位論文内容の要旨

【 目 的 】Nitric oxide（NO）は 、現 在 まで3種 類の 存在 が知 られ て いるNO合 成酵 素（NOS）に よ り L‐ ア ル ギ ニ ン と 酸 素 か ら 生 成 さ れ 、 血 管 弛 緩 を は じ め 種 々の 作 用を 有す る。NOS阻害 薬を 動 物 に 急 性 投 与 す る と 、NOS‑3の 阻 害に よ り血 圧が 上昇 する と とも に交 感神 経 活性 が亢 進す るこ と か ら 、 中 枢 でNOS‑1に よ り 生 成 さ れ るNOは 交 感 神 経 活 性 低 下 作 用 を 有 す る と さ れ て いる 。本 研 究 で は 、 ま ず 慢 性 的 にNOSを 阻 害 し た 際 に も 交 感 神 経 活 性 亢 進 が 認 め ら れ る か 否 か を検 索し た 。 さ ら に そ の 際 の 心 臓 組 織 所 見 を 検 索 す る こ と よ り 、 種 々 のNOSか ら 生 成 さ れ るNOが冠 動脈 お よ び 心 筋 問 質 の 恒 常 性 維 持 に 果 た す 役 割 を 検 討 し た 。

【 方 法 】12週 齢 の 雄 性Wistarラ ッ ト を 用 い 、 麻 酔 下 に 腹 腔 内 に 浸透 圧ポ ン プを 埋め 込ん だ。 充 填液 と して は、 生理 食塩 水 （sal:ine群 ：nニ16）、 非選 択的NOS阻害薬であるL‑N゜‑nitroarginine methylester（LNAME）0.2 moI/L溶 液 （low NAME群 ：n〓28） 、 もし くはLNAMElmoVL溶液 （high NAME群 ：n=32） を 用 い た 。 高 血 圧 の 対 照 と し て 同 週 齢 の 雄 性 脳 卒 中 易 発 症 高 血 圧 自 然 発 症 ラ ット（stroke‑prone spontaneous hypertensive rat; SHRSP: rr8）を加えた4群のラッ卜を4週間飼育し、

収 縮 期 血 圧 お よ び 心 拍 数 の 推 移 を カ フ 法 に よ り 観 察 し た 。4週 間 後 一 部 の ラ ッ ト は 実 験 に供 し

（saline(lM)群 ：n=8、low NAME(1M)群 ：rr12、high NAME(1M)群 ：lr12、 お よ びSHRSP群 ： n=8）、 他は 浸透 圧 ポン プを 交換 し 、同 じも の（salineく2M)群：n‑8、low NAME(2M)群：n=8、high NAME(2M)群 ：n=7） 、 も し く は 生 理 食 塩 水 を 充 填 し た 浸 透 圧 ポ ン プ を 再 び 埋 め 込 み （low NAME‑saline群：n=8、high NAME‑saline群：n=7）、 さら に4週間 （計8週 間） 飼育 ・観 察 した 。4 お よ び8週 間 の 飼 育 ・ 観 察 後 採 血 し 、 血 清 カ テ コ ラ ミ ン 濃 度 （HPLC法 ） お よ び 血 漿 活 性 レニ ン 濃 度 を 測 定 し た 。 次 い で 心 臓 を 摘 出 し 、HE染 色 標 本 よ り 冠 動 脈 の 壁 厚 お よ び 内 腔 径 を 計 測 し て 壁 厚 ／ 内 腔 径比 を 算出 し、Masson Trichrome染 色標 本よ り 心筋 問質 線維 化 の程 度に 対しO‐3の スコアーをっけて定 量化した。また腎臓組織所 見を検索した。

【 結 果 】high NAME群 で は 最 初 の4週 間 で5匹 が 死 亡 し 、 後 半 の4週 間 で さ ら に5匹 が 死 亡 し た た め 、high NAME(2M)群 は 以 後 の 解 析 か ら 除 外 し た 。

