ホシガレイの全雌種苗生産技術の開発に関する研究

(1)

ホシガレイの全雌種苗生産技術の開発に関する研究

Development of the Technique for All-Female Seedling Production in the Spotted Halibut

Verasper variegatus

2012 年 12 月

長崎大学大学院生産科学研究科

築山陽介

(2)

ホシガレイVerasper variegatus は，カレイ科マツカワ属に分類され，本州中部以南，朝鮮半島西岸，渤海，黄海に分布している（山田1986）（Fig. 1）。本種は長崎県内では橘湾及び有明海において底曳網，刺網により12月～5月にかけて主に漁獲され（森川ら2000），市場では3,000～5,000円/kgで取引される高級魚である。

本種は岩手県，宮城県，福島県，大阪府および長崎県において種苗生産または種苗放流が行われている（水産庁・独立行政法人水産総合研究センター・(社) 全国豊かな海づくり推進協会2012）。ただし，東北地方での種苗生産は2011年の東日本大震災の影響を受け，現在は休止している。

長崎県では魚介類種苗量産技術開発研究事業（平成9-13年度）および第2期魚介類種苗量産技術開発研究事業（平成14-22年度）により総合水産試験場で本種の種苗生産技術開発に取り組み，10万尾単位での種苗生産技術を確立させ，

長崎県漁業公社へ技術移管している。また，生産した種苗を用いて，魚類養殖多様化推進事業により養殖試験を実施し，平成22年度には養殖マニュアルを作成している。

ホシガレイの養殖は，長崎県の陸上養殖施設においてヒラメParalichthys

olivaceusに代わる魚種として普及を行っているが，ヒラメよりも成長が遅いた

め（木本・佐藤2003），それを補う方法が必要になる。ホシガレイは，ヒラメやマツカワVerasper moseriなどの他の異体類と同様に雌が雄よりも成長が良く，雌は満3歳で体重1 kgに達するが，雄は0.5 kg未満であること（佐久間 2001）から，雌種苗のみを飼育することが有利とされている（八木2002）。

通常，本種の性比は１:１であるが，成熟するまで外見による雌雄の判別は困

(4)

難で，成長の雌雄差も孵化後１年半までは顕著でないため（佐久間2001），養殖現場において雌雄選別を行うことは難しい。ホシガレイ養殖では雌のみを飼育することが効率的であるが，前述の理由から早期の雌雄選別が行えないため，

種苗の全雌化が効率の良い養殖を実現するための方策と考える。

全雌種苗を得るためには，1）雌性ホルモンの投与，2）染色体操作による雌性発生，3）遺伝的雌を雄へ性転換させた偽雄の精子を用いた人工授精等の方法

がある（Fig. 2）。雌性ホルモン投与による雌化は，仔稚魚へのエストラジオー

ル-17β（以下，E2）の浸漬または経口投与によって行われ，異体類ではヒラメ

（田中1988；山本ら1987）およびマツカワ（森ら1995）で実施されている。

浸漬法では，ヒラメの性的未分化期（11～70日齢）にE2 10 μg/l で処理することにより，雌比率が対照区の35.7％に対して48％となったが，全雌化には至っていない。一方，経口投与法による雌化はヒラメとマツカワで実施されており，

ヒラメでは56～90日齢，マツカワでは73～103日齢にかけてE2 1 μg/g･diet を毎日投与することにより，全雌種苗が得られている（田中1988；森ら1995）。

染色体操作による雌性発生はホシガレイを対象として行われており，第二極体放出阻止型の雌性発生の条件について検討したところ，八木ら（2004）は授精3～5分後に-1.5～-1℃で60分間処理することにより，Ji et al.（2010）は授精5分後に-1℃で40～75分間処理することにより雌化を誘導している。

遺伝的雌を雄へ性転換させた偽雄の精子を用いた人工授精による全雌化では，

まず合成雄性ホルモンのメチルテストステロン（以下，MT）を性分化期の個体に投与し，遺伝的雌を雄に性転換させなければならない。ホシガレイの遺伝的性決定様式はヒラメと同様にXX/XY型であり（Ji et al. 2010），性転換した遺伝的雌の精子はX染色体のみを持つことから，これを卵子と受精させれば全て XX遺伝子を持つ雌となる。この方法による全雌生産は，ヒラメにおいて実用化

(5)

されている（山本1992）。しかし，Ma et al.（2010）はホシガレイの性決定様

式がZZ/ZW型である可能性を論じており，この性決定様式が正しいとすると，

雌はZW遺伝子を持つことから，全雌作出にはWW型の遺伝子を持つ偽雄を作出しなければならない。全雌作出にいたる作業過程に多少の違いはあるものの，

MT処理による偽雄の作出は，全雌作出に有効な方法である。本研究では，ホシガレイの性決定様式はXX/XY型の性決定様式として議論する。雌性ホルモンを投与する方法は大量の種苗を少ない労力で性転換させることが可能であるが，

食品安全上，養殖魚には適さない。染色体操作による雌性発生魚の作出では，

孵化率が通常発生魚と比較してかなり低く，大量の種苗生産には解決しなければならない課題が多い。これに対して偽雄の精子を用いた種苗生産は，食品として安全な大量の雌種苗が得られることから，実用性の高い技術として注目されている。

本研究では，このような背景のもと，ホシガレイの全雌種苗を生産するために，まず雌性発生二倍体の作出に関する実験を行った。この実験では低温処理による第二極体放出阻止型の雌性発生二倍体の作出条件である低温処理の開始時間，処理水温および継続時間について検討した（第2章）。続いて，魚類の遺伝的な性を人為的に操作するためには，性的未分化期に性操作を継続して行う必要があることから（Nakamura and Takahashi 1973），性分化の過程を明らかにする試験を行った（第3章第1節）。また，偽雄を作出するために必要な，

遺伝的雌を雄化する技術の開発に向け，ヒラメおよびマツカワが水温等の環境要因により性転換すること（山本1995；Goto et al. 1999）から，ホシガレイについても性転換する可能性が高いと考えられたため，ホシガレイ仔稚魚の飼育水を加温または冷却し，性分化に及ぼす影響について試験を行った（第3章第2 節）。最後に，MTの経口投与試験を行い，ホルモンの添加濃度および投与期間

(6)

による性分化および生残に及ぼす影響について調べた（第3章第3節）。これらの成果をもとに，ホシガレイの全雌化技術の最適化について考えるとともに，

長崎県におけるホシガレイの種苗生産戦略についても議論する。

(7)

Fig. 1. Spotted halibut Verasper variegatus.

Bars = 50 mm.

Male

Female

(8)

Fig. 2. Possible techniques for all-female seedling production in the spotted halibut Verasper variegatus.

