北里大学理学部生体分子構造学 ( 物理学科 & 生物科学科 3 年生 ) 米田茂隆北里大学理学部物理学科神奈川県相模原市南区北里生体分子の構造を決定解析するための大規模研究施設 ( 左 )SPrin

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生体分子構造学 1 北里大学理学部生体分子構造学 (物理学科＆生物科学科３年生) 米田茂隆北里大学理学部物理学科〒252-0373 神奈川県相模原市南区北里 1-15-1 Email [email protected]

生体分子の構造を決定・解析するための大規模研究施設

↑（左）SPring 81_{と SACLA}2_{（シンクロトロンと X 線自由電子レーザー）（右）J-PARC（大強度陽}

子加速施設）3 ↑（左と右）スパコン京（けい）4

1 _{理化学研究所が播磨学園都市にもつ第３世代Ｘ線放射光源。建設費 1100 億円、消費電力約 40MW（4 万キロワット）。} 電子を光とほぼ等しい速度まで加速し、電磁石によって進行方向を曲げて放射光を発生する。遠赤外から可視光線、軟 X 線を経て硬 X 線に至る幅広い波長域をもち、原子核、ナノテクノロジー、バイオテクノロジーなどの分野での日本の先端科学・技術を支える高度先端科学施設。国内外の大学・研究所・企業から年間 1 万 4,000 人以上の利用者。 2 _{第 3 期科学技術基本計画における 5 つの国家基幹技術の 1 つとして位置付けられ、SPring-8 に隣接して建設費 400 億円}

で 2011 年 3 月に完成した第 4 世代放射光源（X 線自由電子レーザー、XFEL、X-ray Free-Electron Laser）。これまでの放射光と比べて､輝度 10 億倍、パルス幅 1,000 分の 1 （10 フェムト秒）、位相のそろったコヒーレントな X 線、最短波長 0.06 nm という特徴がある｡すでに米国 LCLS がある他、韓国 PAL-XFEL とドイツ European XFEL が建設中（世界４大 XFEL）。 3 _{日本原子力研究開発機構が東海村にもつ陽子シンクロトロン。中性子実験を目的として建設費 1500 億円で作られた。} 主に米国に数カ所の同様の施設がある。運転費年 150 億円。 4_{理化学研究所が播磨学園都市にもつ計算速度約 10 ペタフロップス（100 万ギガフロップス）の 2011 年から 2012 年にお} いて世界最高速のコンピュータ（最近の高級パソコンのチップ Intel I7 は約 100 ギガフロップス）。建築費約 1100 億円、年間維持費約 80 億円（うち電気代は年 20〜30 億円）。消費電力は約 10MW（1 万キロワット）であり、福島原発 1 号機の発電能力の約 2%の電力を消費。

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最近のタンパク質の構造

Aminoacyl-tRNA Synthetases (Asp)

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2014 年夏学期北里大学理学部生体分子構造学米田茂隆 3 Acetylcholine Receptor 課題（次週以降）１．RCSB Protein DataBank から，上記のタンパク質の構造ファイルを検索する２．そのうち１ファイルをダウンロードする３．RasMol で表示する

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アミノ酸化学式

下表の２０種のアミノ酸が重要なアミノ酸である。これらの化学式を見たら、名前を言えるようにしておこう。5

グリシン, Gly, G トレオニン, Thr, T グルタミン酸, Glu, E ヒスチジン, His, H

アラニン, Ala, A セリン, Ser, S アスパラギン, Asn, N トリプトファン, Trp, W

バリン, Val, V システイン, Cys, C アスパラギン酸, Asp, D アルギニン, Arg, R

ロイシン, Leu, L メチオニン, Met, M フェニルアラニン, Phe, F リジン, Lys, K

イソロイシン, ILE, I グルタミン, Gln, Q チロシン, Tyr, Y プロリン, Pro, P

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2014 年夏学期北里大学理学部生体分子構造学米田茂隆 5 アミノ酸はどれも左図のような基本的な構造をもっている。左図で側鎖と書いてある球（注：図では側鎖を１つの球で表したが、実際は共有結合で結合された複数の原子である）がアミノ酸の種類により異なるだけである6_。側鎖以外の部分を主鎖という。主鎖の原子は N、H、Cα、Hα、 C、O という名称をもつ。Cαと共有結合している４個の原子は四面体構造という配置をしており、L 型と D 型、２つの光学異性体がある。左図は天然に存在する L 型アミノ酸の構造を描画している。N と共有結合をしている３個の原子は四面体構造から１原子欠けた配置をとる。C と共有結合している３個の原子は一部に 2 重結合があるため平面構造の配置をする。側鎖の水素以外の原子には、Cα 原子から遠ざかるにつれ、ギリシャ文字のアルファベットの順番7_{でβ、γ、...という名称がつく。側鎖の水素原} 子はそれが共有結合している原子の名称を流用する。アミノ酸を水中に入れると酸塩基平衡により解離して、通常の pH では、右図のように末端の NH2に水素原子 H+が付いて NH₃+となり、末端の COOH からは水素原子 H+がとれて COO-となる。末端の NH3は＋１e8の電荷をもち、COO

は−１e の電荷をもっている。２個のアミノ酸は、下図のように末端のアミノ基（NH₂）とカルボキシル基（COOH）の間で共有結合（ペプチド結合）9_{を形成することができる。ペプチド結合を次々と形} 成すれば、複数のアミノ酸が鎖のようにつながることができる。できた化合物をペプチドと呼ぶ。ペプチドの中の各アミノ酸１つ１つをアミノ酸残基と呼ぶ。ペプチドの大きいものをポリペプチド、またはタンパク質と呼ぶ。ペプチドのアミノ酸残基の名称をアミノ末端（N 末）からカルボキシ末端（C 末）まで順に並べたものをアミノ酸配列（または、ペプチドの１次構造）という。下図のペプチドのアミノ酸配列は Arg-Gly-Asp（あるいは、一文字コードを用いて RGD）である。ペプチドの化学構造はアミノ酸配列を指定すれば、当然、１つに決定できるし、立体構造についても多くの場合１つに決定できる。アミノ酸配列を指定するとペプチド立体構造が決定される現象を Anfinsen のドグマ10_という、