  4週 間 のLNAME投 与 に よ り 、 収 縮 期 血 圧 はlow NAME群 で112か ら137 mmHg、high NAME 群 で は113か ら179 mmHg＾ と 上 昇 し た 。4週 間 後LNAMEに 変 え て 生 理 食 塩 水 を 投 与 し た 群 で は 、low NAME‑saline群 で 血 圧 が116 mmHg＾ と 正 常 化 し た が 、high NAME‑saline群 で は8週 日 の 血 圧 が122mmHgと 完 全 に は 正 常 化 し な か っ た 。low NAME(2M)群 で は140 mmHg前 後 の 血 圧 上 昇 が8週 日 ま で 持 続 し た 。 心 拍 数 は10w NAME群 で は416か ら354と 低 下 し 、 こ の 低 下 は8 週 日 ま で 持 続 し た 。 一 方high NAME群 で は 、 心 拍 数 は411か ら322ま で 低 下 し た が 、 そ の 後 徐 々 に 増 加 し 、4週 間 後 に は428とsaline群 と 同 程 度 ま で 上 昇 し た 。low NAME‑saline群 では 、生 理 食 塩 水 投 与 に 変 更 後 、 心 拍 数 は 直 ち にsaline(2M)群 と 同 レ ベ ル ま で 回 復 し た 。   血 清 ノ ル エ ピ ネ フ リ ン （NE） 濃 度 は 、4週間 の処 置でsaline(lM)群132土17 (SE) pg′ml、10w NAME（1M） 群149士14pg/ml、highNAME（1M） 群246士44pgゾml、SHRSP群150士33pg/nllと

― 253―

high NAME(1M)群の みで有 意（pく0.05）に高値となった。8週間後のNE値は、saline(2M)群、

low NAME(2M)群で有意 な変化 を認めな かった が、highNAM以1M）群 で認めら れた高 値はhigh NAME・弧1血e群（l14土13pg/ml）で有意（pく0．05）に減少し、他群と同等となった。血清ドーパ ミ ン（DA） 濃度は、4週目 でlowNAME（1M）群 （70土15pg/ml）およ びhighNAME（lM） 群（58 土9pg/n11）が、salme（lM）群（126土28pg／ml）に比し有意（pくO．05）に低値となった。この LNAME投与 群のDA低値 は、8週日に は生理食 塩水投 与への変 更によりs虹血e（2M）群と同レベ ル ま で 回 復 し た が （lowNAMEIsmi鵬 群 ：167土57pg/ml． 、highNAME‐smme群：111土45 pg？ml）、LNAMEの継続投与ではさらに低下した（lowNAME（2M）群：21土7pg／ml）。血漿活性 レニン濃度は各群で有意差を認めなかった。

  組 織学的 所見では 、LNAME投与は冠 動脈壁の 肥厚お よび心筋 問質の 線維化を もたら し、血 管 および線 維化の 周囲には 心臓組 織球を主 体とす る細胞浸 潤が認められた。これらの変化は highNAME群で顕著 であり、4週 間の生理 食塩水 追加投与 によって も8週日で回復しなかった。

また、血圧上昇がより著しいSHRSP群と比ぺ、highNAME（，1M）群で冠動脈壁厚・内腔比がより大 き く 、 な か で も 内 腔looHm未 満 の 細動 脈 壁 の肥 厚 が 強か っ た 。心 筋 問 質 の線 維 化 もhigh M｀ME（lM）群で，SHRSP群より有意に高度であったd腎臓には有意な変化は確認されなかった。

【 考 察 】LNAME等 のNOS阻 害 薬 によ る 血 圧上 昇 は 、主 に 抵 抗血 管 で 血 管内 皮 細 胞のNOS‑3 により持 続的に 放出されるNOの生成低下によるとされている。本研究でhigh NAME‑saline群に おい て 、4週 日 以 降NOS阻 害薬 投与 中止にも かかわ らず血圧 が正常 化しなか った理由 は、1M NAMEの4週 間 投与 に よ り 、非 可 逆 的性 の 細 動脈 病 変 が生 じ た可能 性、内皮 傷害によ りNO生 成が完全には回復しなかった可能性などが考えられる。

  LNAME投与 群での心 拍数低 下は、血 圧上昇に 対する 圧受容器 反射を 介したも のと考 えられ る。しか しhighNAME群で は、一 旦減少し た心拍数は徐々に増加し、4週日にはほばsal血e群と 同等にま で回復 した。血 圧の持 続的上昇 にもか かわらず 、highNAME群で心拍数が上昇した理 由として 、同群 でNE濃度が 高かっ たことが 挙げられる。以前より、NOS阻害薬急性投与では中 枢のNOS−1が阻害され、交感神経活性が亢進するとされている。本研究における心拍数および NE濃 度 の 推 移 は 、NOS慢 性 阻 害 で も 交 感 神 経 活 性 亢 進 が 存 在 す る こ と を 示 唆 す る 。   本 研 究で 認 め られ た 組 織 学的 所 見 は、NOS慢 性 阻 害モ デ ルにお ける細動 脈壁の肥 厚や心 筋問質の 線維化 に、NOS‐3阻害による血圧上昇以外の要素が重要な意味を持っことを示唆して いる。以前より、同モデルの著しい組織変化にはレニン・アンギオテンシン系の関与が示唆され ていたが 、本研 究で明らかとなった交感神経活性亢進を介したNE濃度上昇により、a1｜受容体 刺激が亢 進し、 血管平滑筋細胞や線維芽細胞の増殖が促進された可能性が考えられる。また、

