Key words: Human immunodeficiency virus (HIV) infection, Hemophilia, acquired immuno deficiency syndrome (AIDS), AIDS-related complex (ARC), Pneumocys

昭 和62年8月20日 ₈₆₅

血 友病 患 者 にお け るAIDS関

連 検 査 の成 績

Key words: Human immunodeficiency virus (HIV) infection, Hemophilia, acquired immuno

deficiency syndrome (AIDS), AIDS-related complex (ARC), Pneumocystis carinii (P. carinii) infection

要 旨

血 友 病 患 者 を 対 象 と した 診 療 を10ヵ 月 間 行 い,HIV(Human Immunodeficiency Virus)に 関 す る 検 査 を35例 で 実 施 した の で,そ の検 査 成 績 と臨 床 症 状 を 報 告 す る.HIV抗 体 陽 性 例 は18例(53%)で,こ の 中 に は1例 のAIDSと3例 のARCが _{含 ま れ て い た .こ の うちARCの2例 と1例 のAIDS患 者 か ら}

ウ イ ル ス を 分 離 す る こ とが で き,電 顕 法 で ウ イ ル ス 粒 子 を 確 認 した.免 疫 検 査 で は,免 疫 グ ロ ブ リン は 増 加 して い る例 が 多 く,カ リニ肺 炎 の 病 原 体 で あ るP.cariniiに 対 す る抗 体 価 も上 昇 して い た. 緒 言 1981年5月 にAIDSが 初 め て 報 告 さ れ1),そ の 後1983年 に フ ラ ン ス のPasteur研 究 所 のMontag-nierら の グ ル ー プ に よ り同 性 愛 患 者 か らlympha-denopathy associated virus(LAV)が 分 離 さ れ2), 相 次 い でU.S.A.のNIHのGalloら もAIDS患 者 か らhuman T-cell leukemia/lymphoma virus III(HTLV-III)を 分 離 し た3).こ の よ う に し て AIDSは 伝 染 性 疾 患 で あ る こ と が 明 ら か に さ れ, 高 い 致 死 率 を 有 し血 液 を 介 し た 伝 播 が み ら れ る た め,社 会 的 な 関 心 を 集 め て い る. 血 友 病 症 例 の 多 く は 凝 固 因 子 製 剤 の 投 与 を 頻 回 に 必 要 と し,こ の 製 剤 の8割 近 く を 輸 入 に 頼 っ て き て お り4),こ れ が ウ イ ル ス で 汚 染 さ れ て い た た め,わ が 国 で も 血 友 病 患 者 はAIDSのhigh-risk groupに 挙 げ ら れ て い る.1986年6月 現 在 で 国 内 のAIDS患 者 は16例 で,う ち8例 は 血 友 病 患 者 か ら 発 症 し て い る.そ こ で,凝 固 因 子 製 剤 に よ る HIVの 伝 播 を 防 止 す る た め,1985年10月 か ら 加 熱 処 理 さ れ た 凝 固 因 子 製 剤 が 認 可 さ れ て 使 用 さ れ る よ うに な り,ま た1986年 よ り輸 血 血 液 のHIV抗 体 チ ェ ック が 開 始 され て凝 固 因 子 製 剤 に よ る新 た な感 染 は減 少 す る も の と期 待 され て い る.今 後 は, 既 に 感 染 し て し ま ったHIV抗 体 陽 性 者 の 追 跡 調 査 と発 症 予 防 を含 む 治 療 法 の確 立 とが重 要 な課 題 とな って い る.こ こで は,HIV抗 体 陽 性 者 の臨 床 症 状 とAIDSに 関 連 した 検 査 の成 績 を ま とめ,更 にAIDSの 問 題 点 に つ い て も検 討 を 加 え た い. 方 法 並 び に症 例 AIDSの 検 査 の た め に 東 京 大 学 医 科 学 研 究 所 病 院 を受 診 した35例 の 血 友 病 患 者 を 今 回 の対 象 と し た.HIV抗 体 検 査 は ア ボ ッ ト社 のHTLV-III・ EIA(ア ボ ッ ト)と ウエ ル カ ム社 の ウ エ ル コザ イ ム を 使 用 した.ま た,HIV抗 体 の 確 認 試 験 で あ る Western Blot法 は 米 国 ア ボ ッ ト社 に血 清 を 送 り, 検 査 を依 頼 した.一 方,別 の確 認 試 験 で あ る蛍 光 抗 体 法 に よ るHIV抗 体 価 の 測 定 は 継 代 培 養H9 株 にHIVを 持 続 感 染 させ たH9/HIV細 胞 を 用 い,こ の細 胞 を 抗 原 と して,こ れ に 患 者 の 希 釈 血 清 を反 応 さ せ て 間 接 蛍 光 抗 体 法 に てHIVの 抗 体 価 を 測 定 した. 次 に,ウ イル ス 分 離 に は末 梢 血(5m1)か ら フ ィ 別 刷 請 求先:(〒108)港 区 白金 台4-6-1 東 京 大学 医 科 学 研究 所 内 科 田辺 清勝

