カイコガ Bombyx mori の成長過程における

(1)

カイコガ Bombyx mori の成長過程における

D -セリンの役割に関する研究

平成 24 年 11 月

鈴木千尋

(2)

(3)

ページ

第

1

章序論

1.1

アミノ酸光学異性体

1.2

タンパク質と酵素

1.3

自然界の

_D-

アミノ酸

1.4

カイコガ

Bombyx mori

について

1.5

本研究の意義と目的

参考文献

第

2

章新規遊離

_D-

セリン定量法の開発とカイコガ臓器への応用

2.1

序論

2.2

材料と方法

2.3

結果

2.4

考察

2.5

結論

参考文献

第

3

章カイコガにおける

_D-

セリン代謝と

_D-

セリンの生理的役割の検討

3.1

序論

3.2

材料と方法

3.3

結果と考察

3.4

結論

参考文献

第

4

章総括

謝辞

1 1 1 3 6 8 9 12 12 13 14 20 21 22 24 24 25 28 43 45 47 48

(4)

(5)

本研究の報告をするにあたり究の目的について述べる。

1.1

アミノ酸光学異性体

アミノ酸とは，分子内にアミノ基と炭素は四価であり相異なる

斉炭素となる。タンパク質構成アミノ酸のうち，グリシン以外の素を持つため

_L-

アミノ酸と

光学活性以外の両者の物理的諸性質（

全く同一である。アミノ酸を混合物であるラセミ体が生じるれる。しかし生体においてはアミノ酸の合成・分解反応や

れている。なぜならば生体を構成するタンパク質はように

_L-

アミノ酸のみで成り立っているからである。

1.2

タンパク質と酵素

アミノ酸は，アミノ基とカルボキシル基間で縮合重合た高分子（ペプチド）を形成する

酸を「結合型アミノ酸」または「アミノ酸残基」という。

なく単独に存在しているアミノ酸を「遊離型アミノ酸」という。

Fig. 1-1.

1

第

1

章

序論

本研究の報告をするにあたり，まずその研究背景と基本事項について解説し

分子内にアミノ基と，カルボキシ基とをもつ化合物の総称である。

価であり相異なる

4

つの原子あるいは原子団が結合している場合斉炭素となる。タンパク質構成アミノ酸のうち，グリシン以外のアミノ酸は

アミノ酸と

_D-

アミノ酸と呼ばれる光学異性体が存在する両者の物理的諸性質（沸点，融点，溶解性，反応性）

である。アミノ酸を化学的に合成した場合，

_L-

アミノ酸と

_D

が生じる。生体中の

_D-

アミノ酸は，ラセマーゼにより生合成さしかし生体においては，

_L-

アミノ酸と

_D-

アミノ酸は，酵素によって触媒される

や，種々の受容体や抗体による認識において

。なぜならば生体を構成するタンパク質は

_L-

アミノ酸ワールドと呼称されるアミノ酸のみで成り立っているからである。

アミノ基とカルボキシル基間で縮合重合（ペプチド結合

を形成することができる。ペプチド結合を形成しているアミノ酸を「結合型アミノ酸」または「アミノ酸残基」という。これに対してペプチド中でなく単独に存在しているアミノ酸を「遊離型アミノ酸」という。ペプチドのうち，

. L-

アミノ酸と

_D-

アミノ酸（

R :

側鎖）

まずその研究背景と基本事項について解説し，本研

カルボキシ基とをもつ化合物の総称である。

つの原子あるいは原子団が結合している場合，それは不アミノ酸は，不斉炭アミノ酸と呼ばれる光学異性体が存在する（

Fig. 1-1

）。

）や化学的性質も

D-

アミノ酸の等量

アミノ酸は，ラセマーゼにより生合成さは，酵素によって触媒される種々の受容体や抗体による認識において厳密に区別さアミノ酸ワールドと呼称される

結合，

Fig.1-2

）し

ペプチド結合を形成しているアミノ

これに対してペプチド中で

ペプチドのうち，ア

(6)

ミノ酸残基数

10

程度までのものをと呼ぶ。分子量約

5,000

以上（アミノ酸

ク質という。タンパク質は生体を構成する分子群の中で，水についで多く存在する最重要化合物である。生体内には種々のタンパク質が存在しそれぞれ

る。たとえば，筋肉のアクチンとミオシン爪などのケラチンのような構造タンパク質

触媒する酵素タンパク質，外界や体内からの刺激を受け取りる受容体タンパク質や情報伝達タンパク質

る抗体などのような機能性タンパク質

ところが，生体を構成しているり，これを

_L-

アミノ酸ワ－ルドとい

-

アミノ酸に置換した場合，

がって酵素，受容体，抗体などのタンパク質は生体中の密に区別して反応している。例えば

D-

アミノ酸オキシダ－ゼは

タンパク質が機能を発揮する上で重要なのはその立体構造である。タンパク質の立体構造はその一次構造（構成アミノ酸の数と結合順序）

質合成の素材として利用されない遊離型年，

_D

型

-

アミノ酸，特に

_D

係の報告も増加している。次項で自然界における現在の知見を紹介する［

1

］。

Fig. 1-2.

2

程度までのものをオリゴペプチド，それ以上のものを以上（アミノ酸残基数約

50

以上）のポリペプチド

タンパク質は生体を構成する分子群の中で，水についで多く存在する最生体内には種々のタンパク質が存在しそれぞれの

筋肉のアクチンとミオシン，腱や角質を構成するコラーゲン

構造タンパク質，生体内の代謝などのあらゆる化学反応を外界や体内からの刺激を受け取りその情報

や情報伝達タンパク質，免疫反応で特定の分子を認識して結合機能性タンパク質が存在し，その種類は数万に

ところが，生体を構成しているタンパク質は

_L-

アミノ酸のみによって

ルドという（タンパク質中の

_L-

アミノ酸残基を該当する

，立体構造が変化し本来の機能を発揮でき抗体などのタンパク質は生体中の

_D-

アミノ酸と密に区別して反応している。例えば

_D-

アミノ酸の酸化的脱アミノ反応

ゼは

_D-

アミノ酸にのみ働き，

_L-

アミノ酸には作用

タンパク質が機能を発揮する上で重要なのはその立体構造である。タンパク質の立一次構造（構成アミノ酸の数と結合順序）に依存する。

質合成の素材として利用されない遊離型

_D-

アミノ酸に関する研究は

D-

セリンに関する研究が活発に行われ，他の

係の報告も増加している。次項で自然界における

_D-

アミノ酸の存在と利用について，

。

2.

