結核の化学療法研究
（第122報）
P−Amlnosalicy藍ic acid hydrazide（PASAH） に
封ずる人型結核菌の耐性獲得について
金沢大学医学部日置内科教室（主任 日置教授）
坂 井 俊 道
708ゐ劾Lic隔 ＆面癒 （昭和28年12月28日受附）
Chemotherapeutlc Studies in Tuberculosis．
Report 豆22．
The Drt屡g−fastness of酌ycobac重erlum加bercu夏osls，
var hominis， against p−Aminosa甚icylic acid hydrazide．
緒 嚢に吾が教室において合成されたP−Amino・
salicylic a，cid hydrazide（PA SAH）に関し著者 及び三崎1）2）の手により管内人型結核菌発育阻 止試験並びにSlide−cell−cu】ture試験が行わ れ，その著明な抗結核作用が知られるに至つ
：た．
本剤の毒性はINAHよりも少なく，その施 であり，動物の実験的結核症に対しても可成著
言
明な抗結核作用が証さ勇tたので3）臨床への応川 が期待せられるが，菌の本剤に対する耐性獲得 の問題が取残されていた．本研究はこれを解明 するために行われたものである。
なお試験には一般抗結核剤に対し感受性の高 い二型結核菌原株は勿論，その他PAS， SM及 びINAH耐性の各株が用いられた．
実 験 方 法 供試菌株：入型結核菌II 37 Rv株，そのPAS
（100Y／m1耐性）， SM（2，000Y／ml耐性）及びINAH
（100Y／ml耐性）耐性株，以上4株が使用された．
菌液調製：初代培養に供するための前記人型結核 菌4株の菌浮溝液は予めこれらを岡・片倉培地上に発 育せしむること約4週のものから20m9宛をガラス球 入り試験管に取り，生理的食塩水に懸濁（手振法によ る）し，1乃至2時聞灘置，その上澄液を実験に供し
た．
2代目からは2週間二二に既に初代の藥液含有培地 に充分発育せる菌苔を撮り（メヂウムを吸引し去る），
これにガラス小球を投じ，又新鮮なKivchDer培地を 注心してよく振勲し3同株菌漂游液を作製した．
培地：A）継代培地：所要濃度に藥剤を含有せ しめたる10％血1清加Kirclmer液体培地を使用す。
：B）耐性孚i」定用培地：同じく10％1血清加Ki・chne「
液体培地を使用．但し何ら藥剤を含有せしめざるもの
とす．
被検藥剤及び藥液調製：：P．AS， SM， INAH及び PASAHについて試験し，配剤原液の調製に当っては SMのみは滅菌生理的食呪水に，他は全部70％Ethano1 に溶解せしめた．
継代培養方法：前記4種の藥液を血清非添加Kir−
chner培地にて1Y／mlの濃度迄稀釈し，その3cc宛 を更めて同じく血清非添加1（irchner培地24ccと入 血清3ccを夫 々加え（この際藥剤含有濃度は0．1Y／m1 乏なる），よく混合し，各藥液別に12本の小試験管に 2cc宛分注した．
なお，PASとSM， SMとINAH及びPASと
INAHの如く藥剤を併用せる培地を作製するに当っ ては，上記0・1Y／m1の藥剤濃度を有する培地1cc宛 を夫々の組合せに從って小試験管に容れた，
以上藥剤含有培地夫 々に各株の菌俘游液を添加し，
370Cに2遇間培養した，
なお，培地の藥剤含有濃度は培養が度重なるにつ
れ，菌の二二に対する耐性度の上昇が招來せられるの で，第2表右欄に示せる如く，始めは0・1Y／mlであ っても，後1γ／ml位に迄漸増した．
耐性獲得度検定試験： 3代培養毎に，：全く前記の 如く，但し別の容器内において作製せる菌浮游液を夫 汝の藥剤を逓滅的に含有せしめたKirchner培地に1 滴（菌淑重二二0・1乃至0・2mg相当）宛投じ37。C に4週間培養した．この際，最高発育濃度を以て耐性 度を表わし3その濃度比を以て耐性の上昇倍数とし