(9)

第2章雌性発生二倍体の作出

ホシガレイの全雌種苗生産に有効な方法には，緒言で述べたように1) 雌性ホルモンの投与による雌の作出，2) 染色体操作による雌性発生，3)遺伝的雌を雄へ性転換させた偽雄の精子を用いた人工授精による雌の作出の 3 つの方法がある。しかし，食品としての安全面から実用可能な方法は，後者の 2 つの方法，

すなわち染色体操作による雌性発生および遺伝的雌を雄へ性転換させた偽雄の精子を用いた人工授精による雌魚の生産である。そこで本研究では，まず染色体操作によるホシガレイの雌性発生二倍体の作出を試みた。作出した雌性発生二倍体をそのまま種苗生産に用いることができれば，大量の全雌を比較的簡単に生産することができる。しかし，雌性発生処理により孵化率が通常魚よりも低下することから，魚種によってはこの方法を用いて全雌生産の産業化に必要な尾数を確保するのは極めて困難である。しかし，雌性発生二倍体は，遺伝的雌のホルモンによる偽雄化にも活用できる。偽雄を作出するホルモン処理には性的に未分化の孵化後間もない個体を用いることが多いが，天然の個体を用いた場合，遺伝的雄と雌が1:1で混在することから，作出した雄の半分が遺伝的雄となる。そのため，本来の性がいずれであったかを検討し，偽雄のみを選別しなければならない。偽雄と遺伝的雄を判別するにはホシガレイが成熟する 2 歳まで飼育し，採取した精子を用いて後代検定を行う方法があるが，そのためには飼育の労力や場所および親魚の個体識別も必要であり，非効率的である。一方，雄化処理を施す魚が遺伝的雌のみであれば，雄化処理後に出現した雄は間違いなく偽雄であり，後代検定の必要がない。このように雌性発生二倍体の作出は偽雄作出に活用可能である。この場合，雌性発生二倍体を直接全雌生産用の種苗として利用するのとは異なり，人工授精に用いる精液は数個体の偽雄から必要量を十分に得られることから，雌性発生処理によって生残率が低下し，

(10)

わずかの個体しか生産できなかったとしても十分利用可能である。そこで本研究では，ホシガレイの雌性発生二倍体を作出条件を確認するための試験を行った。

一般に，雌性発生二倍体の作出において，対象種の卵発生を誘起でき，かつ雑種を生じても非生存性となる異種精子を用いれば，作出個体が雌性発生二倍体であるか否かの判断が容易になること（山川ら1987）から，これまでホシガレイの雌性発生にはマダイPagrus major（八木ら2004），マコガレイLimanda yokohamae（八木ら2005）およびスズキLateolabrax japonicus（Ji et al. 2010）の精子が用いられている。本研究では，これまでの事例をもとにマダイ精子を用いるとともに，ホシガレイ精子を用いて雌性発生二倍体の作出を試みた。

材料および方法

供試魚

長崎県橘湾で漁獲されたホシガレイ天然親魚を長崎県総合水産試験場へ搬入し実験に用いた。配偶子の確保にあたり，山田ら（2006）に従い，背筋部へヒト絨毛性生殖腺刺激ホルモン（HCG）を100IU/kg･BWとなるように投与した。

その後 24 時間以上経過した雌親魚より採卵し，雄からは採精を行った。また，

採精用マダイ親魚には，長崎市内の養殖業者から入手した養殖魚を長崎県総合水産試験場において養成した 4 歳魚を用いた。雌性発生用の精子の確保にあたり，マダイ親魚を12月に海面生簀から陸上水槽に収容し，飼育水温を徐々に昇温して 20℃で成熟を促し，採精した。紫外線照射試験用の配偶子は，5 月に海面生簀内で成熟した親魚から採卵および採精した。

(11)

精子への紫外線照射による遺伝的不活化

精子を不活化する適切な紫外線照射量を確認するため，マダイおよびホシガレイの精子を用いて実験を行った。親魚から採取したマダイおよびホシガレイの精液をクロダイ人工精漿（Morisawa 1985）で100倍に希釈した。希釈精液

5mlを直径14 cmのプラスチックシャーレ上に薄く延ばし，ロータリーシェー

カーで振とうしながら，殺菌灯 1 本(GL-15，東芝)により紫外線を照射した。

紫外線照射量は，シャーレ上の5箇所の紫外線強度を紫外線強度計（UVC-254，カスタム）を用いて測定し，その平均値に照射時間を乗じて算出した。照射紫外線量は，マダイ精子では1，2，5，10，20，30，40，50，60および70mJ/cm²，ホシガレイ精子では0.5，1，2，5，10，20，30，40および50mJ/cm²とした。

精子の不活性化の程度を調べる実験では，紫外線照射した精子を同種の成熟卵と人工授精させ，その後の発生の変化を観察した。成熟卵を試験区毎にボウルへ分け，紫外線を照射した精子を媒精した。対照区には，紫外線を照射していない精子を媒精した。浮上卵 100 粒以上を 500 ml ビーカーに収容し，インキュベーターで卵管理した。孵化までの期間中は，1日1回，沈卵の除去および海水交換を行い，実体顕微鏡を用いて卵または孵化仔魚を観察した。受精率，

胚体形成率および孵化率は，次の式で算出した。

受精率 (%) ＝ (受精卵数／ビーカー収容卵数) ×100 胚体形成率 (%) ＝ (胚体形成卵数／ビーカー収容卵数) ×100 孵化率 (%) ＝ (孵化仔魚数／ビーカー収容卵数) ×100

雌性発生処理条件の検討

低温処理によりホシガレイの第二極体放出阻止型雌性発生二倍体の作出を試みた。卵発生の誘起には，30 mJ/cm² の紫外線照射により不活化したマダイ精

(12)

子を用いた。低温処理の各条件を検討するため，1) 授精から低温処理開始までの時間，2) 低温処理の継続時間，および3) 処理水温の3項目について実験を行った。

低温処理開始時間の検討は，開始時間を授精後 1.5，3，5 および 7 分とし，

この4区について-1℃の低温処理を60分間継続することにより行った。開始時間の影響は，受精率および孵化率によって評価した。低温処理の継続時間の検討は，処理時間を30，60および90分間とし，この3区について，受精3分後から0.5℃の低温処理を施して，受精率および孵化率を算出した。低温処理水温の検討は，処理水温を-1，1，3および5℃とし，この 4区について受精3分後に60分間の低温処理により行った。この実験では，不活化マダイ精子に加えて，

不活化していないホシガレイとマダイの精子を用いた低温処理を施さない試験区も設け（自然水温，14℃），授精率および孵化率を求めた。低温処理には，チ

ラー（CL-80R，タイテック）または海水氷により冷却した海水を用いた。

上記の全ての試験には，異なる 3 個体の親魚より得られた卵を用いて同一の試験を繰り返し行った。

統計処理

授精率および孵化率の有意差は一元配置の ANOVAの後，Tukey-Kramer 法による多重比較により求めた。

結果

精子の遺伝的不活化

紫外線照射により不活化した精子を用いた受精試験の結果をFig. 3 に示す。

(13)

マダイの精子では，紫外線を照射しない対照区の授精率は 72.8％，胚体形成率および孵化率は67.3％および63.4％であった。1 mJ/cm²の紫外線を照射した精子を用いると，胚体形成率および孵化率が大幅に低下し，28.0％および 17.4％と最低値となった。紫外線照射量の増加に伴い，10 mJ/cm²で胚体形成率および孵化率が62.3％および48.7％に回復した。紫外線照射区の孵化仔魚は全て体が湾曲した奇形魚であった。