6 _{プロリン（Pro）だけは例外。前ページの図のように、側鎖が環状になって、主鎖の N と共有結合している。} 7 _{ギリシャ語のアルファベットの順番はα、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ、}_{...である。} 8 _{e は素電荷を表す。} 9 _{脱水縮合という化学反応である。アミド結合、あるいはペプチド結合という。} 10 _{Anfinsen は溶液条件さえ整えればリボヌクレアーゼが変性状態から天然状態の正しい構造にもどることを示し、「一} 般的にタンパク質は自発的にアミノ酸配列に応じて熱力学的に最も安定な立体構造をとる（フォールディングする）」と主張した。ただし、これは単純な場合しか成り立たず、フォールディングに際しシャペロンの補助を必要とするタンパク質や、天然状態では構造が確定していない天然変性タンパク質なども存在することが最近は知られている。

側鎖

N

COOH

Cα

Hα

Arg

Gly

Asp

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アセチルコリンレセプターの描画

１）「rcsb pdb」を検索して、表示する

２）rcsb pdb の左の列の中にある「PDB-101」の「Molecule of the Month」をクリックして、その中の「Acetylcholine Receptor」をクリックする11_。そのウ

ィンドウから「Read More」を選んで、説明を読む。３）rcsb pdb の search 欄に「acetylcholine receptor」と入力して、最近は多数のアセチルコリンレセプターの構造が決定されていることを確認する。

４）rcsb pdb の search 欄に「2bg9」と入力して、多数ある構造のうち Molecule of the Month の説明に使用されていた構造 2bg9 を選ぶ。問題１．2bg9 は何本のペプチド鎖から構成されるか？（ペプチド鎖に A からアルファベット順で名前を付けると、どのように名称が付けられるか?同じアミノ酸配列のペプチド鎖は何本あるか？）２．どのアミノ酸の部分がαヘリックスでどの部分がβストランドか？５）背景を右クリックしてターミナルを起動する。その後、 mkdir -p bms と入力し、bms ディレクトリを作る。さらに、 cd bms と入力して、bms ディレクトリに入る。６）rcsb pdb の search 欄に「2bg9」と入力する。表示された画面の右側の「Download Files」→「PDB File (Text)」を選んで、立体構造ファイル 2BG9.pdb をダウンロードする。７）次のように 2BG9.pdb を bms ディレクトリに移動する。 mv ~/Downloads/2BG9.pdb ~/bms ８）次のように入力して、立体構造を画像表示する。 rasmol 2BG9.pdb ９）アセチルコリン結合部位を赤色で表示せよ。１０）「1yi5」はαコブラトキシンがアセチルコリンレセプターの細胞外ドメインに結合した構造である。アミノ酸配列を調べ、ダウンロードして、立体構造を画像表示せよ。

11 Acetylcholinesterase と間違えないように。

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2014 年夏学期北里大学理学部生体分子構造学米田茂隆 7

ねじれ角

４つの原子が右図のようにつながっているとき、原子 1、2、3 を含む平面と原子 2、3、4 を含む平面がなす角を、原子 1-2-3-4 のねじれ角（２面角）と定義する。ねじれ角の正負は、右ねじが進む方向を正とする。例えば、Br-CH₂-CH₂-Cl という化合物の場合、左図（ニューマン投影図）では、ねじれ角を Br の方から見て表しているが、その角度はマイナス 60°である。

0° シス cis、シン syn 、エクリプス eclipsed 180° アンチ anti、トランス trans 60° ゴーシュ gauche プラス -60° ゴーシュ gauche マイナス原子間の反発を考えると、ゴーシュ型とトランス型がエネルギー的に安定であることが多い。ペプチド主鎖のねじれ角の名称右図のように、主鎖のねじれ角にφ、ψ、ωという名前が付いている。 C-N-Cα-C φ N-Cα-C-N ψ Cα-C-N-Cα ω φ と ψ は基本的に-180°から+180°まで自由に回転しうる。ペプチド結合のまわりの ω はほぼ 180°に固定される12_。 φ と ψ は自由に回転できるとはいえ、原子同士が衝突してしまうような φ と ψ の組み合わせは許されない。下の図は φψ 図、またはラマチャンドラン・プロットと呼ばれ、α（アルファヘリックス、α-helix）、αL（左巻きアルファヘリックス、left-handedα-helix）、β（ベータストランド、β-strand）、310（スリーテンヘリックス、3₁₀-helix）、π（パイヘリックス）と示された領域だけが実際にとりうる値である13_{。なお、β ストランド領域のうち、特に} φ＝180°、ψ＝180°の場合を特に伸直構造（extended structure）と呼ぶ。

12 _{ペプチド結合（ペプチドのＣとＮの間の共有結合）は、本来、単結合だが、ＣとＯの間の２重結合に関与する電子の一} 部がペプチド結合に流れ込むため、２重結合に近い性質をもっている。ねじれ角 ω は 180°か０°の値をとる傾向が強い（ω のポテンシャル障壁は高い、と言う）。しかも、ほとんどの場合、２つのＣα 間の立体障害（原子間の衝突）から ω は 180°となる。例外的にプロリンの C と他の何かのアミノ酸のＮの間のペプチド結合の ω は０°になる場合があり（確率で言うと、１割くらい？）、そのプロリンをシス・プロリンと呼ぶ。 13 _{アミノ酸の種類によって原子同士の衝突のぐあいが異なるので、ラマチャンドラン図はアミノ酸ごとに微妙に異なる。}

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表．各種２次構造の典型的な主鎖ねじれ角値２次構造 φ ψ αヘリックス -57 -47 3₁₀ヘリックス -49 -26 πヘリックス -57 -70 左巻きαヘリックス 57 47 平行βシート -119 113 逆平行βシート -139 135 伸直型 180 180 βターンＩ -60（第ｉ+1 残基） -30（第ｉ+1 残基） βターンＩ -90（第ｉ+2 残基） 0（第ｉ+2 残基） βターンＩ' 60（第ｉ+1 残基） 30（第ｉ+1 残基） βターンＩ' 90（第ｉ+2 残基） 0（第ｉ+2 残基） βターンＩＩ -60（第ｉ+1 残基） 120（第ｉ+1 残基） βターンＩＩ 80（第ｉ+2 残基） 0（第ｉ+2 残基） βターンＩＩ' 60（第ｉ+1 残基） -120（第ｉ+1 残基） βターンＩＩ' -80（第ｉ+2 残基） 0（第ｉ+2 残基） γターン 70～85 -60～-70 インバースγターン -70～-85 60～70