コ ー ル を 用 い て 白 血 球 分 画 を 回 収 し,こ の リン パ 球 を 含 む 患 者 の 細 胞 と継 代 培 養 株MT4細 胞 と を co-cuitureし て ウ イル ス を増 殖 させ,次 に こ の培 養 上 清 をH9細 胞 に 感 染 させ る方 法 を 採 った.こ の細 胞 に感 染 が 成 立 す る と 巨細 胞 化 が 起 こ り,こ れ に よ っ て ウ イル ス の存 在 が 示 唆 され る が,更 に こ の 時 期 の細 胞 を 蛍 光 抗 体 法 で 観 察 してHIV抗 原 の存 在 を 確 か め て か ら,こ の細 胞 を 固定 して 電 子 顕 微 鏡 の 材 料 と した. P.cariniiの 抗 体 価 の 測 定 に は ラ ッ トの感 染 肺 か ら集 め た シ ス トを 抗 原 と して 用 い,蛍 光 抗 体 法 で 患 者 の 血 中 抗 体 価 を 測 定 した.ま た,血 中 抗 原 の 検 査 は 家 兎 免 疫 血 清 を用 い て,サ ン ドイ チELISA で実 施 した. 成 績 血 友 病 患 者 のELISAに よ るHIV抗 体 陽 性 率 は35例 中18例(51%)で,カ ッ トオ フ値 を僅 か に 上 図 る2例(6%)も 含 め る と20例 とな る.Table 1に 血 友 病 症 例 の抗 体 の 保 有 状 況 を 年 齢 と血 友 病 型 に分 類 した.こ こで,血 友 病 は 伴 性 劣 性 遺 伝 形 式 を と るた め 全 症 例 が 男 性 で あ る.病 型 別 にみ る と抗 体 陽 性 例 は血 友 病Aで は29例 中14例(48%), 血 友 病Bで は6例 中4例(67%)で あ った.こ れ ら のHIV抗 体 の ス ク リー ニ ン グ 検 査 に は 最 初 に,ア ボ ッ ト社 のHTLV-III・EIAと ウ エ ル カ ム 社 の ウ エ ル コザ イ ム の キ ッ トを用 い た.両 者 は い ず れ も酵 素 標 識 抗 体 法 で あ る が,後 者 は イ ン ヒ ビ シ ョン法 で あ るた め 肝 炎 患 者 や 抗 核 抗 体 陽 性 者 で は 健 常 者 よ りも高 い値 を 呈 した が,陽 性 判 定 成 績 は両 社 の キ ッ トで 一 致 した 結 果 が 得 られ た.次 に, これ らのELISAで 抗 体 陽 性 と判 定 さ れ た 例 に は Western blot法 に よ る確 認 試 験 を 行 い,そ の結 果 ELISAで 抗 体 陽 性 と判 定 さ れ た 症 例 は 全 例 が Western blot法 に お い て も陽 性 と判 定 され た.但 し,先 のELISA法 に て カ ッ トオ フ値 を 示 した2 例 は 確 認 試 験 で は陰 性 と判 定 され た.更 に,こ れ らの 抗 体 陽 性 の 症 例 に お い て,HIV抗 体 価 を調 べ るた め,間 接 蛍 光 抗 体 法 を 用 い て,患 者 の 希 釈 血 清 の抗 体 価 を 測 定 した.ELISAで 陰 性 ま た は カ ッ トオ フ値 の 症 例 は い ず れ も蛍 光 抗 体 法 で10倍 以 下 の抗 体 価 で あ り,こ れ らは 全 例 陰 性 と判 定 され た.

