西 憲祐 学 位 の 種 類

氏 名 ^{にし けんすけ}

西 憲祐

学 位 の 種 類

博士（医学）

報 告 番 号

甲第

号

学位授与の日付

令和

年

月

日

学位授与の要件

学位規則第

条第

項該当（課程博士）

学 位 論 文 題 目

ROS-induced cleavage of NHLRC2 by caspase-8 leads to apoptotic cell death in the HCT116 human colon cancer cell line

（カスパーゼ 8 による、活性酸素が誘導する NHLRC2 の切断は、

ヒト大腸がん細胞株 HCT116 細胞のアポトーシスを引き起こす）

論 文 審 査 委 員 （主 査） 福岡大学 教授

安永 晋一郎

（副 査） 福岡大学 教授

宮本 新吾

福岡大学 講師

本田 啓

内 容 の 要 旨

【目的】

ヒドロキシラジカルやスーパーオキシドアニオンをはじめとする活性酸素種(ROS:

reactive oxygen species)は、酸素を消費する様々な代謝経路によって細胞内で常に産 生されている。生成された ROS の大部分は抗酸化物質や抗酸化酵素の働きにより除去さ れ、細胞内の ROS レベルは厳密にコントロールされている。過剰な ROS の蓄積、すなわ ち酸化ストレスは DNA や脂質、タンパク質などの酸化を引き起こし、それらの機能を傷 害する。臨床的にも酸化ストレスは糖尿病や動脈硬化などの生活習慣病をはじめ、が ん・アルツハイマー病など様々な疾患の発症と進展に深く関わっていることが明らかに されている。

様々な代謝経路の活性化およびミトコンドリアの機能障害などにより、がん細胞にお いて細胞内 ROS レベルが上昇していることが知られており、がんの発生や進展に ROS が 深く関与していると考えられている。また、がん細胞は細胞内の ROS レベルの上昇に対 して、正常細胞よりも感受性が高いことが知られている。すなわち、元々ROS レベルが正 常細胞よりも高くなっているために、がん細胞は更なる ROS レベルの上昇による細胞死 を起こしやすくなっていると考えられている。実際、放射線治療をはじめとする多くの がん治療法において、ROS 産生によるがん細胞への細胞死の誘導は広く用いられている。

しかしながら、ROS が細胞死を誘導するメカニズムについてはいまだに不明な点も残され

ている。

本教室では以前、転写制御分子 Zfat (zinc-finger protein with AT-hook)が NHLRC2

（NHL-repeat-containing protein 2）の発現を制御していることを明らかにしたが、

NHLRC2 の機能と生理的役割については全く調べられていない。本研究において私は、ヒ ト大腸がん細胞株において、ROS によりアポトーシスが誘導される際に、NHLRC2 のタン パク質レベルが著しく低下することを新たに見出した。NHLRC2 は N 末端にチオレドキシ ン様ドメインを有することから細胞内酸化還元レベルの制御に関与していることが予想 された。そこで私は、ROS により誘導されるアポトーシスにおける NHLRC2 の役割を明ら かにするために、本研究を遂行した。

【対象と方法】

ヒト大腸がん細胞株 HCT116 細胞は 10% FBS を含む DMEM 培地中、5% CO2、37 ºC で培養 した。酸化ストレスは酸化剤 tert-butyl hydroperoxside (tBHP)により誘導した。アポ トーシス細胞の割合は、細胞をアネキシン V と propidium iodide による染色後、フロー サイトメトリーにより解析した。各タンパク質の発現量は特異抗体を用いたウェスタン ブロッティングにより解析した。また、shRNA または CRISPR-Cas9 を用いて、HCT116 細 胞の NHLRC2 をノックダウンまたはノックアウトすることにより、tBHP による HCT116 細 胞のアポトーシスの感受性の変化を解析した。

【結果】

HCT116 細胞を酸化剤 tBHP で 24 時間、処理することにより、tBHP 濃度依存的に NHLRC2 タンパク質レベルが低下し、アポトーシスが誘導された。抗酸化剤である N-acetyl-L- cysteine の前処理より tBHP による NHLRC2 の減少が抑制されたことから、tBHP が ROS 産 生を介して、NHLRC2 タンパク質レベルの低下を引き起こしていることが明らかになっ た。アポトーシスの誘導にシステインプロテアーゼであるカスパーゼが重要であること がよく知られている。実際、HCT116 細胞を tBHP 処理すると、様々なカスパーゼの活性化 が認められた。そこで、カスパーゼ阻害剤である z-VAD-fmk の影響について検討したと ころ、tBHP による NHLRC2 の減少が有意に抑制され、酸化ストレス下においてカスパーゼ が NHLRC2 を切断する可能性が示唆された。さらに検討を行い、tBHP 処理により、カスパ ーゼ 8 が NHLRC2 を 580 番目のアスパラギン酸の後で切断することが明らかとなった。ま た、NHLRC2 はそのチオレドキシン様ドメインでカスパーゼ 8 と相互作用することも判明 した。shRNA または CRISPR-Cas9 を用いて、NHLRC2 をノックダウンまたはノックアウト することにより、HCT116 細胞が tBHP によるアポトーシスに対してより感受性になったこ とから、NHLRC2 は酸化ストレスによるアポトーシス誘導に対して抑制的に働いていると 考えられた。