アミノ酸側鎖の分類（括弧内は pK

14

_）

極性（親水性）酸性：Asp (4.5), Glu (4.6)

中性：Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr (9.7), Cys (9) 塩基性：Lys (10.4), Arg (12), His (6.2) 非極性（疎水性）

Trp, Phe, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met N 末端の NH2(7)、C 末端の COOH(4)

14 _{N、O、S に結合している水素原子は水溶液の pH に対応して解離したり余分に結合したりする。その解離結合が起こる} pH の値を pK という。例えば、 His の pK が 6.2 というのは、pH=6.2 以下の水溶液では His の側鎖に余分に１つ水素が加わるという意味であり、Asp の pK が 4.5 というのは pH=4.5 以上の水溶液で Asp の側鎖の OH の H が解離するという意味である。

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光学異性体

15 L 型アミノ酸の Cα 原子は、左図のような光学異性体しか天然には存在しない16_。

水素結合

水素結合とは、O や N などが H を仲介にして形成する相互作用である。右図のように、H と共有結合している原子をドナー、そうでない原子をアクセプターとよび、ドナーとアクセプターの間の距離が 3.2Å 以内、水素とドナーとアクセプターのなす角が 30°以内という条件が、しばしば水素結合形成の判断基準とされる。水素結合が形成される事により、ドナーと H の間の共有結合の距離はかならず伸びるし、さらに切断されて H がアクセプターと共有結合しまうこともある。

βシート

βストランド（φ～180°、ψ～180°）のペプチド鎖が 2 本、逆平行か平行に並ぶと、下図のように主鎖のＯとＮが水素結合を形成し、βシートと呼ばれる平面的な構造ができる。図．逆平行βシート（左）と平行βシート（右）の水素結合逆平行βシートでは、残基 i のＮとＯが向かいの鎖の残基 j のＯとＮに水素結合する。平行βシートでは、残基 i のＮとＯが向かい合った残基 j の隣の残基 j －１のＯと残基 j＋１のＮに水素結合する（１残基分、またいでいる）。

15 _C だけでなく、Ile などいくつかのアミノ酸の側鎖では立体中心が存在し、特定の光学異性体しか天然には存在しない。 16_{立体中心の原子を中心とし、それに結合している最も軽い原子を奥に向け、残りの原子を重いのを先に軽いのを後にた} どったとき、右回りになるものを R 体、左回りになるものを S 体という。L 型アミノ酸は S 型である。

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図．逆平行βシート（左）と平行βシート（右）の水素結合の模式図（＋は側鎖が紙面より手前、－は側鎖が紙面の奥に向かっている） βシートの主鎖は完全な平面ではなく、ヒダができるのが普通なので、 β pleated sheet と呼ばれることがある。右図は逆平行βシートのヒダを見えやすくした画像である。平行βシートも同様にヒダをもつ。左図のように、βシートにはヘアピン型（左図の左）とクロスオーバー型（左図の右）という用語がある。また、下図のように、クロスオーバーには右巻きと左巻きの２種類があり、数字とx と＋－により表記できる17_,18_。

17 x はクロスオーバーの意味である。 18 ＋－は別の方向から見ると、逆になるので絶対的な意味ではない。

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へリックス

ヘリックスは、アミノ酸残基が水素結合によってつながってできるらせん様の構造である。らせん様の構造としては、αへリックス、左巻きαへリックス、310へリックス、πヘリックス、左巻き αヘリックスがある。表．へリックスのパラメータ図．へリックスの構造．左から順に、３₁₀ヘリックス、αヘリックス、πヘリックス図．ヘリックス内の水素結合

ターン

ペプチド鎖が曲がった部分をターン（turn、折れ曲がり構造）と呼ぶ。右図はβターンである。ｉ残基とi+1 残基の側鎖はどれも紙面手前に向く。βターンはI 型、II 型、I’型、II’型に分類される。骨格の構造について言うと、Ｉ’型はＩ型の、ＩＩ’型はＩＩ型の鏡像体である。下図のように、I 型βターンはｉ残基と i+1 残基のカルボニルが紙面向こう側に出ている。II 型βターンはｉ残基のカルボニルが紙面向こう側に、i+1 残基のカルボニルが紙面から手前に出ている。I'型βターンはｉ残基と i+1 残基のカルボニルが紙面から手前に出ている。II'型βターンはｉ残基のカルボニルが紙面から手前に、i+1 残基のカルボニルが紙面向こう側に出ている。２次構造ピッチリングの大きさ αヘリックス 5.4Å 3.6 残基（13 原子） 310へリックス 6.0Å 3.0 残基（10 原子） πヘリックス 5.1Å 4.3 残基（16 原子）左巻きαヘリックス 5.4Å 3.6 残基（13 原子）

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図．左から順に、I 型βターン、II 型βターン、I'型βターン、II'型βターン

出現確率はI 型が一番多く、I ＞ II ＞ II' ＞ I'の順で小さくなる。Ｉ型以外は、側鎖と主鎖の立体障害（原子の衝突）のため、２つの残基のどちらかがグリシンなのが普通である。βターン以外にも、γターン、インバースγターンなどがある。下図のように、γターンはβターンより残基が１つ少ない。インバースγターンはγターンの鏡像体である。特に、i+1 残基のＣαの向きが異なる。水素結合はβターンより弱い。図．γターン（左）とインバースγターン（右）

バルジ

右図のように、βシートの中で１つのβストランドに余分に残基が挿入されて飛び出てしまった部分をバルジ（βバルジ、bulge、突出構造）と呼ぶ。βシートのイボのようなものである。クラシックバルジ、Ｇ１バルジ、ワイド（wide-type）バルジの３つが主要なものである。β バルジが関係してループを作ることがある19_。