Table 1 Profiles of 35 Hemophiliacs

この 蛍 光 抗 体 法 の 成 績 はWestem blto法 で 得 ら れ た結 果 と一 致 した. Table2にHIV陽 性 例 の 臨 床 症 状 と検 査 成 績 を ま とめ た.こ こ に記 した 抗 体 価 の 数 字 は経 時 的 に 何 回 か 検 査 され た 成 績 の うち で最 も高 い値 を 示 して あ る.一 方,HIV抗 体 陽 性 者 の 末 梢 血 リン パ 球 か らco-culture法 に よ り ウ イル ス 分 離 を 試 み, こ の うちARCの2例 の 患 者 か ら ウ イ ル ス を 分 離 す る こ とが で きた.Fig.1Aは 巨 細 胞 の写 真 で,こ れ は 患 者 の リ ン パ 球 とMT4細 胞 をco-culture し,こ の 培 養 液 をMolt4に 感 染 させ て 生 じた もの で あ る.こ の 細 胞 を 蛍 光 抗 体 法 で 観 察 す る と, Fig.1Bの 写 真 の よ うに 巨細 胞 に 抗 原 が 存 在 し て い る こ とが 証 明 され た.従 って,患 者 の リンパ 球 と cocultureす る こ とに よ り,Molt 4細 胞 にHIV

関 連 物 質 が 出 現 した こ とを 示 唆 して い る.こ の 抗 原 物 質 を電 子 顕 微 鏡 で 確 か め た.Fig.2Bの 写 真 にみ られ る よ うに,多 数 の ウイ ル ス粒 子 が 細 胞 の 内 外 に集 ま っ て観 察 され た. 次 に,HIV感 染 者 に は免 疫 機 能 低 下 が み られ る こ とが あ り,こ の よ うな時 期 に は カ リニ肺 炎 な ど の 日和 見 感 染 が 生 じ易 い.そ こで,HIV抗 体 陽 性 患 者 のP.carinii抗 体 価 と血 中 抗 原 の 測 定 を 試 み た.こ の検 査 結 果 をTable 3に 示 した.健 常 人 の 群 のP.cariniiに 対 す る抗 体 価 は た か だ か20倍 程 度 で あ る が,HIV抗 体 陽 性 者 の 一 部 に はP. carinii抗 体 価 の 上 昇 して い る例 が み られ,特 に, ARCの 症 例 で は 抗 体 価 が80倍 と高 く,AIDSの 症 例 で も発 症 後 に抗 体 の 上 昇 が認 め られ た.一 方,

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Table 2 Clinical Symptoms and Laboratory Data of 18 Hemophiliacs with Positive Antibody against HIV

*: Clinical stages in classification of AIDS _{, As; asymptomatic carrier.} **: Clinical symptoms: O; oral candidiasis

, F; fever, L; lymphadenopathy D; diarrhea, E; easy fatigability.

***: Laboratory data: HIV-Ab titers were assayed by an indirect immunofluorescent method _{. T4/T8;} ratios of OK-T4 (helper T cells) and OK-T8 (supresser T cells), IgG; immunoglobulin G, •¬; elevated,•¨: within normal ranges.

Fig. 1A Multinucleated giant cells (center) were formed. To isolate HIV from patients with ARC, peripheral blood leukocyte cells were co-cultivated with MT4 and H9 cells. 1B: HIV antigen expression was tested by indirect immunofluorescence. 流 血 中 のP.carnii抗 原 をELISAで 調 べ た 結 果, カ リ ニ 肺 炎 を 発 症 し たAIDSの 症 例 にP.carinii 抗 原 が 検 出 で き た. 考 察 ア メ リ カ 合 衆 国CDCの レ ポ ー トで はHIVの

感 染 をAsymptomatic carrier, persistent gener-alized lymphoadenopathy(PGL),AIDS-related

complex(ARC),AIDSの4段 階 に 分 類 し て い る5).PGLの 定 義 は 左 右 対 称 性 の リ ン パ 節 腫 大 を 呈 す る 症 候 群 で,全 身 倦 怠 感,発 熱,盗 汗,体 重

Fig. 2 Transmission electron micrographs of HIV isolated from patient with ARC. 2A: Budding virions from the surface of cells (•~42,000). 2B: Clusters of virions were also observed inside the cells (•~36,000).