タンパク質（ペプチド）の一次構造

それ以上のものをポリペプチドポリペプチドをタンパタンパク質は生体を構成する分子群の中で，水についで多く存在する最の役割を担っていを構成するコラーゲン，毛髪・

あらゆる化学反応を情報を細胞核に伝え特定の分子を認識して結合すその種類は数万におよぶ。

によって形成されておアミノ酸残基を該当する

_D

を発揮できなくなる）。したアミノ酸と

_L-

アミノ酸を厳の酸化的脱アミノ反応を触媒する酵素

には作用しない。

タンパク質が機能を発揮する上で重要なのはその立体構造である。タンパク質の立

に依存する。従来，タンパク

アミノ酸に関する研究は少なかったが，近

他の

_D-

アミノ酸関

アミノ酸の存在と利用について，

(7)

1.3

自然界の

D-アミノ酸

結合型

_D-

アミノ酸について

生物における

_D-

アミノ酸の存在は，まず下等な生物で見出された。

包む核膜を持たない（核を持たない

その細胞壁を構築しているペプチドグリカン

ニンと

_D-

グルタミン酸を必須構成成分として含有している。細菌によってはさらに

D-

アスパラギン酸，

_D-

リシン

理由は，

_L-

アミノ酸でできた種々の分解酵素の攻撃から身を守るためであると考えられている［

3

］。グラム陽性菌のテイコ酸には

枯草菌など

Bacillus

属の細菌（納豆菌もその一種）にポリるものが知られている［

5

］。

の真正細菌が産生するペプチド抗生物質も構造

アラニン，セリン，プロリン，システイン，フェニルアラニン，ロイシン，バリン，

トリプトファンなどの

_D

型異性体を含み，これらの酸に置換すると薬効が無くなることがわかっているいう細胞内小器官で

_L-

アミノ酸

に

_D-

アミノ酸を含むペプチド

D-

および

_L-

アミノ酸が酵素によって

peptide synthesis

）［

7

，

8

］。このような群には，

_L-

アミノ酸の異性化によりも含まれる。

原核生物より高等である真核生物においてもそれまでは稀だとみなされていた

3

アミノ酸

アミノ酸について

アミノ酸の存在は，まず下等な生物で見出された。

核を持たない）原核生物に分類される大腸菌などの真正細菌はペプチドグリカン（糖とペプチドのポリマ

を必須構成成分として含有している。細菌によってはさらにリシン，

_D-

セリンなどを含む［

2

］。細胞壁に

_D

アミノ酸でできた種々の分解酵素の攻撃から身を守るためであると考えらグラム陽性菌のテイコ酸には

_D-

アラニンエステルが含まれ

属の細菌（納豆菌もその一種）にポリ

-γ-D-

グルタミン酸を分泌す

。さらにポリミキシン，グラミシジン，バシトラシンなどの真正細菌が産生するペプチド抗生物質も構造中にアスパラギン酸，グルタミン酸，

アラニン，セリン，プロリン，システイン，フェニルアラニン，ロイシン，バリン，

型異性体を含み，これらの

_D-

アミノ酸を該当する酸に置換すると薬効が無くなることがわかっている［

6

］。タンパク質はリボソ

アミノ酸を構築素材として合成されるが，上記のようにアミノ酸を含むペプチド抗生物質は，リボソ－ム上ではなく細胞質中で

酵素によって連結されることにより合成されるこのような

Non-ribosomal peptide synthesis

アミノ酸の異性化により

_D-

アミノ酸を産生するラセマーゼ

真核生物においても，近年の分析技術・装置の進歩により，

それまでは稀だとみなされていた

_D-

アミノ酸が遊離型として存在することが急速に

Fig. 1-3.

セリンラセマーゼの反応

アミノ酸の存在は，まず下等な生物で見出された。染色体

DNA

を原核生物に分類される大腸菌などの真正細菌は，

ポリマ－）中に

_D-

アラを必須構成成分として含有している。細菌によってはさらに

D-

アミノ酸を含むアミノ酸でできた種々の分解酵素の攻撃から身を守るためであると考えらアラニンエステルが含まれ［

4

］，またグルタミン酸を分泌すさらにポリミキシン，グラミシジン，バシトラシンなど中にアスパラギン酸，グルタミン酸，

アラニン，セリン，プロリン，システイン，フェニルアラニン，ロイシン，バリン，

アミノ酸を該当する

_L-

アミノタンパク質はリボソ－ムと

，上記のように分子中細胞質中で遊離型の合成される（

non-ribosomal ribosomal peptide synthesis

を触媒する酵素

するラセマーゼ（

Fig. 1-3

）など

，近年の分析技術・装置の進歩により，

アミノ酸が遊離型として存在することが急速に

(8)

明らかになってきた。ある種のカビが生合成するサイクロスポリンして臓器移植に必須である。この分子は環状ペプチドの中に

いる［

9

］が，この

_D-

アラニンを

他にも，ヒナタクサグモが分泌する神経毒のマイの神経ペプチド，南米産木登りカエルの

（受容体に結合し鎮痛作用を持つ物質）

ペプチド

bombinin H

［

12

］，ノハシが分泌する毒性ペプチドる（

Fig. 1-4

）。

前出の

dermorphin

の場合，タンパク質の設計図である

指定する配列は含まれておらず，リボソ－ム上でられる［

15

］ことから，前駆体の

置き換えられて成熟した

dermorphin

前駆体の

N

末端から

2

番目のメラ－ゼ（異性化酵素）が発見され塩基配列がヒト，ニワトリ

D-

アミノ酸残基を含むペプチド

遊離型

_D-

アミノ酸について一方，遊離型の

_D-

アミノ酸

50%

）含有する真正細菌が多い

Fig. 1-4.

生理活性ペプチド中の

4

明らかになってきた。ある種のカビが生合成するサイクロスポリン

A

して臓器移植に必須である。この分子は環状ペプチドの中に

_D-

アラニン残基を有してアラニンを

_L-

アラニンに置き換えると活性は失われてしまう。

，ヒナタクサグモが分泌する神経毒の

ω-agatoxin IV B

［

10

］や，

南米産木登りカエルの皮膚に含まれる非常に強力なオピオイド

（受容体に結合し鎮痛作用を持つ物質）

dermorphin

［

11

］，同じカエルが分泌する抗菌

，タコの心筋収縮ペプチド

cardioactive peptide

ノハシが分泌する毒性ペプチド

platypus venom

［

14

］などに

_D-

アミノ酸残基が存在す

の場合，タンパク質の設計図である

mRNA

には

れておらず，リボソ－ム上で

_L-

アミノ酸のみからなる前駆体が作ことから，前駆体の

_L-

アラニン残基が翻訳後修飾を受けて

dermorphin

になることが示された。

2005

番目の

_L-

イソロイシンを

_D-allo-

イソロイシンに変換するイソが発見された［

16

］。さらに，この酵素の遺伝子に類似したニワトリ，フグなどで見つかったことから，高等

ペプチドの存在する可能性が示唆されている［

アミノ酸について

アミノ酸に関しては，

_D-

アラニンを高濃度（全遊離アラニンの約が多い［

17

］。真正細菌と同じ原核生物ではあるが

生理活性ペプチド中の

_D-

アミノ酸（赤文字

_D-

アミノ酸）

A

は免疫抑制剤とアラニン残基を有してアラニンに置き換えると活性は失われてしまう。

や，アフリカマイ皮膚に含まれる非常に強力なオピオイドカエルが分泌する抗菌

ardioactive peptide

［

13

］，カモアミノ酸残基が存在す

には

_D

型アミノ酸をアミノ酸のみからなる前駆体が作翻訳後修飾を受けて

_D-

アラニンに

2005

年には，

bombinin

イソロイシンに変換するイソ酵素の遺伝子に類似した高等動物においても

［

16

］。

を高濃度（全遊離アラニンの約

。真正細菌と同じ原核生物ではあるが系統発生

アミノ酸）

(9)