【結論】

これまで機能未知タンパク質であった NHLRC2 が、がん細胞における酸化ストレスによ るアポトーシス誘導機構において重要な役割を担っていることが明らかになった。

NHLRC2 の発現レベルを低下させることにより、がん細胞が酸化ストレスによるアポトー シスを起こしやすくなったことから、NHLRC2 はがん治療における新たな標的分子となる 可能性が示された。

審査の結果の要旨

本論文は、活性酸素分子種（ROS）に誘導された、カスパーゼ 8 による NHLRC2（NHL- repeat containing protein 2）チオレキシントン様ドメインタンパク質の切断が、ヒト 大腸がん細胞株 HCT116 においてアポトーシスによる細胞死をもたらすことを示した論文 である。

NHLRC2はハエからヒトに至る生物種に存在し、そのアミノ酸配列は高度に保存されてい る。しかし、NHLRC2に関する報告は少なく、その機能に関しては不明であった。申請者は、

チオレドキシン様ドメインを有することから、NHLRC2が細胞内酸化還元レベルの制御に関 与しているのではないかという仮説を立て、酸化ストレスにより誘導されるアポトーシス におけるNHLRC2の役割の解明を目的として本研究を行った。本研究において、ヒト大腸癌 細胞株HCT116細胞において、酸化ストレスにより活性化されたカスパーゼ8が、NHLRC2を 切断することを明らかにした。更に、NHLRC2の発現低下が、酸化ストレスにより誘導され るアポトーシスの進行に重要であることを明らかにした。以上の結果から、申請者はこれ まで機能未知であったNHLRC2が、酸化ストレスによるアポトーシス誘導機構において重要 な役割を担っていることを新たに発見した。

本論文の斬新さ、重要性、実験方法の正確性、表現の明瞭性は以下のとおりである

1. 斬新さ

申請者は、これまで機能未知であった NHLRC2 について、そのドメイン構造から、細胞

内酸化還元レベル制御に関与する機能を推測し、ヒト大腸癌細胞株 HCT116 細胞を用い

た NHLRC2 の機能解析を行った。その結果、HCT116 細胞における酸化ストレスによる

アポトーシス誘導には、カスパーゼ 8 による NHRLC2 の切断が重要であることが明ら

かとなり、NHLRC2 の発現低下により、がん細胞の増殖が抑制されることも明らかにな

った。これらの解析の結果、機能未知であった NHLRC2 の機能の一端が解明された。上

記内容は先行研究を検討・吟味した上で、新しい発想に基づく研究であると認められ

る。

2. 重要性

放射線照射や抗がん剤などのがん治療法は、がん細胞内に活性酸素の産生を誘導する ことで、アポトーシスを引き起こすことが知られている。本研究において、NHLRC2 の 発現を低下させることで、酸化ストレスによるアポトーシス感受性が亢進することが 明らかになった。従って、がん細胞において NHLRC2 の発現低下を誘導する化合物は、

がん治療法の抗腫瘍効果を増強すると考えられることより、NHLRC2 ががん治療におけ る新規ターゲット分子となる可能性が示された。よって、本研究は学術的意義を有す るとともに発展性があり、かつ社会に貢献する可能性があると考えられる。

3. 実験方法の正確性

実験結果は、いずれも最低 3 回の実験を行い、再現性を確認している。遺伝子導入実 験に関しては、全ての発現ベクターについて DNA シークエンスで配列を確認した。

NHLRC2 とカスパーゼの相互作用に関して、免疫沈降法で共沈降すること、免疫染色で 共局在することで確認した。ヒト大腸癌細胞株 HCT116 細胞において、NHLRC2 の発現 低下を誘導するために shRNA と CRISPR-Cas9 を用いた実験を行い、両実験方法におい て、NHLRC2 発現低下により、酸化ストレスによるアポトーシスが亢進し、細胞増殖が 抑制された。NHLRC2 発現低下による影響は、ヒト胎児腎細胞株 HEK293 細胞において 解析し、HCT116 細胞と同様に酸化ストレスによるアポトーシスが亢進することを確認 した。以上より研究方法は適切かつ正確であると判断できる。