た．
なお，これら試験に先立ち10％紐清加：Kirclmer 液体培地を使用して前記4株に対するSM，1 AS，
1：NAH， T：B−1， Sulzoin 7）， Sulfathiazo1，：PASAI｛の 発育阻止最大稀釈濃度を前記実験方法に準じ，検査し た．この際，菌液は三型培地に生えた集落より作製し，
藥剤原液の調製に当ってはT：B−1はPropylenglyco1 と等量の70％Ethano1に溶解せしめ， SMは滅菌生 理的食塩水に，他は全部70％Ethanolに溶解せしめ
た．
実 験成績
A）H37 Rv株及びその諸耐性株に対する PASAHの管内発育阻止作用：第：1表に示す 如くH37 Rv株そのものに対してはPASAH はINAHに等しきか叉はとれよりも優i生な阻 止力を示し，〜これに次ぐ強力なものをSM，
：PAS続いてSulzolinなりとする．但し1）AS耐
り性株に対しては：：PASAHの発育阻止力は：甚だ 低下する．即ちPA SAH：の構造はH：ydrazine
第1表
基を持つけれども，耐性を獲得せしめる点では PASと態度を等しくする如くである．
PAS耐性株に対してはIHAHが依然最も張
力で，Sulzolin， SMが〜これに次ぐ〜二とは予が嘗 って報じた如くである6）．
次いでSM耐性株並びにINAH耐性株に対 してはPASAHは何れも0．12γ／mlでその発 育を阻止し得る．IHAH耐性株に対して1 AS
H37Rv株並びに各種耐性株に対する 諸抗結核剤の発育阻止作用
藥剤 結核菌発育阻止最大稀釈濃度（γ／m1）
H37Rv株
SM PAS
INAII
T：B＿I Sulzolin Sul「atlliazoI
PASAH
1 1 0，1
25
2．5 125 0．1
欝騰臨R膿i黙喉
1 125 0．12 125 1 50 50
4．000 0．5 0．012
50
5 125 0．125
0．25 0．25 125
50 5 50 0．12
第 1 図
唖H37・・株［＝翁面
∵…：：…@｝鞭麟醗認翻罷争鵡鰭
人型結核菌発育阻止帯比較
藥 剤
（γ／mi）
P㎝ 500 250 125 100 50 Z5 12．5 10 5 25 t25 1 0．5 0．25 0．125 0Ll O」｝50．OZ50．0医2090
：㍗∵・・・ノ・：8・㌔∵．．，・∴・ ∴・f％・ちべ・ち㌔＝悌
S M
で二，；、8 質ん
PAS
：・引．．・＝・・；・・∴・協∴・∴鵜・＝∴。・＝・・；・かン。ア・・・＝、ゴ●3・㌦
互NAH
rB−1 ・：4＝規㌔；ゴ4
＝：ち甲．∵二・㌔㌦く」∵．・y∴・・・・・琶．・く；・ ∴昌・；・＝
Sulzolin
％；・＝㍗＝；一ち，二
Sulfathiazo1
PASAH ち∴∵、◎鯖む；㌦．．壱」∴
乃至SMが感受性株に対するより強力にその 発育を阻止するが，1 ASAHのそれは一暦強力 である〜二とは注目に値する．
：B）H37 Rv株及びその諸耐性株のPASAH
（及びその他諸抗結核剤）に対する耐性獲得：
各株の耐性獲i得歌況を一括して第2表に摘げ
：た．
1）H37 Rv株の場合
本株はPASAHに対して容易に耐性を獲i得 し難く，15代後に漸く25γ／mlの耐性を示す 程度で，その耐性度は比較的耐性を獲i得せしめ 難いといわれるPASよりも遙かに低位にあっ
た．
とれに反しSM， INAHに対しては幾多の業 績4）5）9）に示された如く，容易に，且つ早期に 耐性を獲得し，15代後にはSMに対し500γ／
m1， INAHに対し100γ／1n1程度の耐性を示し
た．
2）PAS耐性株の場合