5

的には真核生物に近い古細菌の

Pyrobaculum islandicum

などでは遊離

_D-

アミノ酸濃度は低くなり［

18

］，真核生物では以前の分析技術では検出できなかったほど低濃度である。このように，地球上に初期に出現した生物ほど

_D-

アミノ酸の濃度が高いと考えられてきた。しかし，二枚貝などの軟体動物やエビなどの甲殻類を含めた水生無脊椎動物には

_D-

アラニン［

19

］が，同じくタコなどの軟体動物には

_D-

アスパラギン酸［

20

］が，そしてチョウやガなどの昆虫には

_D-

セリン［

21

］が発見された。この中で特に解析の進んでいるものが，水生無脊椎動物の

_D-

アラニンである。エビやカニでは生体内の全遊離アラニンに対して

30

～

50%

を，二枚貝の一種であるミルクイでは

50%

以上を

D-

アラニンが占めている［

19

］。

_D-

アラニンを産生する酵素アラニンラセマ－ゼがアメリカザリガニにおいて発見された［

19

］。汽水域に棲息するアサリなどの水生無脊椎動物の生体内で産生された

_D-

アラニンは，潮の干満により大きく変る海水の浸透圧から身を守るための浸透圧調節物質（オスモライト）として機能していると考えられている。

無脊椎動物より高等な生物である哺乳類では，特定臓器に高濃度の遊離型

_D-

アミノ酸が局在する。その代表は

_D-

アスパラギン酸と

_D-

セリンである。

_D-

アスパラギン酸は，

脳，松果体，下垂体，精巣などに検出されている［

20

］。松果体は概日リズム調節ホルモンメラトニンを分泌する内分泌器官であるが，

_D-

アスパラギン酸によって分泌の制御を受けていることが示唆されている。また，

_D-

アスパラギン酸は，副腎ではステロイド合成の，精巣では男性ホルモンテストテスロン合成の調節に関与していることが報告され［

21

］研究が進められている。また，正常なヒトの唾液［

22

］や胃液［

23

］にもアラニン，セリン，プロリン，アスパラギン酸，グルタミン酸の

_D-

型異性体が検出されている。

ヒト脳内に存在する

N-

メチル

-D-

アスパラギン酸（

NMDA

）受容体は，特に海馬（記憶や学習といった高度な神経活動の中枢部位）に高密度に存在し，神経伝達物質である

_L-

グルタミン酸が結合すると作動する。研究の結果，その

_L-

グルタミン酸の

NMDA

受容体への結合を遊離型

_D-

セリンは調節していて，記憶の成立に不可欠なアミノ酸であることが明らかになった［

24

］。その後，ラットの脳でセリンラセマ－ゼが発見され［

25

］，その

DNA

遺伝子配列も明らかにされた。さらにヒトにおいては，脳内の

D-

セリンの動態と統合失調症などの神経・精神疾患との関連が指摘されている。

NMDA

受容体の遮断薬が統合失調症と酷似した症状を引き起こすこと，

_D-

セリンの投与がある種の統合失調症の症状を改善すること，

_D-

セリンを分解する酵素

_D-

アミノ酸オキシダ－ゼの遺伝子変異と統合失調症発症者の相関関係［

26

］などが報告され，ヒトに対する

_D-

セリンの投与試験も行われている。このように高等生物の

_L-

アミノ酸ワールドにおける

_D-

アミノ酸の生理作用は医学的見地からも注目度を増してきている。

同じ真核生物のミミズ［

27

，

28

］や，チョウ・ガが属する鱗翅目の昆虫に高濃度の

遊離型

_D-

セリンが存在することは古くから知られていた［

21

］。特にサクサン（柞蚕

) Antheraea pernyi

やセクロピアサン

Hyalophora cecropia

などの繭を作る種において

_D-

(10)

6

セリンが検出され，とりわけ，カイコガ

Bombyx mori

から高濃度の

_D-

セリンが検出された［

29

］。その後，放射性同位体を用いた研究により，カイコガ体内で

_L-

セリンから

_D-

セリンの産生されていることが明らかになり，その反応を触媒する酵素セリンラセマ－ゼが部分精製された［

30

］。しかし，カイコガにおいて

_D-

セリンの生理的役割について，ならびに生命工学的な研究はされていなかった。

1.4.

カイコガ

Bombyx mori

について

カイコガ

Bombyx mori

（

Fig. 1-5

）は節足動物門，昆虫綱の鱗翅目（チョウ目）に属

する完全変態の昆虫である。繭を作るので，古くから絹糸生産のために飼育・繁殖がく行われてきた。特に日本では養蚕を背景に，形態学的，内分泌学的，遺伝学的な知見が蓄積されている。

Fig. 1-5.

カイコガ

Bombyx mori 5

齢幼虫と成虫

N4

春嶺鐘月

(11)

7

その他にも，カイコガを研究材料とする上で以下のような利点がある。系統，飼育方法が確立済み。大量飼育・繁殖が容易。既に全ゲノムが解明されたモデル生物。組み替えタンパク質の発現用に大腸菌に代わってカイコガ培養細胞やカイコガ体液が利用されている。バイオリサ－チセンタ－で多くの品種が保存されており随時頒布されることなどである。さらに最近では，カイコガは生理的条件がヒトに近く，薬剤の効果や病原体に対する感受性がヒトと良く一致し，取扱い上倫理的な問題も少ないため，新しい実験動物として注目されている。特に本研究に用いた

N4

株は，特別な処理をせずに卵を通年孵化させることが可能であり，また人工飼料のみで飼育できるという利点を持つ品種である。近年は，カイコガの産出するシルクタンパク質が天然素材として人気を集めており，繊維産業のみならず化粧品や食品など多岐にわたる分野で応用研究が進められている。

Fig. 1-6.