4. 表現の明瞭性

申請者の所属する研究室において解析が行われている Zinc-Finger protein with AT- hook （ZFAT）が直接転写を制御する遺伝子の 1 つとして NHLRC2 が同定された。当時 NHLRC2 の機能は全く未知であるという背景の中、NHLRC2 の酸化還元レベル制御機構へ の関与を推測し、酸化ストレスにより誘導されるがん細胞のアポトーシスにおける NHLRC2 の役割の解明を目的として研究を行った。始めに、ヒト大腸癌細胞株 HCT116 細 胞において、酸化ストレスは、カスパーゼカスケードを介したアポトーシス、および NHLRC2 発現低下を引き起こすことを明らかにした。更に、酸化ストレス誘導時にカス パーゼ 8 が NHLRC2 を切断することを明らかにした。最後に、NHLRC2 の切断による発 現低下が、酸化ストレスによるアポトーシスの進行に重要であることを明らかにした。

本研究の流れは明瞭であり、論理展開にも整合性が認められる。

5. 主な質疑応答

学位申請論文の内容の発表の後、以下の質疑応答が審査員から申請者に対し行われた。

Q1:

活性酸素により誘導されるカスパーゼの活性化について、全てのカスパーゼアイソフォー

ムに関しては検討していないのは何故か？

A1:

ここでは活性酸素により誘導されるカスパーゼの経路が、カスパーゼ 9 が関係する内因系 なのか、カスパーゼ 8 が関係する外因系なのかを検討しており、全てのカスパーゼでは解 析していない。実験結果から、内因系と外因系の両方に関与していることが示された。

Q2:

使用した細胞で、全てのカスパーゼアイソフォームの発現は確認できたか？

A2:

HCT116 細胞ではカスパーゼ 1，5，10 を除くカスパーゼの発現が確認できた。

Q3:

カスパーゼ 8 はイニシエーターカスパーゼであるが、エフェクターカスパーゼ以外のタン パク質を切断することはあるのか？

A3:

カスパーゼ 8 が、エフェクターカスパーゼ以外の様々なタンパク質を基質として認識し、

切断するという報告は既に多数ある。

Q4:

活性酸素によるアポトーシスは主にミトコンドリアを介した内因系経路が関与している と考えられているが、外因系経路であるカスパーゼ 8 が活性酸素の刺激で活性化されるの か？

A4:

白血病細胞 HL-60 において、活性酸素はカスパーゼ 8 を活性化するとともに、シトクロム c 放出とカスパーゼ 9 の活性化を誘導することが報告されている。また、活性酸素により マウスの腸上皮細胞の Fas および Fas-L の発現が誘導されたという報告もあり、活性酸素 刺激によって内因系・外因系両方のカスパーゼ経路が活性化することが分かってきている。

Q5:

NHLRC2 の発現が増えると活性酸素産生は抑制されるのか？

A5:

本研究では、細胞内の活性酸素の産生の確認は行っていない。活性酸素の産生を検出する キットがあるので、今後行う予定である。

Q6:

NHLRC1 はどのような遺伝子なのか？

A6:

NHLRC1 は C 末端側には NHLRC2 と同様に NHL リピートドメインを持つが、N 末端側にはチ

オレドキシン様ドメインではなく RING フィンガードメインを持っておりユビキチン化に 関与すると考えられている。NHLRC1 は、細胞内でのグリコーゲンの代謝に関与していると いう報告がある。また、 NHLRC1 遺伝子変異がてんかん発症に関与するという報告がある。

Q7:

NHLRC2 は細胞内のどこに存在しているのか？

A7:

免疫染色で NHLRC2 は細胞質内に存在することを確認している。それ以上の詳細な解析は、

今回は行っていない。

Q8:

NHLRC2 は細胞内で通常どのような働きをしているのか?

A8:

NHLRC2 発現抑制細胞では、酸化ストレスの有無にかかわらず、細胞増殖が抑制された。通 常、チオレドキシンは細胞内で ASK1 と結合しており、ASK１の活性化によりアポトーシス を阻害している。チオレドキシン様ドメインをもつ NHLRC2 がチオレドキシンと同様に他 のタンパク質の働きを制御し、細胞増殖に影響を与えている可能性があると考えるが、本 研究では NHLRC2 より下流の解析は行っていない。

Q9:

NHLRC2 発現抑制細胞の増殖抑制効果はアポトーシスが原因と考えるか？

A9:

チオレドキシンの発現低下が、インテグリンが関与する細胞周期の進行を阻害すること が知られている。NHLRC2 の発現低下により、酸化ストレスを加えなくても細胞増殖が抑 制されたことから、NHLRC2 にも細胞周期を調節する何らかの働きがあることは十分考え られる。