本株はA＞の項に述べたように継代前既に PA SAHに対し25γ／ml耐性を有し，15代後に はSM， INAHと同じく高度の耐性を獲i得し
．た．（第2図，第4図参照）
：叉，本株はH37 Rv株と同様にSM， INAH に対し9代迄急速に耐性を獲得したが，以後な お漸増して15代目には両者等しく100γ／m1耐 性を示した．
3）SM耐性株の場合
PASAHに対しては：H37 Rv株と同様，容 易に耐性を獲得せす，15代後に漸く5γ／ml耐 性を示すに過ぎなかった．（第3図，第5図参
照）
ヒれは同株が同数の継代培養においてPAS に対し50γ／ml， INAHに対し125γ／mlの耐
第 2 表
藥剤 1『継II 結核菌発育最小稀釈濃度（Y／mi）
PAS
SM
INAH
代
13691215136912151369皿15
H37Rv株 PAS耐性
H37Rv株
瀞無塞iI鵬振蟹
0．5 0．5 1．25 5 25 25（50）
0．25 0．5 1 2．5
50 50（200）
0．125 0．125 0．5 5 12．5
50（400）
継i代培地の 巳時含有濃度
（γ／ml）
0．5 1 5 100 125 500 （1．000）
0．25 0．5 2．5
25 100 100 （400）
＼ 2．000 ＼ ＼
＼ ＼
0．1 0．1 0．5 0．5 1 1
0．05 0．125 2．5
50 100
100 （2．000）
』0．025 0．1 1
50 100 100 （4．000）
PASAH
136︑9 0．125
1．125 0．25 0．5 1 2・5（20）
25 25 50 50 100 100（4）
SM
INAH
PAS
・INAII
il ＼
＼100・000
1
51
8 11 1；1511
0．125 1 0．1
0．5 0．1 5 0．5 25 0．5 50 1
50 （400） 1
0．01 0．125 1 25 125 125（12．500）
100
0．1 0．125 0．25 0・5 2．5 5（50）
INAH．
0．025 1．25
50 100
＼ 100
＼、
@＼＼＼・．﹄ ＼ ＼︑ ︑＼＼ ＼＼＼ ＼︑ ＼︑1 ＼＼ ＼1
l
戟u
＼．
1．NA宜 』
0・01
1 100 500 500
0．1 0．1 0．25 0．5 2．5 10（100）
＼ ＼
＼
0．1．
0．1
0．「5
0．5 1 1
0．ユ
0．1 0．1 0．1 0．5 1
PAS
SM
註
ln1
151
158
I
l
（…）「1内な耐性上昇借数．
やIA、S ヤ9
0．25 1 10 25，
50
＼
＼
旧臣
10・05＋0・05
10．5 →一 〇．5 11・．5＋・．5 1｝・＋・
撚s hs翫 「A菖…闇Si『
0．125 0．125 0．05 十 〇．05 1 12．5 0．05十〇．05 1．25 50 0．5 十 〇．5 10 50 0．5 十〇．5
25 5・［・＋・
SM INAH
O．05 十・0．05 0．05 十 〇．05
0．5十〇．5 0．5 十〇．5
1 十1
第 2 図
100，000
1．000 500発 250育 濃 100 度 50
259ソmD 田 5 2，5 1 0．5 0．25 0，1 0。05 0．025
o
PAS耐性（100rlml）
H37Rv株
／︑膨
／！
AsM
」⊃IN八H 一勘PAS．・、H
SM
LOOO 500 250 100発育
50濃
25度
10
（ドmi）
5 2。5 1
H37Rv セ朱 SM
INAH
ノ ノ ノ ぐ ！ノ ノ／
チ／
／／
ノ
／
！ノノ
1
ノ
125456789101112151415
獲 得 継 代
0．5 0．25 0．1
0．05 0，025
PAS
βPASAH
1 2 5 4 5 6 7 8 9 101112131415 獲 得 継 代