NOは血管 内皮細胞 の表面へ の接着 因子の発 現を抑 制するこ とが知 られている。本研究では、

u岨ME投与 群の冠 小・細動 脈肥厚 部位の周 囲に心 臓組織球 による細 胞浸潤 が認めら れたが 、 NOS‐3阻 害 に よるNO生 成減 少 の結果 、接着因 子の発 現が亢進 し、免 疫担当細 胞が血 管壁に 接着・侵 入して 各種サイトカインの産生を亢進させ、血管平滑筋細胞や線維芽細胞の増殖が促 進した可能性がある。さらに細胞浸潤の存在する部位では、浸潤細胞自・身やその周囲の細胞に NOS12が 誘導され ることが 知られ ている。 このNOS・2から生成されるNOは、血管平滑筋細胞や 線維 芽細胞 の増殖 を抑制す るとさ れており 、NOS阻害によ りNOS‐2か らのNO生成 が減少 すれ ぱ、さら に冠動 脈壁肥厚や心筋問質線維化を進行させ得ると思われる。以上より、本研究で認 めら れ たu岨ME投与 に よ る 冠動 脈 壁 での 肥 厚 と心 筋 問 質の 線維化 には、 内皮由来 のNOS‐3 阻害 の み なら ず 中 枢性 のNOS‐1阻 害、さら にNOS‐2阻 害が関与 した可 能性が考 えられ る。

【 結 論 】浸 透 圧 ポン プ 腹 腔 内留 置によるLNAME慢 性投与でNOSを 阻害した 場合、血 圧の上 昇 に もかか わらず心 拍数が増 加し、 さらに血 清NE濃度 の上昇が 認めら れることから、慢性的な NOS阻害 によって も交感神 経活性 が上昇す ること が示され た。． 慢性的なNOS阻害によるNO生 成 低下は 、特に内 腔100肛m未 満の細動 脈の肥 厚と著し い心筋問 質の線維化をもたらした。そ の 機 序 と し てNOS‑3阻 害 に よ るNO生 成 低 下 以 外 に 、NOS‑1やNOS‑2由 来NOの 生 成 阻 害 が 関 与する 可能性が 示唆され た。以 上より、L‐ アルギニ ン‑NO系 は、NOS‑3のみならずNOS‑1や NOS‑2から 生成され るNOを介 して、心 ・循環系の恒常性維持に重要な役割を担うことが示唆さ れ た。

― 254―

学位論文審査の要旨

学 位 論 文 題 名

L ―アルギニン由来Nitric Oxide の冠動脈・心筋問質構築の恒常性維持 および交感神経活動制御への関与に関する研究

  Nitric oxide（NO）は3種 のNO合成酵 素（NOS）によ りL― アルギ ニンから 生成さ れ、種々 の 作 用 を 有す る 。NOS阻害 薬を動 物に急性 投与する と、血 管内皮細 胞のNOS−3阻害によ り血圧 が 上 昇 す ると と も に交 感神 経活性 が増加す ることか ら、中 枢性NOS‑1由来のNOは交感神 経活性 低 下 作 用 を有 す る とさ れて いる。 本研究で は、まず 慢性的 にNOSを 阻害し た際にも 交感神 経活性 増 加が認め られる か否かを 検索し、 さらに その際の 心臓病 理所見を 検索す ることよ り、種々の NOSか ら 生 成 さ れ るNOが 冠 動 脈 お よ び 心 筋 問 質 の 恒 常 性 維 持 に 果 た す 役 割 を 検 討 し た 。   方 法として12週齢雄 性Wistarラッ トに腹腔内に浸透圧ポンブを埋め込み、生理食塩水（saline 群 ） 、NOS阻 害薬L―No―nitroargininemethylester（LNAME）0.2 mal/L溶 液(low NAME群）、

も し く は1 mol/L溶液 （high NAME群 ）を 慢 性 投与し た。高血 圧対照 として同 週齢の 雄性脳卒 中 易 発 症高 血 圧 自然 発 症 ラッ ト （SHRSP） を 用 いた。4週間 後一部 のラット は実験に 供し、 他 は 浸透圧ボ ンブの 充填液を 交換して さらに4週間 飼育し た。4および8週間後採血し、心臓を摘出 し てHE染色お よびMasson Trichrome染色によ り、冠 動脈の壁 厚／内 腔径比を 算出し、 さらに心 筋問質線維化の程度を定量化した。