Q10:

切断された NHLRC2 が、生細胞でのウェスタンブロッティングでは検出されていないが、

何故か？

A10:

切断された NHLRC2 がさらに速やかに分解されたことで、検出できなかったと考える。本

研究では、24 時間、酸化ストレス下で培養後、細胞を回収し、解析を行っている。より

早いタイミングで回収することにより、切断された NHLRC2 が検出できた可能性もあると

考える。

Q11:

NHLRC2 発現抑制細胞に対する抗癌剤エトポシドの効果を示しているが、強力な効果では 無い、どう考えるか？

A11:

エトポシドのアポトーシス経路は内因系カスパーゼ経路がメインであると考えられる。

NHLRC2 ノックダウン細胞に対するエトポシドの効果が強力ではないことに関しては、

HCT116 細胞において、NHLRC2 が関係するカスパーゼ経路が主に外因系であるからではな いかと推測する。

Q12:

HCT116 細胞以外の細胞では実験を行わなかったのか？

A12:

本研究では、当教室で様々な解析に用いているヒト大腸がん細胞株 HCT116 細胞で主に実 験を行った。また、ヒト胎児腎細胞株 HEK293 細胞においても NHLRC2 発現低下は、酸化 ストレスによるアポトーシスを亢進させることを示した。

Q13:

その他のがん細胞でも NHLRC2 を介した同じ現象が起こると考えるか？

A13:

NHLRC2 に関する報告はまだ少なく断言はできないが、がん細胞での NHLRC2 の発現は正常 細胞に比べて高いことが報告されており、HCT116 細胞以外においても、NHLRC2 がアポト ーシスの経路に関与している可能性はあると考える。

Q14:

その他の細胞では、カスパーゼ 8 以外のカスパーゼが NHLRC2 を切断している可能性はあ るか？

A14:

本研究でカスパーゼ 1,8,9 が NHLRC2 を切断することを示しており、細胞や刺激が変われ ば、カスパーゼ 8 以外のカスパーゼが NHLRC2 切断に関与する可能性は十分考えられる。

Q15:

NHLRC2 発現低下が抗腫瘍効果を増強するという働きは、生体で応用できるのか？

A15:

近年、遺伝子サイレンシング治療の研究開発が進んでおり、臨床で役立つ可能性もある

と考える。遺伝子に対する siRNA を脂質ナノ粒子に封入した治療薬が FDA に承認された

例もある。がん細胞は葉酸の取り込みが高いため、脂質ナノ粒子の周囲に葉酸をつけて

癌細胞特異的に遺伝子抑制することが可能であるという報告もある。

Q16:

NHLRC2 はがんに対して抵抗性を示す遺伝子なのか？

A16:

本研究により、NHLRC2 の発現低下が細胞増殖抑制およびアポトーシス感受性亢進を誘導 することが分かった。よって NHLRC2 はがんにおいては治療抵抗性を示す遺伝子であると 考える。

Q17:

他の抗酸化剤は使用した実験は行っていないのか？

A17:

本研究では抗酸化剤として、NAC のみを使用した。NAC は主要な抗酸化物質であるグルタ チオンの前駆体である。

Q18:

抗酸化物質は複数存在するが、チオレドキシンはどの程度重要なのか？

A18:

通常の細胞内での酸化還元に重要なのはグルタチオンと言われているが、がん細胞にお いてチオレドキシンは発現が亢進して抗酸化因子として重要な働きをしているという報 告がある。ただし、グルタチオンの効果を上回るものではないと考える。

Q19:

フローサイトメトリーでアネキシン V 陽性細胞をアポトーシス細胞としているが、その 領域にはネクローシス細胞も含まれるのか？

A19:

アネキシン V 陽性細胞のうち、propidium iodide 陰性を早期アポトーシス細胞、

propidium iodide 陽性を後期アポトーシス細胞と定義した。しかし、我々がアポトーシ ス細胞と定義した領域の中にもネクローシス細胞は存在することは否定できない。薬剤 反応時間を短くした実験も行うべきだったかもしれない。

Q20:

薬剤の反応時間はそれぞれどのくらいか？

A20:

tBHP は 24 時間、NAC と zVAD の前処理は１時間行った。

Q21:

免疫染色でカスパーゼ 2、8、10 は NHLRC2 とアグリゲートしているのは何故か？

A21:

アグリゲートする原因は分からない。しかし、このアグリゲーションした免疫染色写真に よってカスパーゼと NHLRC2 が細胞内で共局在するのは間違いないと考えた。

以上の内容の斬新さ、重要性、実験方法の正確性、表現の明確さ、及び質疑応答の結果

を踏まえ、審査員で協議した結果、本論文は学位論文に値すると評価された。