tOOO 500 250 1go
発
50育 25濃
10度
． 5
（γノ㎞i）
2．5 1 0．5 0．25 0．1 0．05 0。025 0．01 0
第
コ
S｝，1 而」躯｛二 （2，000〆ド1111） IN∠㌧H H37RY譲朱 ／鐙．一需｝一匿一一7一璽
ノ
／ 【NAH ノノ
／ ，邑、
／ ノ飛／㊨
ノ、Z
／／ ・ジシ
．影
，イ
！ ，
−O
〆
！／口 5
性を得たることと比較すると遙かに低V・耐性を 示すものである．
3 区
1，000 500 250 100 50発育
25濃 10度 5（γ／ml）
2．5・
1
0．・5 ・0．25 0．1 0．05 0．025 0．01 0
INド＼H耐性（190〃m1）
H37Rv 糠
，！
／
←
〆
／、
◎
s笹…
み ムノ
／ 諺彬，寧◎
／ ダ
7＼適診
夕
15
1415
12
110代一9継
6の0確 7イ 穿8 4 5 2 5 1
なお，しかし更にヒれを詳細に検するに INAHに対しては前2株と同檬に早期に高度
耐性上昇倍数
10，000
㌔5，000
1、000 500
1GO 50 25 10 5
041
H37Rv撃
払
INAH 4
耐性上昇倍数 図
400 000P
PAS
♀爵
125456789101112151415
継 代 数
10，000 5，000
1，000 500
期 50
0︻ロー0∴像1
夕 寧
・A・・酬・（1・・〃・・） 〆
H37kv株 ノ
， INAH層
ノ艇一 一。一一一 ，
！
SM ／分
〆ノ ／
●PASAH
5 14 15
1211数
9代 10
7継 8 6 4 5 2 5
耐性・上昇︑倍数
50，000
H37Rv株
12，500 10，000 5，000
LOOO
500 ／ ／
100 男 50 ／ 25
10 ！ ノ
ノ ノ
5 ， ／
， ，㊦
！ ， ノ
2 ！昭
1
SM耐性（2，0007／mD ， ノ
デ
／ ！
﹁
PAS
コ の の
／◎ vAS
ノノ
／／炉
第 5 1NAH
戸一 凹一一一一一鰯
，
ノ
INAH
1254567891011121151415
継 代 数
の耐性を獲得しており，9代後に既に25γ／1n1 の耐性を示したが，PASに対しては9代迄徐々 に，以後急速に耐性を得ていることが注目され
る．
4）INAH：耐性株の場合
本株のSMに対する耐性獲得はPASに対
図
10，000 5，000
1，000 500
100 50 25 10 5
0乙−
【NAH耐性（100r／ml）
H37Rv株
△喩瞬一曹一儒r●P一
ノ
1
SM
41
〆 ゴ ノ ， 一⑨
ノ ◎一一P ρ
虜／
拶
3，＠
＠ で八s ， 娩
／3
ユ
123456789101112151415
継 代 数
するそれよりも早く，15代後には50γ／1P1の耐 性を示した．しかし：H37 Rv株及びPAS耐 性株に比べるとそのSM耐性度はこれらの駈。
乃至絶であった．（第3図，第5図参照）
然るにPASAHに対する本株の耐性は，H37 Rv株及びSM耐性株に比し比較的高度の耐性
を獲得しπとはいうものの，なお10γ／mlで，
PAS， SMに対するよりも耐性度はその％に過
ぎない・，
C＞藥剤併用培；地使用にお・ける耐性獲i得同じ く第2表にその結果を揚げた．
1）1）AS耐性株をSMとINAH併用培地に 継代培養せる場合，SM耐性は早期に獲得さ れ，耐性度は非常に高度で，15代後に100，00 γ／m1でも菌の発育を示し， INAHに対しても 100γ／m1耐性を得た． H 37 Rv株をSMと 1：NAH併用培地に継代せし場合， INAHに対 する耐性度はINAH軍独培地に継代せし場合 と変らなかったと堂野前教授9）は報告してい るが，PAS耐性株におV・ても両剤の併用によ り耐性の防止作用は全く認められす，寧ろ促進 され，たようである．