ホシガレイ精子では，紫外線を照射しない対照区の授精率は 69.8％と比較的高く，胚体形成率および孵化率は 50.8％および 32.5％であった。紫外線 0.5

mJ/cm²の照射では，胚体形成率および孵化率の低下が確認され，1 mJ/cm²の

照射によりそれらは大幅に低下した。1 mJ/cm²での胚体形成率および孵化率は最低値の 7.6％および 0％を示した。2 mJ/cm² 以上の照射では胚体形成率が

15.9%となり，照射量の増加とともに胚体形成率も増加し，30 mJ/cm²以上で横

ばいとなり，40 mJ/cm²において51.8%と最高値を示した。また，1 mJ/cm²以上の照射区では生存した孵化仔魚はみられなかった。1 mJ/cm²以上の紫外線を照射した区の胚体は，対照区のそれと比較して体が太く短い，半数体の特徴を示した。

(14)

Fig. 3. Effect of UV irradiation to sperm on fertilization (○), embryo forming (△) and hatching (●).

(15)

雌性発生処理条件

低温処理開始時間を検討した試験の結果をFig. 4に示す。受精率は1.5～7分後の各区で有意差がみられなかったものの，1.5分後区が他の区と比較して，やや低い値を示した。孵化率は受精 3 分後の値が他の区と比較して高かったが，

有意差はなかった。

低温処理の継続時間を検討した試験の結果をFig. 5 に示す。授精率は処理時間が長くなるに従って低下する傾向がみられたが，各区間に有意差はなかった。

また，孵化率は60分間処理区において，30および90分間処理よりも高い値を示したが，有意差はなかった。

低温処理水温の影響を調べた試験の結果をFig. 6に示す。ホシガレイ精子，

マダイ精子および紫外線照射により不活化したマダイ精子の受精率は 57.4～ 60.1％となり，ほぼ同じ値を示し，有意差はみられなかった。低温処理水温の影響を調べたところ，低温処理を施さなかった卵の授精率と比べ，低温処理を施した卵の授精率は 39.4～49.4％となり，低値を示したが，有意差はみられなかった。また，この受精率は処理水温が高くなるに従い，増加する傾向がみられた。孵化率は，ホシガレイ精子を用い低温処理を施さない卵では43.6±19.3％であったが，-1～3℃の低温処理区では7.1～7.6％と低い値を示し (P<0.05)，5℃ 処理区では10.7％となり，有意差は認められなかった。

(16)

Fig. 4. Effects of starting time after fertilization of cold shock treatment on fertilization (A) and hatching (B).

Bars indicate SD.

(17)

Fig. 5. Effect of cold shock duration on fertilization (A) and hatching (B). Bars indicate SD.

(18)

Fig. 6. Effect of cold water temperature on fertilization (A) and hatching (B).

Bars indicate SD. Different letters show significantly different mean values (P<0.05).

(19)

考察

紫外線を照射したマダイおよびホシガレイの精子を人工受精に用いたホシガレイ卵の胚体形成率は紫外線照射により減少し，1 mJ/cm²において最低値を示した。さらに紫外線照射量の増加に伴い胚体形成率は徐々に増加し，マダイ精子では10 mJ/cm²，ホシガレイ精子では30 mJ/cm²以上の照射量で対照区とほぼ同等まで胚体形成率が回復した。孵化率は胚体形成率と同様に1 mJ/cm²で最低値を示し，マダイ精子では紫外線量の増加に伴い増加した。ホシガレイ精子

では1 mJ/cm²以上の照射区では孵化仔魚はみられなかった。これは，紫外線照

射によるHertwig効果であると推察される。Hertwig効果とは，紫外線等の照

射により精子の染色体が部分的に切断されることによって胚発生に対して生じた有害作用が，ある線量を超すと精子の染色体が消失または動原体が損失し，

これが卵割に参加しなくなることにより，逆に減少していくことである（小野里1982）。このことから，精子への紫外線照射はマダイでは10 mJ/cm²以上，

ホシガレイでは30 mJ/cm²以上行うことで，精子の遺伝子が完全に不活化されると推察された。既往の報告による孵化率が低下する紫外線量は，ヒラメ精子では1.1～2.3 mJ/cm²（田畑ら 1986），マツカワ精子では 2～5 mJ/cm²（森ら 2004）であり，本研究の結果とほぼ同じであった。マダイ精子では3～10 mJ/cm²

（山川ら1987）と本研究の結果より照射線量が高いが，これは使用しているシャーレの大きさ（直径9 cm）と処理液量（3 ml）による液量の深さおよび精子の希釈濃度（50倍）による差と推察される。

雌性発生においては，紫外線照射および倍化操作の成否により雌性発生二倍体の他に，同種の精子を用いた場合には 3 倍体，通常の 2 倍体および半数体が作出され，異種の精子では異質 3 倍体，交雑魚および半数体が生じる。ホシガレ

(20)

イ卵およびマダイ精子を用いて雌性発生魚の作出を行った場合，異質 3 倍体および交雑魚が僅かに孵化するが，こちらは開口までに全てへい死し，半数体は孵化しないことから，生残魚は雌性発生二倍体と推察される（八木ら 2004）。

したがって，ホシガレイの雌性発生二倍体作出には異種精子であるマダイ精子が有用であると判断した。しかし，マダイはホシガレイの産卵期である冬季には，成熟促進用の加温水槽が必要なことから，将来は八木ら（2005）が検討しているマコガレイのようなハンドリングが容易でホシガレイと成熟期が同時期である異種魚種の精子を用いることが望ましいと思われる。

低温処理による雌性発生魚の作出条件として，低温処理の開始時間，処理の継続時間および処理水温の 3 項目について実験を行った。低温処理の開始時間を検討したところ，受精1.5～7分後の全ての区において孵化仔魚が得られた。雌親魚により傾向は異なるものの，授精 3 分後の処理開始が最も高い孵化率を示した。マツカワの雌性発生二倍体作出では，受精 3～11 分後の処理開始により孵化仔魚が得られ，9分後の孵化率が有意に高くなっている（森ら2004）。このように，マツカワではホシガレイより処理開始時間を遅くしても高い孵化率が得られている。これは森ら（2004）によるマツカワの卵管理水温が 8～10℃と本試験の卵管理水温12～14℃より2～6℃低く，卵発生速度が遅いことが原因の一つと考えられた。低温処理の継続時間の試験では，30～90 分間の全ての試験区で孵化仔魚が得られた。卵のロットにより傾向は異なるが，60 分間の低温処理の孵化率が高く，最も適していると考えられた。他の異体類の低温処理継続時間は，マツカワでは60～90分間（森ら2004），ヒラメでは45分間（田畑ら 1986），マコガレイでは 60 分間（柿本ら 1994），ヌマガレイ Platichthys stellatusでは60分間，スナガレイLimanda punctatissimaでは60 分間であり（矢野・酒井 1988），本研究のホシガレイの結果とほぼ同じであった。低温