カイコガのライフサイクル

(N4)

(12)

8

本研究では信州大学より提供された

Bombyx mori N4

株と，九州大学の

National

Bio-Resource Project

より提供された春嶺鐘月株を使用した。一般的なカイコガと同様

に

N4

株も孵化後，眠と脱皮を繰り返しながら

1

～

5

齢（各齢

4

～

6

日間）まで成長し，

吐糸幼虫（

2

日間）を経て繭を作る。繭の中で蛹（

8

～

9

日間）となり成熟する。吐糸幼虫になると以後採餌・排糞を行わなくなる。成虫は交尾・産卵を行い，一生を終える。その寿命は約

40

～

50

日である。カイコガのライフサイクルを

Fig. 1-6

に示す。

1.5

本研究の意義と目的

脳内における

_D-

セリン動態の研究をはじめとして，高等動物の

_L-

アミノ酸ワールド

における

_D-

アミノ酸の生理作用については医学的見地からも注目度が増している。先

に述べたように，ヒトに対して

_D-

セリンの投与が行われていることから，カイコガへ

の

_D-

セリン投与の生命工学的研究は，精神疾患の臨床研究など医学的にも貢献しうる

と期待される。そこで本研究では，カイコガにおける

_D-

セリンの生理的役割を解明し

本アミノ酸がどのように生体機能や代謝経路に関わっているかを明確にし，生命工学

的な応用に必要な情報を得ることを目的とした。

(13)

9

参考文献

[1] Nagata, Y. (2005)

細菌から高等生物までの

_D-

アミノ酸の動態

.

ファルマシア

, 41, 831-835

[2] K, H, Schleifer and O, Kandler (1972) Peptidoglycan types of bacterial cell walls and their taxonomic implications. Bacteriol Rev., 36: 407-477.

[3] Geok-Yong Yow, Uo, T., Yoshimura, T., and Ezaki, N. (2004) D-amino acid N-acetyltransferase of Saccharomyces cerevisiae a close homologue of histone acetyltransferase Hpa2p acting exclusively on free D-amino acids. Arch, Microbiol., 182, 396-403.

[4] Lambert, P.A., Hancock, I.C., and Baddiley, J. (1977) Occurrence and function of membrane teichoic acids. Biochim, Biophys. Acta., 471, 1-12.

[5] Troy, F.A. (1985) Capsular poly-gamma-D-glutamate synthesis in Bacillus licheniformis.

Methods in Enzymol., 113, 146-168.

[6] Bodanszky, M., and Perlman, D. (1969) Peptide antibiotics. Science, 163, 352-358.

[7] Belshaw, P., Walsh, C., and Stachelhausb, T. (1999) Aminoacyl-CoAs as probes of condensation domain selectivity in nonribosomal peptide synthesis. Science, 284, 486-489.

[8] Shen, Q. T., Chen, X. L., Sun, C. Y., and Zhang, Y. Z. (2004) Dissecting and exploiting nonribosomal peptide synthetases. Biochim, Biophys, Acta. Sin., 36, 243-249.

[9] Hoffman, K., Scherzer, S. H., Kleinkauf, H., and R, Zocher. (1994) Purification and characterization of eucaryotic alanine racemase acting as key enzyme in cyclosporin biosynthesis. J. Biol. Chem., 269, 12710-12714.

[10] Heck, S. D., Siok, C. J., Krapcho, K. J., Kelbaugh, P. R., Thadeio, P. F., Welch, M. J., Williams, R. D., Ganong, A. H., Kelly, M. E., and Lanzetti, A. J. (1994) Functional consequences of posttranslational isomerization of Ser46 in a calcium channel toxin.

Science, 266, 1065-1068

[11] Montecucchi, P. C., de Castinglione, R., Piani, S., Gozzini, L., and Erspamer, V. (1981) Amino acid composition of dermorphin, a novel opiate-like peptide from the skin of Phyllomedusa sauvagei. Int. J. Pept. Protein Res., 17, 275-283.

[12] Mignogna, G.., Simmaco, M., Kreil, G., and Barra, D. (1993) Antibacterial and haemolytic peptides containing D-alloisoleucine from the skin of Bombina variegate.

EMBO J., 12, 4829-4832.

[13] Iwakoshi, E., Hisada, M., and Minakata, H. (2000) Cardioactive peptides isolated from the brain of Japanese octopus, Octopurs minor. Peptides, 21, 623-630.

[14]Torres, A. M., Menz, I., Alewood, P. F., Bansal, P., Lahnstein, J., Gallagher, C. H., and Kuchel, P. W. (2002) D-amino acid residue in the C-type natriuretic peptides from the

(14)

10

venom of the mammal, Ornithorhynchus anatinus, the Australian platypus. FEBS Lett., 524, 172-176.

[15] Richter, K.., Egger, R.., and Kreil, G. (1987) D-alanine in the frog skin peptide dermorphin is derived from L-alanine in the precursor. Science, 238, 200-202.

[16] Jilek, A., Mollay, C., Tippelt, C., Grassi, J., Mignogna, G., Mullegger, J., Sander, V., Fehrer, C., Barra, D., and Kreil, G. (2005) Biosynthesis of a D-amino acid in peptide linkage by an enzyme from frog skin secretions. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102, 4235-4239.

[17] Nagata, Y., Fujiwara, T., Kawaguchi-Nagata, K., Fukumori, Y., and Yamanaka, T. (1998) Occurrence of peptidyl D-amino acids in soluble fractions of several eubacteria, archaea and eukaryotes. Biochim. Biophys. Acta., 1379, 76-82.

[18] Nagata, Y., Tanaka, K., Iida, T., Kera, Y., Yamada, R., Nakajima, Y., Fujiwara, T., Fukumori, Y., Yamanaka, T., Koga, Y., Tsujii, S., and Kawaguchi-Nagata, K. (1999) Occurrence of D-amino acids in few archaea and dehydrogenase activities in hyperthermophile Pyrobaculum islandicum. Biochim. Biophys. Acta., 1435, 160-166.

[19] Abe, H. (2002) Distribution, metabolism and physiological functions of free D-amino acids in aquatic invertebrates. NIPPON SUISAN GAKKAI, 68, 516-525.

[20] D’Aniello, A., and Guiditta, A. (1977) Identification of D-aspartic acid in the brain of Octopus vulgaris Lam. J. Neurochem., 6, 1053-1057.

[21]

古地壯光

(2004)

ステロイドホルモン産生調節における

_D-

アミノ酸の役割

.

武田

科学振興財団薬学系研究奨励研究報告書

[22] Nagata, Y., Higashi, M., Ishii, Y., Sano, H., Tanigawa, M., Nagata, K., Noguchi, K. and Urade, M. (2007) The presence of high concentrations of free D-amino acids in human saliva. Life Sci., 78, 1677-1681.

[23] Nagata, Y., Sato, T., Ishii, Y., Sasaki, K., and Yamada, T. (2007) High concentration of

D-amino acids in human gastric juice. Amino Acids, 32, 137-140.

[24] Schell, M., Molliver, M., and Snyder, S. (1995) D-serine, an endogenous synaptic modulator: localization to astrocytes and glutamate-stimulated release. Proc. Natl. Acad.

Sci. USA., 92, 3948-3952.

[25] Wolosker, H., Blackshaw, S., and Snyder, S. H. (1999) Serine racemase: A glial enzyme synthesizing D-serine to regulate glutamate-N-methyL-D-aspartate neurotransmission.

Pro. Natl. Acad. Sci. USA., 96, 13409-13414.

[26] Nishikawa, T. (2005)

ヒトの脳に存在する遊離型

_D-

セリンの機能と病態－精神神

経疾患の治療への応用

. Biol Pharm Bul, 41, 863-868.