減 少,下 痢 な どの 臨 床 症 状 や,T4リ ンパ球 の 減 少, T4/T8比 の 減 少 が み られ る時 期 で あ る.更 に進 行 して 口腔 カ ン ジ ダ症 や 脾 腫 な どの 症 状 が加 わ り, 上 記 検 査 値 も一 段 と悪 化 す る とARCと 診 断 され る.こ れ に 日和 見 感 染 や 悪 性 腫 瘍(Kaposi肉 腫 や 非 ポ ジキ ン リンパ 腫)が 合 併 した 時期 がAIDSで あ る.こ れ らの 病 型 が重 症 化 してAIDSに 進 行 す る頻 度 は そ れ ぞ れPGLの10%,ARCの25%と 推

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Table 3 Antibody Titers against HIV and P. carinii

*: Lymphocytes _{count (/mm3) .}

**: Antibody titers assayed by an indirect immunofluorescence _{(IF) method .}

定 され て い る6). 日本 人 血 友 病 者 のHIV抗 体 陽 性 率 は こ れ ま で の 報 告 で は25∼55%で あ り7),今 回 の 症 例 で も18 例(53%)がHIV抗 体 陽 性 で,同 程 度 の 率 で あ っ た.ELISAで カ ッ トオ フ値 を 呈 した2例 はWest-ern blot法 や 蛍 光 抗 体 法 で 陰 性 で あ り,こ れ らは 偽 陽 性 反 応 で あ る と解 釈 され る. AIDS患 者 に み られ る 日和 見 感 染 の70%は カ リ ニ肺 炎 で 最 も多 い8).AIDSやARCの 患 者 でP. oariniiに 対 す る抗 体 価 や 血 中 抗 原 を 測 定 した 別 の 報 告 で も 高 頻 度 に 抗 体 価 の 出 現 を 認 め て い る9).こ れ らの 患 者 の 細 胞 性 免 疫 は 低 下 し て い る が 体 液 性 免 疫 はむ しろ亢 進 し て い る とい う これ ま で の 報 告 と一 致 す る. AIDSのhigh risk群 に 属 す る者 を 一 定 期 問 診 療 す る際 に 最 も知 りた い 検 査 成 績 は ウ イ ル ス の増 殖 量 とAIDSへ の 進 行 度 を 示 す マ ー カ ーで あ る. ウ イ ル ス増 殖 を 調 べ るに は(1)リ ンパ 球 細 胞 内 の HIV核 酸 を ハ イ ブ リダ イ ズ法 で測 定 す る,(2)逆 転 写 酵 素 活 性 を測 定 す る,(3)血 中 ウ イ ル ス抗 原 を 定 量 す る な どが検 討 され て い る.ま た,HIV抗 体 や リンパ 球 の検 査 も不 可 欠 で あ る.抗 体 価 の変 動 は ウ イル ス増 殖 の 間 接 的 な 指 標 とな る が,蛍 光 抗 体 法 に よ る測 定 は 煩 雑 な た め 余 り普 及 して い な い.抗 体 価 の 変 動 とAIDS発 症 と の 関 連 に お い て,今 後 とも検 討 す べ き検 査 で あ る と思 わ れ る. 次 に,リ ンパ 球 検 査 は(1)リ ンパ 球 数 の 絶 対 数, (2)ヘ ル パ ーTリ ンパ 球(Th,T4)数,(3)ヘ ル パ ーTと サ プ レ ッサ ーTリ ンパ 球(Ts,T8)球 の 比(Th/Ts,T4/T8)が あ り,こ れ らが 経 時 的 に 測 定 され る と よ い.こ れ はHIVが ヘ ル パ ーTリ ン パ球 に 感 染 して 破 壊 す るた め で,ウ イル ス増 殖 の 際 に この リンパ 球 の減 少 が み られ る こ とが 多 い た め で あ る.従 って,T4/T8の 比 の低 下 がAIDS の発 症 に 結 びつ くと考 え られ るが,血 友 病 患 者 で は 血 液 成 分 の 投 与 に よ り ヘ ル パ ーT細 胞 の 低 下 して い る症 例 が み られ.HIV陰 性 者 に もT4/T8 が0.2以 下 の 値 を示 した 例 を経 験 して い る.AIDS の 発 症 に 関 連 し て 変 動 す る こ の 他 の 検 査 項 目 に (1)血 小 板 数,(2)β2-マ ク ログ ロ グ リン,(3)酸 不 安 定 型 の α-イン タ ー フ ェ ロ ン な どが あ る.血 小 板 数 の 減 少 は血 友 病 患 者 に し ぼ しば み られ,今 回