(21)

処理水温の試験では，-1～5℃の全ての区で孵化仔魚が得られたが，ほとんどが奇形魚であった。この比較試験では最適な処理水温を明らかにすることはできなかったが，これまでに行った雌性発生二倍体の作出では，-1.2～1.4℃の低温処理により雌性発生二倍体魚が得られていることから，この範囲内に低温処理に適した水温があると推察された。これらの結果から，受精3分後に-1.2～1.4℃ の低温処理を60分間継続することで雌性発生二倍体が作出できると考えられた。

これは八木ら（2004）が授精5分後に，-1℃の低温処理を60分間継続することで雌性発生二倍体が得られると報告した事例とほぼ一致していることから，ホシガレイに適した方法であると考えられる。

(22)

第3章人為的な性制御

第1節ホシガレイの性分化

魚類の遺伝的な性を人為的に性ホルモン等の処理により制御するには，性分化期間の初期から終了までの全期間を通して性制御の処理を継続する必要がある

（Nakamura and Takahashi 1973）とされることから，性制御を行うにあたり対象種の性分化の時期および期間を確認しておくことが必要である（森ら1995）そこで，ホシガレイにおいても，性分化に関する知見を得ることを試みた。

供試魚

長崎県橘湾において漁獲されたホシガレイ天然親魚から第 2 章と同様に，

HCGを用いて採卵し，人工授精により得られた仔稚魚を供試魚に用いた。実験に用いた仔魚の発育ステージの分類・表記は，有瀧ら（2001）の定義に従った。

全長6.1±0.1 mm（4日齢，ステージC）の仔魚1,000尾および全長18.7±1.5 mm（46日齢，ステージH）の仔魚1,000尾をそれぞれ200 lおよび500 l水槽に収容し，飼育した。仔魚への餌料系列には，宮木ら（2005）の方法に従い，

シオミズツボワムシL型Brachionus plicatilisを5日齢から，配合飼料（ラブラァバ，林兼産業）を30日齢から，アルテミアArtemia sp. のノープリウス幼生を37日齢から給餌した。シオミズツボワムシとアルテミアは，栄養強化剤（バイオクロミスリキッド，クロレラ工業）により給餌前に栄養強化した。飼育水には紫外線殺菌海水を用い，自然水温で飼育した。シオミズツボワムシの給餌期間中はナンノクロロプシスNannochloropsis oculataを50 cells/mlになるよう飼育水へ添加した。

(23)

サンプリング

200l水槽からは15，25および30～100日齢まで10日毎に各10個体をサンプリングし，500l水槽からは80～180日齢まで10日毎に各10個体をサンプリングした。採取した仔稚魚は，万能投影機を用いて全長を測定した。

生殖腺の組織学的観察

サンプリングした全ての供試魚は，ブアン氏液で固定後，70％エタノールで保存した。固定した生殖腺を定法により5 μmのパラフィン切片にし，ヘマトキシリン・エオシンの二重染色を施し，光学顕微鏡下で観察した。仔魚の発育ステージを有瀧ら（2001）に従って判定した。

結果

生殖腺の組織像をFig. 7に示す。30日齢の仔魚は全長12.7±0.9 mm（n=10），ステージ E であった。組織観察により，副腎輸管と消化管の間に一対の生殖隆起が認められた。生殖隆起内部には，少数の始原生殖細胞が認められる未分化の状態であった（Fig. 7-A）。70日齢の仔魚は全長20.5±1.0 mm（n=10），ステージHでほぼ変態を完了しており，着底していた。これらの個体の生殖腺は大きくなり，厚みも50 μmほどを示し，副腎輸管から肛門方向へ伸長した。また，生殖細胞数も増加したが，生殖腺において性分化を示す形態的特徴は確認されなかった（Fig. 7-B）。90日齢の稚魚は全長28.4±4.9 mm（n=10），ステージIで変態が完了していた。生殖腺の組織観察において，一部の個体で生殖腺に卵巣腔の形成が初めて確認され，雌への性分化が確認された。減数分裂中の生殖細胞が多く観察され，生殖腺内の細胞数がさらに増加していた（Fig. 7-C）。

(24)

100日齢の稚魚は全長35.4±5.2 mm（n=10）であった。生殖腺の外部形態により 2 つの型に分類できるようになった。一方は腹腔最後部から尾部の筋肉に沿って生殖腺が後方へ伸長し，この生殖腺組織には卵巣腔の形成が確認され，雌への分化が確認された（Fig. 7-D）。他方の生殖腺では後方への伸長が認められず，腹腔後部に付着しているだけであった。組織観察では結合組織が多く認められ，生殖細胞は卵巣へ分化した個体と比較すると少なく，将来は雄へ分化すると考えられた（Fig. 7-E）。120日齢の稚魚は全長59.4±14.1 mm（n=10）であった。卵巣では，卵巣腔がさらに伸長し，卵巣薄板が形成され，減数分裂前期の卵母細胞が多数確認された。一部に染色仁期の卵母細胞が観察され，雌への分化が進んでいた（Fig. 2-F）。160日齢の稚魚は全長93.2±12.9 mm（n=10）に成長し，卵巣内には周辺仁期の卵母細胞が多数観察された（Fig. 7-G）。一方，

精巣に分化すると考えられる生殖腺では精原細胞がみられ，包嚢を形成した

（Fig. 7-H）。

(25)

Fig. 7. Cross sections of gonad in spotted halibut Verasper variegatus. A, 30 days after hatching (DAH). Arrows show the sexually undifferentiated gonad; B, Sexually indifferent gonad at 70 DAH;

C, Ovary at 90 DAH. Arrow head shows the ovarian cavity; D, Ovary at 100 DAH. Arrow head shows the ovarian cavity; E, Gonad at 100 DAH; F, Ovary including perinucleolus oocytes at 120 DAH;

G, Ovary including perinucleolus oocytes at 160 DAH; H, Testis including spermatogonia at 160 DAH; Bars=100 μm.

(26)

考察

本研究によって，ホシガレイの性分化過程が明らかになった。自然水温で飼育したホシガレイは，70日齢（全長21 mm，ステージH）までは性的未分化の状態であったが，90日齢（全長28 mm，ステージI）の稚魚では，一部の個体で生殖腺に卵巣腔の形成が初めて確認され，雌への性分化が確認された。100 日齢（全長35 mm，ステージI）では生殖腺の外部形態が2つの型に分類された。すなわち，一方の生殖腺は形態的に未分化のままであったが，他方のそれでは卵巣腔の形成が観察されており，卵巣への分化が確認された。このことから，ホシガレイの雌への性分化は70～100日齢（全長21～35 mm，ステージH

～I）の間に行われると推察された。また，多くの魚種と同様に，雌における卵母細胞の出現が雄における精母細胞の出現よりも早期に観察された。ヒラメでは，75～88日齢（全長30 mm前後）の雌において卵巣腔の形成がみられ，体の後方へ生殖腺が伸長し，88日齢（全長55 mm）の稚魚で減数分裂初期の卵母細胞が初めて確認されている（田中1987）。また，マツカワでは，73日齢（全