[27] Rosenberg, H., and Ennor, A. H. (1960) Occurrence of free D-serine in the earthworm.

Nature, 187, 617-618.

(15)

11

[28] Rosenberg, H., and Ennor, A. H. (1961) The occurrence of free D-serine in the earthworm. Biochem. J., 79, 424-428

[29] Srinivasan, N. G., Corrigan, J. J., and Meister, A. (1962) D-serine in the blood of the silkworm Bombyx moriand other Lepidoptera. J. Biol. Chem. 237, PC3844-PC3845 [30] Uo, T., Yoshimura, T., Shimizu, S., and Esaki, N. (1998) Occurence of pyridoxal

5’-phosphate-dependent serine racemase in silkworm, Bombyx mori. Biochem. Biophys.

Res. Commun., 246, 31-34.

(16)

新規遊離

D-セリン定量法の開発と

2.1

序論

カイコガ

Bombyx mori

は遊離

いる。その濃度は

50%

（全遊離型セリンに対するる［

1

］。昆虫より高等な生物における

類の大脳において

20

～

25%

ット大脳の遊離セリンのおよそ

セリンの相互変換を触媒する酵素セリンラセマ－ゼ［

成される。遊離

_D-

セリンは大脳に存在する

容体のグリシン結合部位に作用する神経制御物質である［

受容体機能障害［

9

］と関係し

［

11

］の治療に役立てられている。

我々はカイコガの成長において，

ンはどのようなメカニズムで

の研究や診断と神経障害の治療のために，生体試料中の

することが求められている。高性能液体クロマトグラフィ－（

セリンを正確に定量するために用いられている［

キラル溶媒などコスト面と測定に時間を要すること，測定操作にある程度習熟しなければならないなどの難点がある。さらにシステムのメンテナンスも必要である。また，

アミノ酸分析機は

_D-

異性体と

で低コストの

_D-

セリン測定法の開発を目指した，

くの

_D-

セリン含有生物について，その存在部位と成長に伴う含有量変動の追跡が可能となるので，

_D-

セリンの生理作用解明のための有力な手段となる

12

第

2

章

セリン定量法の開発とカイコガ臓器への応用

は遊離

_D-

セリン（

_L-

セリンの光学異性体）を高濃度含有して

（全遊離型セリンに対する

_D

型の割合，以下同様）も占めてい

］。昆虫より高等な生物における

_D-

セリンの検索の結果，ヒト血漿［

25%

の

_D-

セリンが存在することが明らかになった［

ット大脳の遊離セリンのおよそ

25%

は，

_D-

異性体である。

_D-

セリンは，

セリンの相互変換を触媒する酵素セリンラセマ－ゼ［

5

，

6

］によってセリンは大脳に存在する

N-

メチル

-D-

アスパラギン酸（

容体のグリシン結合部位に作用する神経制御物質である［

7

，

8

］。

_D

関係していて，統合失調症［

10

］と心的外傷後ストレス障害に役立てられている。

我々はカイコガの成長において，

_D-

セリンの重要性を認識した［

ンはどのようなメカニズムでカイコガの成長を支えているのか，その

の研究や診断と神経障害の治療のために，生体試料中の

_D-

セリンを迅速・正確に測定することが求められている。高性能液体クロマトグラフィ－（

HPLC

セリンを正確に定量するために用いられている［

14

，

15

］。しかし，機器，カラム，

キラル溶媒などコスト面と測定に時間を要すること，測定操作にある程度習熟しなければならないなどの難点がある。さらにシステムのメンテナンスも必要である。また，

異性体と

_L-

異性体を区別できない。以上の背景のもと簡便・正確セリン測定法の開発を目指した，このような測定法が開発されれば多セリン含有生物について，その存在部位と成長に伴う含有量変動の追跡が可能

セリンの生理作用解明のための有力な手段となると期待される。

Fig. 2-1. DSD

の反応機構

カイコガ臓器への応用

セリンの光学異性体）を高濃度含有して型の割合，以下同様）も占めていセリンの検索の結果，ヒト血漿［

2

］や哺乳セリンが存在することが明らかになった［

3

，

4

］。ラセリンは，

_L-

セリンと

_D-

］によって

_L-

セリンから合アスパラギン酸（

NMDA

）受

D-

セリンは

NMDA

心的外傷後ストレス障害

セリンの重要性を認識した［

12

，

13

］。

_D-

セリその生理的役割解明セリンを迅速・正確に測定

HPLC

）は，微量の

_D-

］。しかし，機器，カラム，

キラル溶媒などコスト面と測定に時間を要すること，測定操作にある程度習熟しなければならないなどの難点がある。さらにシステムのメンテナンスも必要である。また，

異性体を区別できない。以上の背景のもと簡便・正確このような測定法が開発されれば多セリン含有生物について，その存在部位と成長に伴う含有量変動の追跡が可能

と期待される。

(17)

13

そこで比色定量法に着目した。

_D-

セリンに対する高い基質特異性を持つニワトリの酵素

_D-

セリンデヒドラタ－ゼ（

DSD

，

EC 4.3.1.18

［

16

］）を用いて，新たな

_D-

セリン定量法を開発した。

_D-

セリンは

DSD

が触媒する酵素反応の基質である。この反応によって

_D-

セリンはピルビン酸とアンモニアに分解される（

Fig. 2-1

）。ピルビン酸は，

分光光度計を用いて簡単に比色定量することができる。本研究では，この方法を用いてカイコガ臓器中の

_D-

セリンを測定し，その結果を

HPLC

法［

17

］によって得られた値と比較して遜色のないことを確認した。

2.2

材料と方法

2.2.1

カイコガ飼育法

Bombyx mori N4

株，或いは，春嶺鐘月株を研究室内で飼育して研究に用いた。非

休眠卵を孵化させ，クワの葉から作られた人工飼料

Silkmate 2S

（日本農産）を与えた。

室温はエアコンを用いて通年

25°C

前後を保ち，齢を揃えるため

25W

蛍光灯によって

12

時間の明期と

12

時間の暗期（

20

時～

8

時）の日周期環境において飼育した。

2.2.2

ニワトリ

D-セリンデヒドラタ－ゼの調製

組換え大腸菌

BL21Star

（

DE 3

）（

Invitrogen

）を

Luria-Bertani

（

LB

）培地中

37°C

で培養して殖やした。この大腸菌にはニワトリ

_D-

セリンデヒドラ－ゼ（

DSD

，

DDBJ

登

録番号：

AB284370

）の

DNA

を組み込んだプラスミドを含有する

pET100/D-TOPO

ベ

クタ－（

Invitrogen

，

Carlsbad

，

CA

，

USA

）が存在する。以下の実験はすべて

4°C

で行

った。大腸菌を集めて

100 µM

ピリドキサ－ル

5’-

リン酸（

PLP

）を含む

Tris

–

HCl buffer

（

pH 8.0

）に懸濁後，超音波破砕（

50 W

，

60 min

）した。超遠心分離（

140,000 g × 30 min

，

4°C

）した無細胞抽出液の上澄みに

0.5 M NaCl

と

20 mM

イミダゾ－ルを加え，

Ni-NTA Superflow

（

Qiagen

）カラムに添加した。

0.5 M

イミダゾ－ルを加えた

buffer A

（

20 mM Tris

–

HCl buffer (pH 8.0)