  LNAME慢性 投 与 によ り 、 収縮 期 血 圧は 濃 度 依 存性 に 上 昇し た 。4週 間 後LNAMEを 生理食 塩水 に 交 換 し た 群 で は 、血 圧 が 低下 し た 。心 拍 数 はLNAME投 与 群で 低 下 し 、10w NAME群 で は8週 日 ま で 低下 が 持 続し た が 、high NAME群 で は 心拍 数は一旦 低下後 徐々に増 加し、4週間 後には saline群 と同程 度まで上 昇した。 血清ノ ルエピネ フリン 濃度は、4週間 後のhigh NAME群のみ有 意 に高値と なった 。血清ド ーハミン 濃度は 、4週 目でLNAME投与群 でsaline群に 比し有意 に低値 となり、このDA低値｜ま生理食塩水への交換により8週目に｜よsaImne群と同レベルまで回復したが、

LNAMEの 追 加投 与 で はさ ら に 低下 し た 。以 上 よ り 、NOS慢性 阻 害 でも 、NOS‑3阻害 により 血圧 が 上 昇 す る の み な ら ず 、NOS―1阻 害 に よ り 交 感 神 経 活 性 が 亢 進 す る こと が 示 唆さ れ た 。   心 臓の 組 織 学的 所 見では 、NOS慢性阻害 により 冠動脈壁 の肥厚お よび心 筋問質の 線維化 と、

心 臓組織球 を主体 とする細 胞浸潤を 認めた 。とくにhigh NAME群で｜よ、血圧上昇がより激しい SHRSP群 に 比ベ 、 特 に内腔100ロm未満 の細動脈 の動脈 壁厚・内 腔比が 有意に大 きく、 心筋問質 の 線維化も 有意に 高度であ った。こ れらの 結果は、 冠動脈 壁肥厚お よび心 筋問質線 維化に、高

― 255―

顯 哉

夫

秀

盛

畠 藤

野

北

齋 菅

授 授

授

教 教

教

査 査

査

主 副

副

血圧以外の因子の存在を示唆した。本モテルの著しい組織変化にはレニン・アンキオテンシン 系の関与が想定されているが、本研究ではさらに交感神経活性増加を介したNE濃度上昇により al・交感神経受容体刺激が亢進し、血管平滑筋細胞や線維芽細胞の増殖が促進された可能性が ある。また、NOS―3阻害により血管内皮での接着因子発現が亢進し、免疫細胞の血管壁への接 着・侵入、さらにサイトカイン産生が惹起され、細胞増殖性変化が増大したと考えられる。ま た、浸潤細胞自身やその周囲の細胞にはNOS―2が誘導され、．それから生成されるNOは細胞増殖 を抑制するが、本モデルで｜よNOS阻害によりNOS‑2由来NOの生成が減少し、さらに冠動脈壁肥 厚や心筋問質線維化を進行させた可能性がある。

  以上より、本研究で認められたLNAME投与による冠動脈壁での肥厚と心筋問質の線維化にtよ、

内皮由来のNOS‑3阻害のみならず中枢性のNOS―1阻害、さらにNOSー2阻害が関与する可能性が あり、 L‑アルギニンーNO系は、NOS―3のみならずNOS‑1やNOS‑2から生成されるNOを介して、

心・循環系の恒常性維持に重要な役割を担うことが示唆された。

  公開発表は約25名の聴衆の前で行われ、副査の齋藤秀哉教授よりNOS慢性阻害モテルにおけ るレニン・アンギオテンシン系の関与について、心筋構築変化の持続性および血圧との関係に ついて、さらに臨床における類似の病変に関しての質問がなされた。また、副査の菅野教授よ りLNAMEの薬理学的作用、本モテルにおける圧反射の状態、組織所見検討の客観性、NOの線 維化抑制の機序に関して、さらに各種臨床的病態におけるNOS活性についての質問がなされた。

主査の北畠教授からは、NOS−1を介する非アドレナリン・非コリン性神経の関与について、お よび冠動脈径とNOS阻害の効果に関して質問があった。申請者はこれらの質問に対して、実験 状況の説明を的確に行い、実験結果や臨床的意義に関しては他の論文や自己の臨床経験を引用 し、豊富な知識に基づぃてほぽ妥当に回答した。

  本研究は、心・循環系の恒常性維持にL−アルギニン‑NO系が種々のNOSを介して関与するこ とを明らかとした。臨床的にも、本研究で認められたと同様な冠細動脈の選択的肥厚が認めら れる病態として、微小血管性狭心症があり、本研究は同疾患の原因究明にも貫献すると思われ る。審査担当者一同は、これらの成果を高く評価し、申請者が博士（医学）の学位を受けるの に充分な資格を有するものと判断した。

‑ 256ー