も18例 中4例 に み ら れ た.β2-マ ク ロ グ ロ ブ リ ン は 腎 不 全 や 血 液 系 の 悪 性 腫 瘍 で 上 昇 す る が,AIDS で も発 症 の2年 前 か ら上 昇 し た 症 例 が 報 告 さ れ て い る10).酸 不 安 定 型 の α-イ ン タ ー フ ェ ロ ン は 健 常 時 に は 循 環 し て い な い が,AIDSの70%に 測 定 で き た と 報 告 さ れ て い る11).こ れ ら の 検 査 は 今 後 の 検 討 に 値 す る 検 査 と考 え ら れ る. 謝 辞:稿 の終 わ りをみ るに あた り,ウ イ ル ス分離 に御協 力 いた だ い た国 立 予 防衛 生 研 究所,森 川茂 先 生 に深 謝 致 し ます.こ の研 究 の 一部 は文 部 省科 研 費 に よった.こ こに記 し て謝 意 を表 す. 文 献

1) Gottlieb, M.S., Schroff, R., Schanker, H.M., Weisman, J.D., Fan, P.T., Wolf, R.A. & Saxon, A.: Peumocystic carcinii peumonia and mucosal cadindiasis in previously healthy homosexual men. N. Engl. J. Med., 305: 1425 -1431 _{, 1981.}

2) Barre-Sinoussi, F., Chermann, J.C., Rety, F., Nugeyre, M.T., Chamaret, S., Grusertm, J., Dauguet, C., Alexer-Blin, C., Vezinit-Brun, F., Rouzioux, C., Rozenbaum, W. & Montagnier, L.: Isolation of a T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome (AIDS). Science, 220: 868 -971

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3) Gallo, R.C., Sarin, P.S., Gelmann, E.P., Robert-Guroff, M., Richardson, E., Kalyanaramann, V. S., Mann, D., Slidue, G.D., Stahl, R.E., Zolla-Pazner, S., leibowitch, J. & Popovic, M.: Iso-lation of human T-cell leukemia virus in acquired immune deficiency syndrome (AIDS).

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5) Centers for Disease Control.Morbid. Morysl. Weekly Rep., 34: 101-103, 1985.

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7) 杉 山 武 喜 子, 他: ELISA法 に よ るHTLV-III抗 体 測 定 の 検 幾. 医 学 の あ ゆ み, 137: 63-64, 1986. 8) Kovacs, J.A., Hiemenz; J.W., Macher, A.M., et

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10) Zolla-Pazner, S., William, D., El-Sadr, W., et al.: Quantitation of beta-2 microgloblin and othe rimmkune characteristics in a prospective study of men at risk for acquired immune deficiency syndrome. J.A.M.A., 251: 2951

-2955 _{, 1984.}

11) Eyster, M.E., Goedert, J.J., Poon, M.C., et al.: Acid-labile alpha interferon: A possible pre-clinical marker for the acquired

immunodefici-ency syndrome in hemophilia. N. Engl. J. Med., 309: 583-586, 1983.

Examinations for Human Immunodeficiency Virus (HIV) Infection in Hemophiliacs

Kiyokatsu TANABE1, Yoshihiro OHTA2), Masanori HAYAMI2) & Kaoru SHIMADA1 1) Department of Internal Medicine, Institute of Medical Science, University of Tokyo

2) Department of Veterinary Institute of Medical Science, University of Tokyo

Thirty five hemophiliacs treated with imported blood products were tested for HIV antibody by ELISA technique. Eighteen cases were antibody-positive (53%) and other two cases were in cut-off values. These 18 positive sera were confirmed by immunofluorecence and immunoblot testing. HIV was isolated in two cases of ARC by co-cultivating peripheral blood lymphocytes and HIV-sensitive cell lines such as H9 and MORT-4. After a few week of cultivation, cells were examined for an expression of HIV antigen. Virus particles were recognized by an electron microscopic technique.

Clinical symptoms and laboratory data were discussed. One hemophiliac with AIDS died of Pneumocystis carinii pneumonia. Other three cases with oral candidiasis were in a stage of AIDS-related complex.