，

100 µM PLP

，

0.5 M NaCl

，

20 mM

イミダゾール）を用いて溶出した活性画分を

buffer B

（

20 mM

リン酸カリウム

buffer

，

pH 7.8

，

50 µM PLP

）に平衡化した

Q Sepharose

カラム（

GE Healthcare Life Sciences

）に通し精製

DSD

を得た。

2.2.3

測定試料の調製

カイコガ

5

齢幼虫，吐糸幼虫，蛹，成虫を解剖し，体液，頭，中腸，精巣，卵巣，

絹糸腺，マルピ－ギ管，脂肪体，気管，翅原基，皮膚を取り出し，測定に用いるまで

-80°C

で保存した。中腸からは消化内容物を完全に取り除いた。

4

倍量（

v/w

）の

50 mM

Tris

–

HCl buffer

（

pH 8.5

）を各臓器に加え，はさみで細切し，氷上でガラスホモジナイ

ザ－（

1,200 rpm × 3 min

）を用いて摺り潰した。破砕液を遠心分離（

12,000 g × 10 min

，

4°C

）し，上澄みとして得られた無細胞抽出液を測定試料とした。

(18)

2.2.4 D-セリンの酵素法による定量

反応溶液（全量

100 µL

，無細胞抽出液

Tris

–

HCl buffer

（

pH 8.5

））を

（

Asahi Technoglass

，

Tokyo

）中で，

ジン溶液（

1 mM 2,4- dinitrophenylhydrazine/1 M HCl

らに室温で

5 min

静置後

0.6 M NaOH

（

MTP-450

，

Corona

，

Ibaragi

リンに対する検量線は，カイコガ精巣の無細胞抽出液（タンパク質濃度に種々の量の

_D-

セリンを加えることにより作成した。反応溶液中の

A450

と検量線から算出した。

サンプルのタンパク質濃度は，

ミンを使用）により決定した。

2.3

結果

2.3.1

測定条件の決定

Fig. 2-2. DSD

による

_D 有意差t検定

14

セリンの酵素法による定量

，無細胞抽出液

10 µL

，

0.5 × 10^-3 U DSD

，

10

））を

96-well

平底ポリスチレン製マイクロタイタ－プレ－ト

）中で，

37°C

，

10 min

インキュベ－ト後，フェニルヒドラ

dinitrophenylhydrazine/1 M HCl

）

20 µL

を加えて反応を止め，さ

0.6 M NaOH

を

160 µL

加えた。マイクロプレ－トリ－ダ－

Ibaragi

）を用いて

450 nm

の吸光度（

A450

）測定を行った。

リンに対する検量線は，カイコガ精巣の無細胞抽出液（タンパク質濃度セリンを加えることにより作成した。反応溶液中のと検量線から算出した。

サンプルのタンパク質濃度は，

Bradford

法［

18

］を用いた検量線（ウシ血清アルブミンを使用）により決定した。

D-

セリン脱水によるピルビン酸変換時の

検定 †はp < 0.05，＊はp < 0.002，mean ± SD (n =

10 µM PLP

，

50 mM

平底ポリスチレン製マイクロタイタ－プレ－ト

インキュベ－ト後，フェニルヒドラを加えて反応を止め，さ加えた。マイクロプレ－トリ－ダ－

測定を行った。

_D-

セリンに対する検量線は，カイコガ精巣の無細胞抽出液（タンパク質濃度

40 mg/mL

）セリンを加えることにより作成した。反応溶液中の

_D-

セリン量は，

］を用いた検量線（ウシ血清アルブ

セリン脱水によるピルビン酸変換時の

PLP

濃度影響

= 4)

(19)

DSD

は

PLP

依存性酵素のため，最大酵素活性が得られる

2-2

）。

2

～

6 µM PLP

は

17%

，

以上の

PLP

は，

10 µM PLP

加えることに決定した。

つぎに，反応溶液中の

DSD

セリンに対して，より高い吸光度（す。しかし，分光学的定量法は

採用できる。また，

DSD

使用量を抑えることも必要である。その結果，

を用いることに決定した。

2.3.2 D-セリン検量線の作製

無細胞抽出液を加えない

Fig. 2- 0.1 × 10^-3 U DSD (●)，0.5

15

依存性酵素のため，最大酵素活性が得られる

PLP

濃度を検索した（

，

8

～

20 µM PLP

は

28%

ピルビン酸生成を増加した。

M PLP

と同じ効果を示した。以上より，

10 µM PLP

DSD

量と吸光度の関係を検討した（

Fig. 2

より高い吸光度（

A450

）を与える

DSD

量を用いる方が測定精度は増分光学的定量法は

_D-

セリン濃度と

A450

が直線関係である範囲内でのみ

使用量を抑えることも必要である。その結果，

セリン検量線の作製

無細胞抽出液を加えない

Tris-HCl buffer

（

pH 8.5

）のみ中に

_D-

セリンを加えて，

-3.

反応液中

DSD

量と吸光度の関係

0.5 × 10^-3 U DSD (〇)，1.0 × 10^-3 U DSD (▲)，mean ± SD (

濃度を検索した（

Fig.

ピルビン酸生成を増加した。

10 µM

M PLP

を反応溶液に

Fig. 2-3

）。一定量の

_D-

量を用いる方が測定精度は増が直線関係である範囲内でのみ使用量を抑えることも必要である。その結果，

0.5 × 10^-3 U DSD

セリンを加えて，

DSD mean ± SD (n = 4)

(20)

による

_D-

セリンに対する検量線を作製した（

をコントロ－ルとした。有意差のある（

あった。

_D-

セリン量を

X

軸，

あり，非常に高い相関係数

生体内には通常

_D-

セリン濃度よりも圧倒的に高濃度のめに，この

_L-

セリンが測定時の

セリン濃度の約

10⁴

倍の

20 mM

に高濃度の

_L-

セリンが共存するときの検量線は共存しない時の検量線とほぼ一致したので，明らかに

_L-

セリンは反応に影響を及ぼさないことが判明した。（

r² = 0.997

）。

縦軸はコントロ－ル値を差し引いた値，

16

セリンに対する検量線を作製した（

Fig. 2-4

）。

_D-

セリンを加えていない状態をコントロ－ルとした。有意差のある（

p < 0.05

）

_D-

セリン検出限界値は

軸，

A450

を

Y

軸とした際の検量線の方程式はあり，非常に高い相関係数

r² = 0.999

が示された。

セリン濃度よりも圧倒的に高濃度の

_L-

セリンが存在しているたセリンが測定時の

DSD

反応に影響を与えていないかを，反応溶液に

20 mM L-

セリンを共存させて調べた。下図（

セリンが共存するときの検量線は共存しない時の検量線とほぼ一致しセリンは反応に影響を及ぼさないことが判明した。（

Fig. 2-4. D-

セリン検量線

縦軸はコントロ－ル値を差し引いた値，mean ± SD (n = 4)