長30 mm）の個体の生殖腺は未分化で雌雄判別できないが，99日齢（全長55

mm）では生殖腺に２つの型がみられ，一方に卵巣腔の形成が確認され，雌への分化が確認されている（森ら1995）。ホシガレイは，ヒラメと比較して雌への性分化が若干遅く，マツカワとほぼ同じであることが分かった。これは，ホシガレイの変態完了が70～80日齢前後（全長25 mm前後）とヒラメの変態完了

（36～50日齢，全長9.0～19.4 mm，原田ら1966)よりも遅れることから，魚種による発生および発達速度の違いと関連していると考えられる。

(27)

第2節高水温飼育による性転換

本種の近縁種であるマツカワでは，性分化期の仔魚を高水温で飼育すると性比が雄に偏ることが報告されており（Goto et al. 1999；森2006），ヒラメでは性分化期に高水温飼育することにより雄化される（山本 1992；岩田ら 1998）。このように仔魚の高水温処理が遺伝的な雌個体の性を雄に誘導することは，ヒラメ科やカレイ科の魚類においては一般的な現象と考えられ，ホシガレイも飼育水温の調節によって雄化を誘導できる可能性が考えられる。本種においてもマツカワおよびヒラメと同様に飼育水温の調節により人為的に「偽雄」を作出することにより，全雌種苗の生産が可能となる。しかし，ホシガレイ仔稚魚は高水温により生残率が低下することが知られており（村田ら1998；佐久間2001），雄化を促す高水温処理は，生残に悪影響を及ぼすことが予想される。したがって，本種において高水温処理によって産業的に利用できる雄化を行うことが可能か否かを明らかにするためには，高水温の性分化に及ぼす影響に加えて，生残に及ぼす影響についても検討する必要がある。

そこで，本研究では異なる水温でホシガレイの仔稚魚を飼育し，生残および性分化に及ぼす水温の影響を調べた。

供試魚

平成21～23年1月に長崎県橘湾で漁獲された天然魚から，人工授精により得られた受精卵をアルテミア孵化槽で卵管理し，孵化仔魚を飼育水槽へ収容し，

後述する条件で飼育した。仔魚への餌料系列には，シオミズツボワムシL型を5 日齢から，配合飼料（ラブラァバ，林兼産業）を30日齢から，アルテミアのノ

(28)

ープリウス幼生を 37 日齢から給餌した。シオミズツボワムシとアルテミアは，

栄養強化剤（バイオクロミスリキッド，クロレラ工業）により栄養強化した。

飼育水には紫外線殺菌海水を用い，シオミズツボワムシの給餌期間中はナンノクロロプシスを50 cells/mlになるよう添加した。

試験方法

本実験における飼育条件をTable 1に，水温処理方法をFig. 8に示す。また，

実験に用いた仔魚の発育ステージの分類・表記は，有瀧ら（2001）に従った。

試験1では全長6.1±0.1 mm（4日齢，ステージC）の仔魚1,000尾を200 l水槽に収容し，10℃，20℃，23℃，26℃，28℃および自然水温（12.9-26.7℃）の 6つの異なる条件下で飼育した。試験2では全長15.0±1.3 mm（40日齢，ステージG～H）の仔魚1,000尾を1 kl水槽に収容し，26℃，28℃および自然水温

（13.6-27.9℃）で飼育した。試験3では全長18.7±1.5 mm（46日齢，ステージH）の仔魚1,000尾を500 l水槽に収容し，23℃および自然水温（14.2-29.0℃）

で飼育した。試験4では全長34.6±3.9 mm（95日齢，ステージI）の稚魚300 尾を300 l水槽に収容し，28℃および自然水温（14.8-24.9℃）で飼育した。28℃ での飼育は130日齢（28℃-a区）および146日齢（28℃-b区）までとし，以降は自然水温とした。各試験において，自然水温で飼育した水槽を対照区とした。

試験区における水温設定は，設定水温になるまで 1℃/日の割合で飼育水を昇温または冷却した。また，自然水温が設定水温を超えた場合には，自然水温で飼育を継続した。各水槽の水温はデジタル温度計（SK-250WPⅡ-K，佐藤計量器製作所）を用い，毎日午前8～9時頃に測定した。

(29)

Table 1. Outline of the rearing experiments

Exp. Water temperature (℃)

Age of days at the start of experiment

(DAH)

Initial number of

larvae / tank Capacity of tank (kl⁾

1

Control 1020 23

4 1,000 0.2

Control

2628 4 5,000 0.5

2 Control

2628 40 1,000 1

3 Control

23 48 1,000 0.5

4 Control

28-a28-b 95 300 0.3

Table 1. Outline of the rearing experiments

Exp. Water temperature (℃)

Age of days at the start of experiment

(DAH)

Initial number of

larvae / tank Capacity of tank (kl⁾

1

Control 1020 23

4 1,000 0.2

Control

2628 4 5,000 0.5

2 Control

2628 40 1,000 1

3 Control

23 48 1,000 0.5

4 Control

28-a28-b 95 300 0.3

(30)

20 DAH 17 DAH

200 A

B

C

D

Cont.

28℃

26℃

10℃

23℃

0

20℃

26℃ 28℃

Cont.

23℃

Cont.

28℃-a

28℃-b

DAH

W ater te m per a tu re ( ℃ )

4 DAH

50 DAH 65 DAH 62 DAH 15 DAH 22 DAH

17 DAH

59 DAH

49 DAH

95 DAH 110 DAH

131 DAH 146 DAH

138 DAH

150 DAH

30 0 30

0 30

0

122 DAH

142 DAH

192 DAH 140 DAH

141 DAH 20 DAH

17 DAH

200 A

B

C

D

Cont.

28℃

26℃

10℃

23℃

0

20℃

26℃ 28℃

Cont.

23℃

Cont.

28℃-a

28℃-b

DAH

W ater te m per a tu re ( ℃ )

4 DAH

50 DAH 65 DAH 62 DAH 15 DAH 22 DAH

17 DAH

59 DAH

49 DAH

95 DAH 110 DAH

131 DAH 146 DAH

138 DAH

150 DAH

30 0 30

0 30

0

122 DAH

142 DAH

192 DAH 140 DAH

141 DAH

Fig.8. Experimental design for study on temperature effects in spotted halibut Verasper variegatus.

A, Experiment 1; B, Experiment 2; C, Experiment 3; D, Experiment 4. Control fish was reared on natural water temperature.