19 クラシックバルジは、接近した２本の反平行βストランドの中で作られる。残基１はαヘリックス構造、残基２と残基Ｘは通常のβシート構造である。Ｇ１バルジは接近した２本の反平行βストランド。残基１は左巻きαヘリックスの構造に近く、立体障害のためグリシンであることが多く、Ｇ１バルジという。ワイドバルジは少し離れた２本の反平行βストランドで作られ、水素結合がはずれている感覚が広い。主鎖の構造はさまざまである

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超２次構造

２次構造が組合わさってできたものを超２次構造という図．左から順にβヘアピン、αヘアピン、ロスマンフォールド(βαβ')、グリークキー（ギリシャ鍵）、グリークキー模様のマットレス超２次構造の１つに下図のようなベータ・ヘリックスという構造がある。βヘリックスはベータシートが折れ曲がって全体として角柱状になっているもので、1 本のペプチド鎖からなる一本へリックスと、３本のペプチド鎖がおりなす３本へリックスの２種類がある。βシートのつなぎ目はループであるか、鋭角に折れ曲がる。３角柱状のものが多いが、ペンタペプチドリピートと呼ばれる５残基の配列が20～30 回繰りかえすようなβへリックス構造の場合は４角柱構造である。図：三本鎖βへリックス(A)T4 ファージの gp5C 末端ドメインの一部(PDB コードは 1K28)、(B)同じくgp12 シャフトドメインの一部（1H6W)、(C)連鎖球菌のプロファージのコードスル尾繊維タンパク質(HylP1)の一部（2C3F)。

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蛋白質構造の表示と操作

前回は USA にある RCSB PDB を利用したが、今回はその日本版である PDBj（日本蛋白質構造データバンク）を利用してみよう。１）左のホーム欄の「統計情報」からは、いくつの構造が登録されてきたかという情報が見られる。「リンク集」には関連ウェブが書かれている２）左の検索欄の中の「巨大構造エントリー」を見てみよう。ここには最近、構造決定されるようになった巨大構造の座標が登録されている（現在、数個）。原子数が多いため、従来の「PDB 書式」と言われる書式では対応しきれず、異なる書式のファイルが使われている。注）ただし、巨大構造のファイルは 16GB 程度のメモリーをもつ PC でないと表示が不可能である。ファイルのダウンロードは行わない。

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鍵と鍵穴の関係

化学反応の例として、２つの分子 A と B が重合して C という分子になる化学反応を考えてみよう。 A + B → AB → C 原子核が適切な位置に配置されて適切な速度をもち、また、電子が量子化学的に適切な状態にならなければ、の反応は進行しない。どの程度の頻度でそのような状態が出現するかということにより、反応速度が決定される。この 2 次反応の反応速度は次のように書ける。[A]と[B]はそれぞれ A と B のモル濃度、kは反応速度定数である。さて、下図のように、A と B がそれぞれ触媒上の結合部位に、立体構造がぴったりはまって（鍵と鍵穴の関係）長時間滞在したとしよう。その位置と方向が化学反応を起こすために必要な方向と位置に近いなら、格段に化学反応の確率が高くなる（遷移状態が安定化する）。そのため、実効的に反応速度定数が増加し、反応が速くなる。反応速度論的には「触媒により遷移状態の自由エネルギーが低下して、反応速度が増加した」と言える。平衡論的に考えれば、化学平衡にあると化合物の量（A と B と C の量）の割合は変える事ができない。しかし、非平衡系では、反応速度は適切な触媒さえあれば化学反応の反応速度は自由に変える事ができる。普通、A と B が関係する化学反応は１種類ではない。多数の化学反応がおきうる場合、そのうち、最も反応速度が速い化学反応が最も大量に進行する。例えば、 A + B → C （反応速度定数k_C） A + B → D （反応速度定数k_D） A + B → E （反応速度定数k_E） k_C、k_D、k_Eのうち、k_Eが最大なら生成物の大部分は E である。つまり、触媒により自由自在に特定の反応のみを起こす事ができる。生命は触媒により特定の化学反応のみを必要な時間と場所で引き起こすように組立てられた複雑な系であるとも言える。その触媒とは、DNA に配列情報が保存されているタンパク質である。

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学籍番号

氏名

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コンピューター・グラフィックスの用語

○分子表面（molecular surface、Connolly surface）分子に接する半径 0.14 nm 程度の球の内接面

○溶媒接触表面（solvent accessible surface）分子に接する半径 0.14 nm 程度の球の中心点が作る面 ○slab mode（clipping）ｚ軸方向に垂直な平面（clipping plane）を考える。それより手前（あるいは奥）だと画像が切り取られる ○depth que ｚ軸方向に奥だと、雲がかかったように画像が薄れていく ○画面の x、y、z 軸の定義画面の面内の水平方向右側が x 軸方向画面の面内の垂直方向上側が y 軸方向画面の面に垂直で手前側が z 軸方向

○CPK カラー（Corey, Pauling and later improved by Kultun）

通称 CPK モデルと呼ばれるプラスチック製の分子模型で採用されている色分け C が黒（または灰色）、 O が赤、N が緑、H が白、P が黄色、S が暗い黄色である

セリンプロテアーゼ

セリンプロテアーゼは、アミノ酸の１つセリンを触媒部位にもつ一群のタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）の総称で、キモトリプシンなど動物由来の酵素とサブチリシンなど微生物由来のものが良く知られている。特にキモトリプシンを代表とする一群には、キモトリプシンやトリプシンやエラスターゼなどの消化酵素のほかトロンビンなど血液凝固関連の酵素が知られている。キモトリプシンのアミノ酸配列の中で、His57 と Asp102 と Ser195 が特に重要な触媒トライアード（triad）である。右図はＸ線解析で決定されたその立体構造の触媒部位付近の拡大図である。描画には PDB ファイルの 1T8L を使用した。水素原子はＸ線解析では決定できないので、表示してない。アミノ酸配列にほとんど相同性のないセリンプロテアーゼでも、このトライアードは必ず共通してて、図に示された相対位置に配置している。また、この他、Gly193 と Asp194 のＮ原子はオキシアニオンホールと呼ばれる重要な部位である。