セリンを加えていない状態セリン検出限界値は

200 pmol

で軸とした際の検量線の方程式は

y = 0.0328x

で

セリンが存在しているた

反応に影響を与えていないかを，反応溶液に

_D-

セリンを共存させて調べた。下図（

Fig. 2-5

）のよう

セリンが共存するときの検量線は共存しない時の検量線とほぼ一致し

セリンは反応に影響を及ぼさないことが判明した。（

y = 0.0323x

，

(21)

実際の測定試料に近い条件をつくるために，精巣無細胞抽出液（の量の

_D-

セリンを加えて，検量線を作製した（

0.167

，

r² = 0.997, Km = 0.145 mM

い値であった。また，

Fig. 2

た値であった。これらのことから無細胞抽出液は測定反応に影響を及ぼさないこと，

したがって無細胞抽出液中の

明された。このため，臓器の種類ごとに検量線を作製する必要性はなく，いろいろな臓器や組織中の

_D-

セリン量を測定することができる。このことは，ネズミ大脳の無細胞抽出液を用いて

_D-

セリン検量線を作製したところ，方程式は

Km = 0.137

とカイコガの精巣無細胞抽出液とほぼ同じ値が得られた

持される。

Fig. 2-5. D D-セリンのみ (●)，

17

実際の測定試料に近い条件をつくるために，精巣無細胞抽出液（

40 mg/mL

セリンを加えて，検量線を作製した（

Fig. 2-6

）。その結果は，

= 0.145 mM

となり，

Fig. 2-4

の反応の

Km

値

0.149 mM

Fig. 2-4

，

Fig. 2-5

，

Fig. 2-6

の方程式や相関係数も非常に似通った値であった。これらのことから無細胞抽出液は測定反応に影響を及ぼさないこと，

したがって無細胞抽出液中の

_D-

セリン濃度を正確に測定することができることが証明された。このため，臓器の種類ごとに検量線を作製する必要性はなく，いろいろなセリン量を測定することができる。このことは，ネズミ大脳の無細

セリン検量線を作製したところ，方程式は

y = 0.0316x

とカイコガの精巣無細胞抽出液とほぼ同じ値が得られたことによっても支

D-

セリン検量線（

_L-

セリン共存下）

，20 mM L-セリン共存 (〇)，mean ± SD (n =

40 mg/mL

）中に種々

）。その結果は，

y = 0.0322x +

0.149 mM

と非常に近

の方程式や相関係数も非常に似通った値であった。これらのことから無細胞抽出液は測定反応に影響を及ぼさないこと，

セリン濃度を正確に測定することができることが証明された。このため，臓器の種類ごとに検量線を作製する必要性はなく，いろいろなセリン量を測定することができる。このことは，ネズミ大脳の無細

y = 0.0316x

，

r² = 0.996

，

ことによっても支

= 4)

(22)

2.3.3

酵素法と

HPLC

法の測定値比較

Fig. 2-7.

酵素法と

Fig. 2-6.

18

法の測定値比較

酵素法と

HPLC

法の測定値比較（カイコガ中腸）

mean ± SD (n = 4)

. D-

セリン検量線（精巣無細胞抽出液中）

mean ± SD (n = 4)

（カイコガ中腸）

セリン検量線（精巣無細胞抽出液中）

(23)

カイコガ

5

齢幼虫，蛹，成虫の中腸の

2-7

）。酵素法と

HPLC

法で測定した

り，今回開発した酵素法の信頼性が確認された。

2.3.4

カイコガ臓器の

D-セリン測定

カイコガの成長に伴い内在て各齢のカイコガ中腸の

_D-

蛹まで徐々に増加した後，

5

けて減少した。

カイコガ

5

齢

5

日目幼虫，

5

定した（

Fig. 2-9

）。体液，中腸，卵巣，精巣

Fig. 2-8.

成長に伴うカイコガ中腸の

19

齢幼虫，蛹，成虫の中腸の

_D-

セリン量を酵素法と

HPLC

法で測定した（法で測定した

_D-

セリン量は，共にほぼ同じ値であった。以上より，今回開発した酵素法の信頼性が確認された。

セリン測定

カイコガの成長に伴い内在

_D-

セリン濃度はどのように変動するか，本酵素法を用い

-

セリン濃度を調査した（

Fig. 2-8

）。

_D-

セリン濃度は

5

日目にかけて急激に増加し，その後は羽化・成虫期にか

5

日目蛹，成虫

1

日目のいろいろな臓器の体液，中腸，卵巣，精巣（または卵巣），脂肪体に

成長に伴うカイコガ中腸の

_D-

セリン濃度変化

mean ± SD (n = 4)

法で測定した（

Fig.

セリン量は，共にほぼ同じ値であった。以上よ

セリン濃度はどのように変動するか，本酵素法を用いセリン濃度は

3

日目日目にかけて急激に増加し，その後は羽化・成虫期にか

日目のいろいろな臓器の

_D-

セリン量を測

，脂肪体に

_D-

セリンが高

セリン濃度変化

(24)

濃度存在すること，すなわち，カイコ体内ではこれらの臓器にることを明らかにした。

Fig. 2

2.4

考察

DSD

は，今までに大腸菌［

これらの酵素の基質特異性と酵素学的性質

Table 2-1. DSD

の基質特異性と酵素学的精室

ニワトリ

基質

Km

(mM)

D-

セリン

0.131

D-

スレオニン

0.312

L-

セリン

12.3

20

，すなわち，カイコ体内ではこれらの臓器に

_D-

セリンが分布してい

Fig. 2-9.

カイコガ

_D-

セリンの臓器分布

mean ± SD (n = 4)

は，今までに大腸菌［

19

］，酵母［

20

］とニワトリ［

16

］から精製されている。

これらの酵素の基質特異性と酵素学的性質を

Table 2-1

にまとめた。

の基質特異性と酵素学的精室

ニワトリ酵母大腸菌

kcat (s^-1)

Km (mM)

kcat (s^-1)

Km (mM) 0.811 0.39 13.1 1.3 0.0512 0.13 0.43 3.2

0.197 ND ND ND

セリンが分布してい

］から精製されている。

にまとめた。

大腸菌

Vmax

(µmol/min/mg) 300

50 ND

(25)