(31)

サンプリング

試験1では15，25および30～100日齢まで10日毎に各試験区から10個体ずつサンプリングし，試験終了時（200日齢）に対照区，10℃区および20℃区からそれぞれ 120 個体，23℃区から 25 個体をサンプリングした。なお，26℃ および28℃区ではへい死魚が多かったため，7日齢において各10個体をサンプリングした。また，26℃区では40日齢に25個体を採集し試験を終了したが，

28℃区はそれまでに全てがへい死した。試験2では40～100日齢の期間，10日毎に各試験区から10個体ずつサンプリングし，試験終了時（200日齢）に対照区から 180 個体，26℃区から 161 個体をそれぞれサンプリングした。ただし，

28℃区では飼育個体が大量へい死したため，140日齢で実験を終了した。試験3 では80～180日齢の期間，10日毎に各試験区から10個体ずつサンプリングし，

試験終了時（200日齢）に各区から 120 尾ずつをサンプリングした。試験4 では 134 日齢および 174 日齢に各試験区から10 尾ずつサンプリングし，試験終了時（200日齢）に対照区から177個体，28℃-a区から158個体および28℃-b 区から75個体をそれぞれサンプリングした。

生残率の算出

試験開始時から50日齢，51～100日齢，101～150日齢，151～200日齢までの生残率と試験期間内での生残率をそれぞれ求めた。生残率は以下の式により算出した。

生残率 (%) ＝ (生残個体数／収容個体数または各期間の初日の生残個体数)

×100

(32)

生殖腺の組織学的観察および雌雄比の調査

サンプリングした全ての供試魚は全長を測定した後，ブアン氏液で固定し，

70％エタノールで保存した。固定した生殖腺を定法により 5 μm のパラフィン切片にし，ヘマトキシリン・エオシンの二重染色を施し，光学顕微鏡下で観察した。また，飼育水温と雌雄比の関係を明らかにするため観察にはすべての実験区の仔稚魚を用いた。雌雄の判別には，生殖腺内に形成される卵巣腔と精小嚢，および卵母細胞と精原細胞の有無を用いた。雌雄比は，雌に対する雄の割合で表した。

生殖腺体指数（GSI）の算出

生殖腺体指数（GSI）は以下の式により算出した。

GSI=（生殖腺重量／体重）×100

統計処理

性比の偏りおよび生残率の有意差はχ²検定により行った。全長およびGSIの有意差は一元配置の ANOVAの後，Tukey-Kramer 法による多重比較により求めた。

結果

水温の実測値

各試験における水槽の水温変化をFig. 9 に示す。試験1の自然水温は試験開始時に14.0℃であったが，122日齢には20℃，142日齢には23℃に達し，試験終了時には 25.6℃に達した（対照区）。20℃および 23℃区の加温は自然水温

(33)

31

(34)

が加温区の設定水温と同等になった時点で終了した。20℃区における設定水温到達後の平均水温は19.9±0.18℃，23℃区におけるそれは22.9±1.06℃，26℃区では26.4±0.27℃，28℃区では28.8±0.05℃であった。試験2の自然水温は試験開始時に 15.9℃であり，試験終了時には 26.3℃であった（対照区）。26℃区の加温は192日齢には26℃を超えたため終了した。28℃区は140日齢までにほとんどの個体がへい死したことから，140 日齢で飼育を中止した。26℃区における設定水温到達後の平均水温は 25.9±0.24℃ ，28℃ 区におけるそれは 27.8±0.20℃であった。試験3の自然水温は試験開始時に15.7℃であったが，141 日齢において 23.0℃に達し，試験終了時には 27.8℃となった（対照区）。23℃ 区の加温は，自然水温が加温区の設定水温と同等となった時点で終了した。23℃ 区における設定水温到達後の平均水温は，23.0±0.62℃であった。試験4の対照区における自然水温は試験開始時に16.2℃，試験終了時に24.8℃であった。28℃ -a区および28℃-b区は，それぞれ130日齢および146日齢に28℃での飼育を終了し，徐々に水温を低下させた後，138 日齢および 150 日齢に自然水温に戻した。28℃-a 区における設定水温到達後の平均水温は 28.4±0.92℃，28-b 区におけるそれは28.7±0.83℃であった。

生残および成長

試験1における10℃，20℃および対照区の試験終了時の生残率は，それぞれ 26.5，24.1 および 34.8％であり，対照区のそれが最も高くなった (χ²-test， P<0.05) （Table 2）。10℃および20℃区間を除く各区の生残率には有意差が認められた (P<0.05)。加温した試験区のうち，23℃，26℃および28℃区では 50 日齢までに大量減耗し，生残率が著しく低下した。特に，28℃区では20日齢までに全ての仔魚がへい死し，26℃区では40日齢までに生残率が0.5%となった

(35)

(36)

Fig. 10. Changes in mean total length of spotted halibut Verasper variegatus during the experiments.

Vertical bars show the standard errors. Different letters show significantly different mean values (P<0.05).

(37)

ことから飼育を中止した。試験終了まで飼育できた 23℃区の生残率は 2.5％であった。

この試験における仔稚魚の全長は，対照区および 20℃区で 35.4±5.2 mm および37.7±3.0 mmであったのに対し，23℃区ではそれより劣り (P<0.05)，10℃ 区では最も成長が停滞した（Fig. 10-A）。

試験2における26℃および28℃区の生残率は，それぞれ16.2％および0.4％となり，対照区の30.7%より低い値を示した (P<0.05)。また，成長は対照区および 26℃区と比較して 28℃区が遅く (P<0.05)，試験終了時の平均全長は対照区，26℃区，28℃区の順に小さくなった（Fig. 10-B）。

試験 3 における対照区および 23℃区の生残率は，それぞれ 92.1％および 85.9％と高かったが，23℃区の値は対照区のそれより低かった (P<0.05)。23℃ 区および対照区の全長はほぼ同じ値を示し，試験1のように23℃区と対照区の成長差はみられなかった（Fig. 10-C）。

試験4における対照区および130日齢まで加温を継続した28℃-a区の生残率は62.0％および55.7％となり，ほぼ同じであったが，146 日齢まで加温を継続した 28℃-b 区では生残率が 28.3％と低くなった (P<0.05)。平均全長は対照区と比較して，28℃-a区および28℃-b区のいずれにおいても加温期間中には小さかったが (P<0.05)，加温終了後には対照区とほぼ同じ全長を示した（Fig. 10-D）。

性分化

各試験区の100日齢の個体の生殖腺を観察したところ，10℃区（全長21 mm，ステージI）のそれは未分化の状態であった。20℃区（全長38 mm，ステージ I）の生殖腺は卵巣腔および卵母細胞が発達し，雌への分化が認められた。23℃

区（全長28 mm，ステージI）の生殖腺には，卵巣腔および染色仁期の卵母細

(38)

胞が認められた。26℃区（全長39 mm，ステージI）の生殖腺に卵巣腔が観察され，雌への性分化が認められたが，卵母細胞は染色仁期であった。28℃区（全長23 mm，ステージH～I）の生殖腺は未分化であった。28℃区では全長25 mm

（140日齢）でも性分化は始まっておらず，生殖腺には生殖原細胞が数個観察されるにとどまった。

性比

試験1 では23℃区において雄/雌比は 2.28であり，雄への偏りがみられたが (χ²-test，P<0.05)，10℃，20℃および対照区の性比は1:1（雄/雌比0.94～1.04）であった（Table 3）。26℃区および28℃区は生残率が低く，途中で飼育を中止したため，性比の算出に至らなかった。試験2では26℃区において雄が雌よりも多かったが（雄/雌比 1.33），有意差は認められなかった。28℃区では生残尾数が少なく，性比の算出には至らなかった。試験3では23℃区および対照区の性比は1:1であった。試験4では131日齢まで28℃で飼育した後，自然水温にした28℃-a区と対照区の性比は1:1であったが，146日齢まで28℃で飼育した 28℃-b区は雄への偏りが認められた (P<0.05)。

GSI

試験 4 の実験終了時に全供試魚から生殖腺を摘出し，GSI を算出した (Fig.