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セリンプロテアーゼの触媒機構

（1）アシル20_{中間体の形成（酸塩基触媒）}21

（2）アシル中間体の脱アシル化

セリンプロテアーゼの特徴

１．Asp、His、Ser の触媒トライアド（catalytic triad）が存在する。

２．オキシアニオンホール（oxyanion hole）と呼ばれるポケット状の構造から四面体遷移状態のＯが水素結合を受ける。３．基質（切断されるペプチド）とセリンプロテアーゼはおもに主鎖間に水素結合が形成される。４．側鎖は特異性ポケット（specificity pocket）の中におさまる。

20 _{アシル基とは R-CO-という化学構造のこと。R は炭素と水素のこと。} 21 _{（１）のアシル化の段階について、「電荷リレー（charge relay）システム」という仮説があり、今は否定されている。}

これは下図のように「Asp に水素結合を通して His の水素が引き抜かれる。その His に対して Ser の水素が引き抜かれ、結局、ペプチドは Ser の O-により攻撃され、His の水素をもらって切断される。His がプロトン化されず、かわりに Asp がプロトン授受をする。」と主張するものである。なお、His が一度 Ser の H をうけとって、それをペプチドの N にリレーするという部分は昔も今も同変わらない。

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演習課題

I. セリンプロテアーゼ＋阻害剤の立体構造ファイルのコピーまず、端末ウィンドウを起動して、次の UNIX コマンドを実行し、演習用の PDB ファイルを自分のホームディレクトリの中にコピーする。 cp ~yoneda/bms/1t8l_cut_addH.pdb ~ ただし、1t8l の l は英字のエルである。1t8l_cut_addH.pdb が自分のホームディレクトリ中にコピーされたはずなので、次のコマンドを入力して確認する。 ls ~ less コマンド22_{を用いて、1t8l_cut_addH.pdb がどのような内容なのか、確認しておこう} less 1t8l_cut_addH.pdb II. 立体構造の描画次のコマンドを入力して、rasmol により立体構造を描画する。 rasmol 1t8l_cut_addH.pdb キモトリプシンの全体構造は１本のペプチド鎖が２つのドメイン（立体構造上の２つの固まり）に分かれ、それぞれ、２次構造はギリシャ鍵、立体構造は β バレル構造（β シートでできた樽型、筒型）になっている。活性部位は２つのドメインの境界にある。コマンドを１つずつ入力し、画像がどのように変化するか？そのコマンドがどのような効果を与えるコマンドなのか？を考えながら、全体の画像を作ろう。23 background white ribbons on wireframe off color structure

select 102:a or 57:a or 195:a

Display メニューから、Ball & Stick を選択 color cpk

22_{less コマンド} スペースで改ページ、j で次の行、k で上の行、q で終了である。/文字列/を入力することにより、その文字列が検索される。その後、n を入力すると、もう一度、HETATM が再検索が行われる。 23 _{使用している X 線座標 1t8l_cut_addH.pdb には、阻害剤ペプチドが結合している。そのため、ペプチド結合の切断反} 応は起こっていない（もし、反応が起こっていたら、分解されて離れるので X 線解析はかなり難しい）。ペプチド結合が切断される直前の構造が示されている。

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zoom 300 center 195:a

select within(8.0, 195:a) and *:b wireframe on

wireframe 50 color cpk

select 193:a or 194:a wireframe on

wireframe 50

Display メニューから、Ball & Stick を選択 color cpk

slab on

Ctrl キーを押しながら、左ドラッグして、クリッピング平面を移動 III. 原子間距離の測定

１）カタリティック・トライアドとオキシアニオンホールが分かりやすく表示させる。その後、 Export メニューから、Sun Raster 形式を選んで画像を保存する。ファイル名は work.sun とする。その後、もう一つ端末ウィンドウを開き、gimp work.sun というコマンドを入力して、画面に work.sun を表示する。gimp の機能を用いれば、学籍番号と氏名を記入する事ができるので記入して、印刷する。

注）プリンターが１ページ印刷するのに数分かかる。印刷ボタンを１回クリックしたら、何もしないでしばらく待つこと。即座に印刷ページが出てこないからといって、何度もクリックしないこと。２）次の水素結合距離を調べる。結合距離を調べるには、Settings メニューの Pick distance を選んでから、２つの原子をクリックする。

Gly193A の N --- Met15B の O Met15B の CA --- Ser195A の OG His57A の NE2 --- Ser195A の OG His57A の ND1 --- Asp102A の OD1 His57A の ND1 --- Asp102A の OD2 IV. レポート提出

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ウイルス外殻蛋白質

ウイルスは、そのライフサイクルのほとんどの時期において宿主細胞中に生息する。しかし、宿主細胞を脱出して外界を移動して感染増殖する時期も必要であり、ウイルスは直径数十ナノメートルかそれ以上の大きさのウイルス粒子（Virion）と呼ばれる形態をとる。ウイルス粒子は、基本的には、ウイルス核酸遺伝子(RNA か DNA のどちらか１種)、それを保護するための外殻タンパク質（capsid）、さらにその外側の脂質エンベロープ（envelope、外套膜）からなる。エンベロープ中には様々な機能をもつスパイクタンパク質が混入している。脂質でへだてられた２重の外殻タンパク質をもつウイルス粒子もある。逆に、エンベロープをもたず外殻タンパク質と核酸遺伝子だけからなるもっと簡単なウイルス粒子も多い。ウイルスは多様であり、ウイルス粒子の共通した特徴を述べるのは簡単ではないが、外殻タンパク質がもつ対称性に関しては、20 世紀半ばから詳細な研究がある。

ウイルス外殻タンパク質の対称性についての

Crick and Watson の数学的予測

ウイルス粒子のエンベロープは宿主細胞の膜をウイルスがまとっているものだが、外殻タンパク質はウイルス遺伝子中の遺伝情報を宿主のタンパク質合成機構が翻訳したものである。一般にウイルスの核酸遺伝子は小さく、その遺伝情報の大きさも限られているので、ウイルスは同一の小さな単位タンパク質を多数産生し、それらの集合体として外殻タンパク質を作るという戦略を採用している。多数の同一のタンパク質単位から効率的かつ正確に外殻タンパク質全体が構成されるためには、タンパク質単位間の接触様式も同一であるはずであり、外殻タンパク質全体は対称性をもつはずである。このことに Crick and Watson が最初に気づいた（1956 年）。彼らは、「内部が空洞の対称的な分子集合体には、どのようなものが可能か？」という問題を数学的に検討して、外殻タンパク質が、らせん対称性か立方対称性のどちらかに分類され、立方対称性はさらに正 4 面体対称性、正６面体対称性、正 20 面体対称性のどれかであると予測した24_。