2）SM耐性株をPASとINAH併用培地に 継代せしめた場合，INAH：耐性はPAS併用に より反って促進せられ500γ／mlの高度耐性を
獲i得した．
3）INAH：耐性株を・PASとSM併用培地に 継代せしめた場合，感受性株については，
Grassle 8）等によりSM耐性防止にはPASを 併存せしめた培地申での継代が著明な効果を示 すというととが報告されているが，本実験にて
INAH耐性株のSM耐性出現をPAS併存に
より寸延或いは防止し得す，輩独同様に15代後 に50γ／ml耐1生を示し，同時にPASに対して も25γ／ml耐性を獲得するととを知った．
な胎以上1）2）3）三つの経路によりPAS，
SM，1：NAH三者全部に耐性を有する株（全耐 性株と仮称する）を実験的に作るととが出面た が，就中，PAS耐性株をSM， INAH：併用培 地に継代培養して得たものが，何れの場合にお けるよりも油剤に対し速に且つ高度に耐性を獲 得することが判明した．斯くて得られた全耐性 株は100γ／ml PAS耐性，10qOOOγ／ml SM耐 性， 100γ／ml I：NAH耐性を示した．ヒれが病 原性の有無に関しては目下同僚により追及され つつある．
総括並びに結論 虚誕結核菌H37 Rv株とそのPAS， SM及
びINAH耐性株をP−Aminos翫1icylic acid hyd−
razide（PASAH），外各種抗結核剤を含有鷺る 増：地に継代培養し，各藥剤に対する耐性獲得歌 況を検査し，次の如き結果を得た．
1）PASAHに対しPAS耐性株が継代前，
既に中等度耐性を示す以外，H37 Rv株， SM 耐性株，1：NAH耐性株何れも継代前には高度 の感受性を有し，PASAH含有増地に15代継代 せる後にもその耐性獲得度は極めて軽微であっ
た．
2）PASに対して諸菌株は一般に耐性を獲得 し難いというものの，本実験において示される ようになお申等度耐性を獲得する．
3）SMに対し， INAH耐性菌が庭藤度耐性 を得，他の株は何れも高度耐性を早期から獲得
した．
4）INAHに対し何れの株も15代継代後100 γ／m1以上の高度耐性を獲得し，耐性上昇は何 れの電着に対するよりも早期に認められた．
5）PAS耐性株， SM耐性株及びINAH耐 性株を夫々SMと1：NAH， PASとINAH及 びPASとSM併用培地に継代培養せしめた
：場合，何れも併用による耐性獲得速度の逞延は 認められす，寧ろ促進されたものさえ認められ
た．殊にPAS耐性株をSMとINAH併用培
地に継代せしめた場合，最も迅速にPAS， SM 及びINAH 3剤共に対し耐性を獲i得し，その
耐性度も最も．著明であっ允．
摺木するに臨み，終始御懇篤なる御指導と御校閲を 辱うせる恩師日置敢授に深甚な：る謝意を表す．
文 1）三崎・坂井：医学と生物学，25，28，1952・
2）三崎：十全医學会雑誌：へ，55，1059＆1065，
1953． 3）安井：十全医学会雑誌，54，514，
1953， 4）Steeken， Tr． M・a， o・：Arn， Rev・
Tbc．，65，759，1952． 5）Ruck， M．＆Sch−
nitzer， R． T．： Am． Rev． Tbc．，65，759，1952．
献
6）坂井：金大結核年報，11，1，39，1953・
7）田中：、金大結核年報，8，1，67，1949・
8）Gra寧sle，0・E・＆Pietr・wsKiJ・」・：
Streptomycin and Dihydrostreμomycin in Tuberculosis，527，1949・ 9）堂野前：臨 床，5，9，843，1952・