11)。雌のGSIは28℃-a区および28℃-b区が対照区と比較して小さく (P<0.01）， 28℃-b区は28℃-a区と比較しても小さかった (P<0.01)。GSIは対照区，28℃ -a区，28℃-b区の順に小さくなり，加温期間が長くなるに従いGSIも小さくなった。雄の GSI は 28℃-a 区および 28℃-b 区が対照区と比較して小さく

（P<0.05），28℃-a区と28℃-b区の間では有意差は認められなかった。

(39)

Table 3. Sex ratio of spotted halibut in each experiment

Exp. Water temperature

(℃)

Beginning of experiment

(DAH) Female Male Total Sex ratio

(Male/Female)

1

Control

4

62 58 120 0.94

10 59 61 120 1.03

20 60 60 120 1.00

23 18 41 59 2.28^＊

26 - - - -

28 - - - -

2 Control

40 95 85 180 0.89

26 69 92 161 1.33

28 - - - -

3 Control 48 69 51 120 0.74

23 59 61 120 1.03

4 Control

95 97 80 177 0.82

28-a ^*1 89 69 158 0.78

28-b ^*2 28 47 75 1.68^＊

Control fish was reared natural water temperature. Asterisks show significant difference from theoretical 1:1 sex ratio (P<0.05) .

*1, The group started heating-up to 28℃at 95 DAH and kept 28℃until 131 DAH;

*2, The group started heating-up to 28℃at 95 DAH and kept 28℃until 146 DAH.

Table 3. Sex ratio of spotted halibut in each experiment

Exp. Water temperature

(℃)

Beginning of experiment

(DAH) Female Male Total Sex ratio

(Male/Female)

1

Control

4

62 58 120 0.94

10 59 61 120 1.03

20 60 60 120 1.00

23 18 41 59 2.28^＊

26 - - - -

28 - - - -

2 Control

40 95 85 180 0.89

26 69 92 161 1.33

28 - - - -

3 Control 48 69 51 120 0.74

23 59 61 120 1.03

4 Control

95 97 80 177 0.82

28-a ^*1 89 69 158 0.78

28-b ^*2 28 47 75 1.68^＊

Control fish was reared natural water temperature. Asterisks show significant difference from theoretical 1:1 sex ratio (P<0.05) .

*1, The group started heating-up to 28℃at 95 DAH and kept 28℃until 131 DAH;

*2, The group started heating-up to 28℃at 95 DAH and kept 28℃until 146 DAH.

(40)

Fig. 11. Gonadosomatic index (GSI) of female and male in experiment 4.

Vertical bars show the standard errors. Different letters show significantly different mean values (P<0.05).

(41)

考察

試験1においてホシガレイを23，26および28℃で飼育したところ，これらの試験区における50日齢までの生残率は対照区（水温12.4～16.4℃）のそれと比較して低い結果となった。これは，23℃以上の高水温が本種仔魚の生残に悪影響を与えていることを示している。これまでにも，ホシガレイ仔稚魚の生残率は12～21℃の範囲において水温が低いほど高い傾向を示すが（佐久間2001）， 27℃では生残率が低下することが報告されている（村田1998）。九州西岸において本種の天然仔魚が採集された際の海水温は11.1～15.7℃である（乃一ら 2006；Wada et al. 2006，2012）ことから，23℃以上の水温はホシガレイ仔魚の好適水温から大きく外れており，それが生残率を低下させる原因であると推察される。このような高水温による生残率の低下は，同じ異体類のヒラメ仔魚でも報告されており，10～22日齢のヒラメ仔魚は20～24℃において高い生残率を示すが，26℃以上になると生残率が低下し，27℃が半数致死温度であるとされる（嶋田ら2006）。日本沿岸の天然海域においてヒラメ仔稚魚が確認された場所の水温は12～25℃であることから（下茂ら2000），26℃以上の水温はヒラメの好適水温より高いと考えられる。このように本種で確認された高水温による生残率低下は，ヒラメ仔魚でも観察される現象であるが，本種の生残における適正水温の上限はヒラメのそれよりもやや低いと考えられる。

本研究で実施した26℃および28℃飼育において，4日齢から加温した試験1 では仔魚が大きく減耗し，40日齢までに飼育を中止したが，40日齢以降に加温した試験2では対照区と比較して生残率が低くなったものの試験終了まで生残した。これは仔魚の高水温耐性が40日齢以降に向上していることを示唆している。有瀧ら（2001）による仔魚の発育ステージの分類では，30日齢には上屈前

(42)

仔魚期および上屈仔魚期であるステージDおよびE，40日齢には眼の移動が開始したステージGおよび有眼側にほぼ移動を終えたステージHに達していた。

ステージGは底棲生活への移行期で，着底生活に必要な機能はほぼ完成していることから（有瀧ら2001），高水温耐性の向上はこのような生活様式の変化と深く関わっている可能性が高い。また本研究において，稚魚への変態完了後の 95日齢以降に28℃へ加温した試験4の生残率は，上述した4日齢および40から28℃へ加温した試験1および試験2の結果よりも高くなった。これは，仔稚魚の高温耐性が変態後の成長に伴い，上昇することを示唆している。変態時の異体類の仔魚では，急激な生理学的・形態学的変化が引き起こされるが（堀田ら2001），このような時期は外部環境の変動に敏感である可能性が高い。マガレイPleuronectes herzensteini では生息水温が0～23℃とされるものの，仔魚飼育においては水温21℃以上では安定した飼育が行えないことから，この水温はマガレイ仔魚にとっての適水温から外れていると述べられており（有瀧1996），本種やマガレイの着底前の変態期仔魚にとって高水温は生残に対する負の要因として作用すると考えられる。

本研究におけるホシガレイ仔魚の成長は，自然水温で飼育した対照区と比較して20℃では促進されるものの，それ以外の試験区では同等もしくは劣っており，特に10℃および28℃では成長が著しく停滞した。ホシガレイ仔魚の成長は，

水温9～21℃の範囲において水温が高いほど促進される（有瀧ら2004）。また，

稚魚の飼育適水温は18～24℃であり，最適飼育水温は21℃付近にあるとされている（村田ら1998）。これらの報告と本研究の結果はよく一致しており，ホシガレイの仔稚魚の成長促進を目的とした飼育水の加温は，20～21℃が良いと考えられる。

ホシガレイの理論上の性比は雌雄1:1であり（Ji et al. 2010），本研究におい

(43)