らせん対称性

らせん対称性は回転とその回転軸方向への並進の合成により分子集合した集合体の対称性である 25_{。簡単にらせん対称性の分子集合体の模式図を作るには、左図のように、平行移動（並進対称性）} により分子を多数複製して平たい紙の表面を埋める。つぎに、右図のようにその紙を円筒状に折り曲げ、ややずらして紙の両端をつなげばよい。図の隣接分子間の結合（接触面）は、A-D、B-E、C-F であって、すべての分子で共通である。

24 _{もっとも、これらのすべての対称性が実際のウイルスに見られるわけではなく、これまで発見された外殻タンパク質対} 称性は、らせん対称性と正 20 面体対称性、およびその変形や組み合わせのみである。 25 _{長いらせん対称性外殻タンパク質は実際には直線ではなく、曲がって丸まったりする。したがって、比較的大きめのら} せん対称性の外殻タンパク質は、電子顕微鏡では、しばしばエンベロープも含めた全体の外形が丸っぽく見えることがある。

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正

20 面体対称性

正 20 面体は、下図のように正３角形が 20 面あつまってできた立体である。正 20 面体には、５回回転軸（図の正３角形の頂点を通る）が 12 本、３回回転軸（図の正３角形の頂点を通る）が 20 本、２回回転軸（図の正三角形の辺の中点を通る）が 30 本存在する。このような対称性を正 20 面体対称性（icosahedral symmetry）と呼ぶ。１つの正３角形の３つの頂点は互いに同一の環境にある。したがって、１つの正３角形は３つの同一の図形26_{から構成することができる。正３角形は 20 枚あるから、60} 個の同一の図形で全体が構成される。その図形を非対称単位27 と呼ぶ。非対称単位たちは完全に同一の構造をもち、回転されていて向きと位置が異なるだけである。正 20 面体とよく似た立体に正 12 面体というのもあって、これは正５角形が 12 面あつまってできた立体である。正 12 面体にも５回回転軸が 12 本、３回回転軸が 20 本、２回回転軸が 30 本存在する。したがって、対称性ということに関しては、正 20 面体も正 12 面体も同じ正 20 面体対称性であり、両者の違いは表面の形状が異なっているということだけである。一般に、5 回回転軸、３回回転軸、２回回転軸が正 20 面体と同様に配置されてさえいれば正 20 面体対称性であり、ウイルス外殻タンパク質のように表面が凸凹していてもかまわない。

準等価仮説

20 世紀の半ば頃から電子顕微鏡の進歩により正 20 面対称性のウイルス外殻タンパク質が多数見つかった。対称性から、それら正 20 面体対称性ウイルス外殻タンパク質は必ず非対称単位 60 個の集合体でなければならない。しかし、同時に、生化学的実験により１つの外殻タンパク質を構成するタンパク質が 60 個ではなく、その倍数であることが多いということも発見された。したがって、正 20 面体対称性ウイルス外殻タンパク質の非対称単位１つは、しばしば同じタンパク質複数個から構成されているということである。しかし、非対称単位１つの中に複数の同じタンパク質を配置するのは簡単ではない。一見、外殻タンパク質を構成するタンパク質たちは非対称単位の中の場所に応じて大きく変形しなければならないと思われる。ところが、Caspar and Klug は、準等価（quasi-equivalence）仮説を提案し (1962 年)、タンパク質の構造が変化せず、また、タンパク質間の接触の様式がたいして変化しなくても、一つの非対称単位中に複数のタンパク質を配置することができると主張した。準等価仮説を具体的に説明するために、まず、下図のように正３角形（黒い正３角形ではなく、細い線で囲まれた大きな正３角形）で区分された平坦な紙を考えよう。１つの正３角形の中には３個の等価な分子が存在し、３つの分子は 120°の回転により互いに関連づけられている。分子たちは完全に同一構造であり、また隣接分子間の相互作用（ボンド）

26 _例えば、 _{のような四角形（立体的には四角錐）にとることもできる。非対称単位は正 3 角形を等しい同じ形状} で 3 分割するものでありさえすればよく、以外の形にも設定できる。 27 _{対称性をもたない最大の空間の単位という意味で、非対称単位という。}

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はすべての分子に対して同一である。図の場合、分子たちは A-E、B-C、D-D のボンドをもっている。正３角形の中心は３回回転軸、辺の中点は２回回転軸になる。３回回転軸をつないでいくと分子６個からなる太線の正６角形ができる。図の太線は正３角形の辺の垂直２等分線たちである。正６角形の中心は６回回転軸となる。この平面を正 20 面体対称性の構造に折りたたむためには、下図のように均等に配置された 12 個の６回回転軸に切れ目を入れて、60°の開きをもつ２直線にはさまれた部分を切り取るか、重ねるかして、５回回転軸にすればよい。このように作成した立体は 12 個の５回回転軸をもつので、正 20 面体対称性となる。分子の位置関係をはっきりさせたいので、別の図を使って分子１つ１つをもっとはっきりあらわすことにする。下図では、点線で描かれた小さな正３角形で平面が区分されている28_{。この小正３角形は上図の正３角形の３分の１} の大きさで、分子１個に相当している。小正３角形６個で正６角形が作られ、その正６角形で紙面がうめつくされる。上図とまったく同様にして、12 個の正６角形の中心に切れ目を入れて紙を切って折り曲げれば、正 20 面体対称性の模型が作れる。どこに切れ目を入れるかによって模型の形は当然異なるので、切れ目の相対的な位置関係を明確に把握しなければならない。そこで、ある１つの切れ目の頂点を原点 O として、O から下図のように２本の座標軸 h と k を伸ばす。ただし、h と k は 90°でなく 60°傾いている。隣りあう正６角形の中心点間の距離を１とする。したがって、当然、どの正６角形についても、その中心の位置座標 h とｋは整数である。下図の展開図では、 (h, k) = (1, 1) なる点に切れ目の頂点を入れている。切れ目の頂点は均等に配置するので、他にも、(h, k) = (-1, 1), (1, 1), (3, 0)などが切れ目の頂点である。これらの切れ目の頂点は 5 回軸（5 回回転軸）になる。５回軸を結ぶ大きな正３角形を考えると、その中に小正３角形が３×Ｔ個収まる29_{。ただし、 T = h}2 _{+ hk + k}2_{である。５回} 軸を結ぶ大きな正３角形の中に小正３角形が３×Ｔ