21

酵母

DSD

は

_D-

スレオニンに対して

_D-

セリンより高い親和性を持ち，大腸菌

DSD

は，

Vmax

値が示すように，

_D-

スレオニンにもかなりの活性を示す。ニワトリ

DSD

も

D-

スレオニンに反応するが，本法を用いて測定した結果，

1 µM D-

セリンは

A450 = 0.0025

，この

1000

倍も高濃度の

1 mM D-

スレオニンは

A450 = 0.002

であった。通常，

生体中の

_D-

スレオニン濃度はとても低いので，ニワトリ

DSD

の

_D-

スレオニンを分解する活性は測定に影響しないと考えられる。

_D-

セリンの定量にはニワトリ

DSD

が酵母や細菌の

DSD

より優秀な酵素であると言えよう。

D-

セリン濃度を測定するために酵母

DSD

を使う類似した方法［

21

］は，検出限界

が

2 µmol

で，検出限界

200 pmol

の今回開発した方法と比較すると感度は

10

倍低い。

近年，さらに感度の高い方法も報告されている［

22

］が，その方法では，蛍光物質と蛍光分光光度計が必要であり，コスト面に難点がある。今回開発した方法は，必要な光学機器は分光光度計だけである。感度が

2

桁高い

HPLC

法［

17

］は測定に

4

日間を要するのに比べて，本法では試料調製を含めても

1

時間で

_D-

セリン定量（測定所要時間は

30

分）を完了することができる。本法によって

_D-

セリンのスクリ－ニングが可能になるので，未測定の多くの生物の種々の臓器について

_D-

セリン含有量に関する情報を得ることができるようになる。また，医療分野にも貢献できることと期待される。

2.5

結論

本測定法の開発により，今までよりも短時間に，多量の試料の

_D-

セリンを同時測定できるようになった。今後，本法によりさらに多くの生物について

_D-

セリンが測定されることになれば，

_L-

アミノ酸ワ－ルドにおいて，

_D-

アミノ酸の一種である

_D-

セリンが生体において果たしている役割の解明に一歩近づける。

本測定法を

Journal of Chromatography B

に公表した

[23]

。

(26)

22

参考文献

[1] Corrigan, J. J., and Srinivasan, N. G. (1966) The occurrence of certain D-amino acids in insects. Biochemistry, 5, 1185-1190.

[2] Nagata, Y., Masui, R., and Akino, T. (1992) The presence of free D-serine, D-alanine and

D-proline in human plasma. Experimentia, 48, 986-988.

[3] Hashimoto, A., Nishikawa, T., Hayashi, T., Fujii, N., Harada, K., Oka, T., and Takahashi, K. (1992) The presence of free D-serine in rat brain. FFBS Lett., 296, 33-36.

[4] Nagata, Y., Horiike, K., and Maeda, T. (1994) Distribution of free D-serine in vertebrate brains. Brain Res., 634, 291-295.

[5] Srinivasan, N. G., Corrigan, J. J., and Meister, A. (1965) Biosythesis of D-serine in the silkworm, Bombyx mori. J. Biol. Chem., 240, 796-800.

[6] Uo, T., Yoshimura, T., Shimizu, S., and Esaki, N. (1998) Occurrence of pyridoxal 5'-phosphate-dependent serine racemase in silkworm, Bombyx mori. Biochem. Biophys.

Res. Commun., 246, 31-34.

[7] Kleckner, N. W., and Dingledine, R. (1988) Requirement for glycine in activation of N-methyl-D-aspartate receptors expressed in Xenopus oocytes. Science, 241, 835-837.

[8] Snyder, S. H., and Kim, P. M. (2000) D-amino acids as putative neurotransmitters: focus on D-serine. Neurochem Res., 25, 553–560.

[9] Nishikawa, T. (2005) Metabolism and Functional Roles of Endogenous D-Serine in Mammalian Brains. Biol Pharm Bul, 28, 1561-1565.

[10] Kantrowitz, J. T., Malhotra, A. K., Cornblatt, B., Silipo, G., Balla, A., Suckow, R. F., D'Souza, C., Saksa, J., Woods, S. W., and Javitt, D. C. (2010) High dose D-serine in the treatment of schizophrenia. Schizophrenia, Res., 121, 125-130.

[11] Heresco-Levy, U., Vass, A., Bloch, B., Wolosker, H., Dumin, E., Balan, L., Deutsch, L., and Kremer, I. (2009) Pilot controlled trial of D-serine for the treatment of post-traumatic stress disorder. Int. J. Neuropsychopharmacol. 12, 1275-1282.

[12] Hasegawa, Y., Okumura, M., Tojo, M., Nakagaki, M., and Nagata, Y. (2009) Developmental changes in D-serine level in the silkworm, Bombyx mori. J. Insect Biotechnol. Sericol. 78, 69-73.

[13] Hasegawa, Y., Ogawa, T., Nakanishi, M., Tojo, M., Okumura, M., Nakagaki, M,. and Nagata, Y. (2009)Effects of O-phospho-L-serine on the larval growth and development in the silkworm, Bombyx mori. J Insect Biotechnol. Sericol. 78, 75-79.

[14] Miyoshi, Y., Hamase, K., Tojo, Y., Mita, M., Konno, R., and Zaitsu, K. (2009) Determination of D-serine and D-alanine in the tissues and physiological fluids of mice with various D-amino-acid oxidase activities using two-dimensional high-performance liquid chromatography with fluorescence detection.J. Chromatogr. B, 877, 2506-2512.

(27)

23

[15] Miyoshi, Y., Hamase, K., Okamura, T., Konno, R., Kasai, N., Tojo, Y., and Zaitsu, K.

(2011) Simultaneous two-dimensional HPLC determination of free D-serine and

D-alanine in the brain and periphery of mutant rats lacking D-amino-acid oxidase. J.

Chromatogr. B, 879, 3184-3189.

[16] Tanaka, H., Yamamoto, A., Ishida, T., and Horiike, K. (2008) D-Serine dehydratase from chicken kidney: a vertebral homologue of the cryptic enzyme from Burkholderia cepacia. J Biochem. 143, 49-57.

[17] Tojo, M., Murakami, M., and Nagata, Y. (2011) Simple and low-cost high-performance liquid chromatographic method for determination of D- and L-amino acids. J.

Chromatogr. Sci., 49, 810-812.

[18] Bradford, M, M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein- dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254.

[19] Dupourque, D., Newton, W. A., and Snell, E.E. (1966) Purification and properties of D- serine dehydrase from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 241, 1233-1238.

[20] Ito, T., Hemmi, H., Kataoka, K., Mukai, Y., and Yoshimura, T. (2008) A novel zinc- dependent D-serine dehydratase from Saccharomyces cerevisiae. Biochem. J. 409, 399-406.

[21] Ito, T., Takahashi, K., Naka, T., Hemmi, H., and Yoshimura, T. (2007) Enzyme assay of

D-serine dehydratase from Saccharomyces cerevisiae. Anal. Biochem. 371, 167-172.

[22] Naka, T., Hemmi, H., and Yoshimura, T. (2010) A highly sensitive enzymatic assay for D- and total serine detection using D-serine dehydratase from Saccharomyces cerevisiae. J.

Mol. Catal. B: Enzym. 67, 150-154.

[23] Suzuki, C., Murakami, M., Yokobori, H., Tanaka, H., Ishida, H., Horiike, K., and Nagata, Y. (2011) Rapid determination of free D-serine with chicken D-serine dehydratase. J.

Chromatogr. B, 879, 3326‒3330.

カイコガ Bombyx mori の成長過程における