ても，10～20℃による飼育試験では1:1の性比が得られた。しかし，ヒラメ科およびカレイ科魚類では性的未分化期に高水温で飼育すると性比が偏ることが知られている。例えば，ヒラメでは40日齢から飼育水温を25.0～27.5℃として飼育すると性比が雄に偏り，27.5℃では全ての個体が雄になる（山本1992）。またマツカワでは，32～79日齢（全長10.1～29.7 mm）の個体を14℃から18℃ に昇温して飼育を続けると性比が雄に偏り，10.1 mmから昇温した個体では全てが雄となる（Goto et al. 1999）。本実験ではヒラメ科およびカレイ科魚類の特徴として考えられる性的未分化期の性決定に関するゆらぎの大きさに注目し，

高水温飼育を行うことよって雄化の誘導を試みた。その結果，4日齢から23℃ で飼育した個体のうち69.5％が，また95日齢から28℃で飼育した個体のうち 62.7％がそれぞれ雄となったことから，他のヒラメ科およびカレイ科魚類と同様にホシガレイの性分化には水温が影響することが明らかとなった。これは，

23℃よりも高水温で本種仔魚を飼育すれば，完全に雄化が誘導される可能性を示している。しかし，本実験で実施した高水温飼育では生残率が大幅に低下し，

ヒラメおよびマツカワのように，すべての種苗の雄化誘導には至らなかった。

本研究で用いた23～28℃の飼育に限らず，本種の仔魚は21℃の飼育でも生残率が低下するという（有瀧ら2004）。これは，同じ異体類であっても，性分化に影響を与える水温域と生存に影響を与える水温域とが大きく異なることを示唆している。さらに興味深いことに，試験2で実施した40日齢からの28℃飼育群の140日齢の稚魚において，生殖腺内に始原生殖細胞のみが存在する性的未分化個体のみが観察された。このように，28℃処理は雄化を誘導する可能性を持つものの，長期に亘る高温処理は成長および生残だけでなく生殖腺の発達そのものを強く阻害することを示唆している。

マツカワを用いた温度処理による雄化誘導試験では，性分化に影響を及ぼす

(44)

温度感受性の獲得と消失が論じられており，全長約10 mm（32日齢）から温度感受性が発現した後，成長に従い感受性が低くなり，全長約41 mm（95日齢）

では昇温飼育しても性比は1:1と変わらないことから，この時期に温度感受性は消失すると考えられる（Goto et al. 1999；萱場2005）。本研究では，全長6 mm

（4日齢，Bステージ）の仔魚を23℃で飼育すると雄化が誘導されたことから，

変態前の仔魚において性分化に影響を与える温度感受性が備わっていることが判った。また，全長35 mm（95日齢，Iステージ）のホシガレイ稚魚を28℃で全長70 mm（150日齢）まで飼育したところ性比が雄へ偏った（雄/雌比 1.68）ことから，少なくとも全長70 mmまで温度感受性が残っていると考えられる。

雄化を誘導する温度に対する反応性は，マツカワでは14℃から18℃への4℃の昇温飼育で雄化することから比較的高い。一方，ホシガレイでは15℃から約5℃ の昇温飼育では雄化せず，8～13℃の昇温でようやく性比の雄への偏りがみられたことから，マツカワと比べ雄化を誘導する温度に対する反応性が低いと考えられる。このように，同属のマツカワとホシガレイでも温度感受性や反応性に違いがあることが判った。

本研究の結果は，本種が水温操作によって性転換を誘導できる魚種ではあるものの，他の異体類と比較すると，人為的な雄への性転換は容易ではない魚種であることを示している。それは本種の性決定のゆらぎがヒラメやマツカワなどよりも少ないことに起因するのかも知れない。このような，性決定に及ぼす遺伝的支配の強さや環境影響の感受性などを今後明らかにする必要がある。

(45)

第3節メチルテストステロン投与による性転換

これまで述べてきたとおり，全雌種苗生産には遺伝的雌を雄化し偽雄を作出することが重要である。ヒラメやマツカワ等の異体類が持つ水温依存性の性決定を利用した雄化は本種においても可能であったが，高水温による仔稚魚の飼育は生残にも悪影響を及ぼしたことから，効率的に雄へ誘導することができなかった。

全雌種苗の生産においては，大量の雌種苗を同時に得られることから，遺伝的雌を雄化した偽雄の精子を用いた種苗生産が実用性の高い技術と考えられている。偽雄の作出には，水温調節または雄性ホルモン投与等によって遺伝的雌を人為的に雄化することが必要である。性ホルモンによる魚類の性転換（性分化誘導）は古くから試みられており（隆島・会田 1984），同属のヒラメではメチルテストステロン（以下，MT）投与により雄化した偽雄を用いた全雌種苗生産が実証されている（山本1992）。本種においても，MT処理により作出した偽雄の精子を用いて全雌種苗生産が可能と考えられる。しかし，MTを用いた雄への誘導においては，その投与量によっては正常に雄化されないことや，過剰投与すると逆に雌化が促されたり（Nakamura 1975；Tabata 1991；山本1992；藤岡1993；山本1995），生残率が低下すること（安藤ら2008）が知られている。

従って，MT処理を本種の雄化誘導に利用する場合には，その投与量を十分に検討する必要がある。そこで本研究では，異なる量の MT をホシガレイ仔稚魚へ経口投与し，生残および性分化に及ぼす MT の影響を調べた。また，併せて投与する期間の検討も行った。

(46)

供試魚

平成20～23年の1～2月に長崎県橘湾で漁獲された天然親魚からヒト絨毛性生殖腺刺激ホルモン（HCG）を用いて採卵し，人工授精により得られた仔稚魚を後述する条件で飼育して供試魚に用いた。仔魚には，シオミズツボワムシ L 型Brachionus plicatilisを5～50日齢，アルテミアArtemia sp.の幼生を37～ 50日齢，配合飼料（ラブラァバ，林兼産業）を30日齢から給餌し，50日齢以降は配合飼料のみを与えた。シオミズツボワムシとアルテミアは，栄養強化剤

（バイオクロミスリキッド，クロレラ工業）により栄養強化した。シオミズツボワムシの給餌期間中はナンノクロロプシス Nannochloropsis oculata を 50

cells/mlになるよう飼育水に添加した。

試験方法

MT 投与濃度の検討を試験 1 および 2 において，効果的投与期間の検討を試験3および4においてそれぞれ実施した。MT投与試験区の配合飼料には，MT

（メチルテストステロン，和光純薬工業）を溶かした 99.5％エチルアルコールを均一に添加した後，アルコールを除去するため十分に乾燥させた。対照区の配合飼料には，試験区と同量の 99.5％エチルアルコールのみを添加し，同様の処理を行った。これを毎日，6～8 回飽食給餌した。MT 添加濃度，投与期間を含む飼育条件をTable 4に示す。各試験における MT の投与開始時の仔魚の発育段階は，有瀧ら(2001)の分類でステージGであった。試験1では，MTを0.1， 1，10 μg/g･diet で添加した区および無添加（対照区）区の計 4 区を設けた。

35日齢の仔魚を500尾ずつ0.5 kl水槽へ収容し，40～300日齢の期間，MT添

ホシガレイの全雌種苗生産技術の開発に関する研究