28 _{「図. T=3 の紙モデルの作成」の中の点線で書かれた小さな正３角形は、「図. 正３角形で区分された平面」の黒く塗} りつぶされた正３角形に相当する。 29 _{簡単な幾何学の計算である。時間があれば、自分で計算してみよう。}

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2014 年夏学期北里大学理学部生体分子構造学米田茂隆 25 個収まる以上、紙モデル全体には 60×Ｔ個の小正３角形が収まる。この T のことを、T ナンバー（T-number、triangulation number、三角分割数）と呼ぶ。下図は、T = 3 の図である。T = 3 のとき、作られる紙モデルはもっとも単純な表面をもち、正２０面体そのものである。Ｔナンバーの定義式から、下の表のように、T ナンバーのとりうる値は、1，3，4、7...のとびとびの整数に限られる。ｈかｋのどちらかがゼロの場合は「P=1 型」、ｈとｋの値が等しいときは「P=3 型」、それ以外の場合を「ねじれ型」と表記する。ねじれはさらに右回りと左回りの２種類に分けられる。これらの分類に応じて全体の表面の凸凹の分布が異なっている。この分類は紙モデルだけでなく実際のウイルス外殻タンパク質の表面を明確に特徴づけるものでもある。表：T ナンバーと正 20 面対称性の分類 P=1 1 4 9 16 25 P=3 3 12 27 ねじれ 7 13 19 21 a) 正 20 面体対称性中の６０個のタンパク質。各タンパク質は完全同一構造、完全同一相互作用。 b) 正 20 面体に 180 個のタンパク質を入れたもの。各オタマジャクシは完全同一構造だが、微妙に相互作用が異なり（あるいは構造も）、A, B, C の３つに分類される。正二十面体対称性には６回回転軸はありえないことなどに留意して、A, B, C のタンパク質を区別せよ。これは T=3 である。 c) この図のみ平面図形である．同一のタンパク質３つをくっつけて正三角形を作っていった。各タンパク質は構造相互作用とも完全同一である。 d)と e) c に切れ目を入れて、T=4 で折り畳んだもの。各タンパク質の相互作用は微妙に異なる。上述したように、正 20 面対称性ウイルス外殻タンパク質を構成するタンパク質が準等価な場合、全体はタンパク質 60×T 個からなる。各タンパク質はほぼ同じ構造でありえるが、タンパク質間の結合の様式が各タンパク質間で微妙に異なる。また、疑似６回軸やそれ以外の疑似対称軸が多数できる。５回軸だけでなく擬似６回軸のまわりも、準等価性からほぼ同じ形状を示しているように見え、出っ張りとしてウイルス外殻タンパク質の外形に現れる。そのウイルス外殻タンパク質の形態的な単位をキャプソメア（capsomer）と言う。キャプソメアの形状と分布はウイルスを特徴づけるものであり、電子顕微鏡写真のようなおおざっぱな画像からでも、キャプソメアの分布を調べて T ナンバーを決定することができる。

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問題 1. 次のウイルス外殻タンパク質の画像について、５回回転軸や６回回転軸たちはどこにあるか？ 2．ｈとｋの値はいくつか？ 3． T ナンバーはいくつか？30 （１）（２）（３）（４）ヒント）右下の（４）の画像でキャプソメアがはっきりみえないのは、きわめて簡単な構造でキャプソメアの個数が少ないから。まず、どこに５回回転軸があるかをはっきり考えると分かりやすい。ちいさな凸凹をキャプソメアと誤解して難しく考えすぎないように。

30 （１）Ｔ＝１３，（２）Ｔ＝４，（３）Ｔ＝３，（４）Ｔ＝１

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ピコルナウイルス

ピコルナウイルス（picornavirus family）の pico は「小さな」という意味、rna は核酸の RNA である。ピコルナウイルスは「RNA 遺伝子を持つ小さなウイルス」の１つの科を指す。ピコルナウイルスは、RNA１本鎖の遺伝子と外殻タンパク質からなるエンベロープなしの小さなウイルス粒子を形成する。下のリストのようにポリオウイルス、ライノウイルス、口蹄疫ウイルス、エコウイルスなどがピコルナウイルス科に属し、どれもあまり致死的ではない疾病を発病する。ピコルナウイルス科の属（genus） apthovirus 属口蹄疫ウイルス（血清型７つ）など

cardiovirus 属 mengovirus, encephalomycarditis viurs など

enterovirus 属 poliovirus, coxsackievirus, echovirus, enterovirus など rhinovirus 属 rhinovirus など

その他 equine rhinovirus, cricket paralysis virus など

ピコルナウイルスの外殻タンパク質は、４本のペプチド鎖（VP1、VP2、VP3、VP4）からなるが、そのうちの特に短い VP4 は VP2 から切断されたものである（VP4 が切断される前の VP2 を VP0 と呼ぶ）。下図は、ピコルナウイルスのタンパク質が転写後にプロセシングを受けて、個々のタンパク質に分かれる過程を示したものであるが、VP0 が切断されて VP2 と VP4 ができるのは、ウイルス粒子の分子集合の完成後に内部 RNA の触媒作用によるものである。 VP1、VP2、VP3 はアミノ酸配列の相同性が高く、また構造的にもどれも同じスイスロール・バレル構造をもっているので、同一タンパク質と見なしてしまうと、ピコルナウイルスの外殻タンパク質は擬似的にＴ＝３型の対称性をもつとも言える。こういう対称性は、擬似Ｔ＝３型（pT=3 型）と呼ばれる。下図は、ピコルナウイルス中での VP1、VP2、VP3 の配置である。左）全体構造の中での VP1、VP2、VP3 の配置。この３つがまず最初に集合する。右）人間のライノウイルス 14 型（リボン図）と薬物 WIN52084s（スペースフィル図）が結合したＸ線構造。左図の斜線部分に相当している。下方向が外殻タンパク質の中心点、上方向が外殻タンパク質表面である。

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ピコルナウイルスの３つの鎖はどれもロールケーキ・バレル（swiss roll barrel）構造をもつ。スイスロール・バレル構造は、下図のように１本のペプチド鎖中に８本のβストランド部分が存在して、それが４本ずつ水素結合して２枚の逆平行βシートを形成したものである。８本鎖逆平行βバレル、ゼリーロール・バレル構造とも言われる。ピコルナウイルス科に限らず、ほとんど全てのウイルス外殻タンパク質の単位タンパク質はスイスロール・バレル構造をもつ。つまり、スイスロール・バレル構造をもつタンパク質が多数分子集合して、さまざまなＴナンバーの値をもつウイルス外殻タンパク質全体構造が作られる。８本のβストランドにはアルファベット順に B から I までの名称がつけれる。その間のループについては、例えば、G ストランドと H ストランドの間のループは GH ループと呼ばれる。ループの構造はウイルスにより大きく異なる。ウイルス粒子は、自発的に自己集合（assembly, morphogenesis）して形成される。意思をもたないタンパク質や核酸がどのようにして自発的に集合するかということは、生命科学の大きな謎である。これまでのところ、ピコルナウイルス外殻タンパク質の自発的分子集合は次の段階に分かれることが知られている。 1-0）ウイルスのポリプロテイン P1 が２回切断されて、 VP0、VP1、VP3 ができる 1-1）VP0、VP1、VP3 からプロトマー（I-protomer）が形成される（5S 蛋白、S 抗原) 1-2）５つのプロトマーが集合してペンタマーが形成される（14S 蛋白、N,H 抗原） 1-3）12 個のペンタマーが集合して空洞外殻タンパク質（natural empty capsid、NEC）が形成される（70S 蛋白、 N 抗原） 1-4）1-2)のペンタマーと RNA が直接に集合して、あるいは、1-3)の NEC の中に RNA が進入して、ウイルス粒子前駆体（provirion）が形成される（N 抗原） 1-5）大部分の（右図のように、すべてではないかも知れない）VP0 が加水分解して、VP2 と VP4 に切断され、感染性をもつウイルス粒子（virion）が完成する（155S 蛋白、 N 抗原）

外殻タンパク質の前駆体仮説（Procapsid hypothesis）

ピコルナウイルスの外殻タンパク質中に RNA が入る仕組みは次の２つのどちらかであると思われる。１）threading model（糸通し仮説）

空洞の外殻タンパク質（natural empty capsid, NEC）の穴から RNA が入り込む２）transfiguration model（構造変化仮説）図．４つのタンパク質 VP1、VP2、 VP3、VP4 からできているピコルナウイルス外殻タンパク質表面。この図では、右上のプロトマーの VP0 が VP2 と VP4 に切断されてないので 031 と表されている。

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2014 年夏学期北里大学理学部生体分子構造学米田茂隆 29 RNA が procapsid を取り巻いている。この構造はなにかのチャネルにフィットしていて、そこを通過することにより、部分単位の協調的再配向が引き起こされ、RNA が内部に入り、最後の VP2 と VP4 の切断がおきて成熟する。ピコルナウイルスは複雑な感染増殖のライフサイクルを生きる。中でも、ウイルス粒子の自発的自己集合、抗体からの逃避、宿主レセプターの識別、宿主への吸着、脱殻は重要な過程である。図．ライノウイルスと宿主細胞表面のレセプターとの結合と感染メカニズム図．ライノウイルスのキャニオン（渓谷）仮説。「宿主細胞のレセプターに結合するライノウイルスの部位は、外殻タンパク質表面のくぼんだキャニオンにある。そのため、宿主の抗体が直接には結合することができない。そのため、重要なキャニオン以外のアミノ酸残基が突然変異すれば、抗体からの攻撃から逃れることができるし、宿主レセプターとの結合は維持される」図．ライノウイルスのポケット因子。ライノウイルス外殻タンパク質にはキャニオンの下にポケット（空洞）があって、ライノウイルスが宿主細胞を脱出する際に宿主細胞の生体膜の分子の断片がポケットの中にはまり込む。これをポケット因子という。ポケット因子をはめ込んだ外殻タンパク質は安定化する。別の宿主細胞に吸着した際に、ポケット因子は放出され、外殻タンパク質が不安定化し、内部 RNA が宿主細胞の中に放出される。

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準等価仮設が成り立たないウイルス

パポバウイルス（papovavirus）はポリオーマウイルス、SV40、パピローマウイルスなどを含む。その外殻タンパク質は電子顕微鏡では、一見、T=7 型であり、12 個の５回回転軸、および、60 個の擬似 6 回回転軸をもち、キャプソメアの数は 72 個である。しかし、下図のｂのように、粗いＸ線解析で、６回回転軸の中心にタンパク質単位５量体からなる５回対称性をつキャプソマーが存在するという異常が発見された。図. ポリオーマウイルスの電子顕微鏡写真と模型。a と b は見た方向が異なる。下図はそれを分かりやすく示したもので、５回回転軸上だけでなく６回回転軸の上にも５量体が存在し、したがって、準等価性が壊れている。必然的にパポバウイルスのプロトマーは隣接したプロトマーと状況に応じて複数の種類の接触の切り替えをしなければならない。 SV40 とポリオーマウイルスの精度の高いＸ線解析から、下図のように各タンパク質単位から伸びているアームがタンパク質単位の位置に応じて構造変化を起こし、対称的でない様々な相互作用をすることが示された。タンパク質単位は長い C 末端のアームをもち、それが隣接したタンパク質単位の方に遠く伸びて、そのβシートと水素結合をして実質的にそのβストランドを１本増やしている。そのアームは侵入先のタンパク質単位のＮ末端により固定される。

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2014 年夏学期北里大学理学部生体分子構造学米田茂隆 31 下図は SV40 の外殻タンパク質全体構造の中で５量体を構成した部分を抜き出したものであるが、その C 末端が長く伸びて、似たような構造をしていることが分かる。この５量体が、右上図のように集合して、まわりの６個の５量体と相互作用する。すなわち、他のウイルス外殻タンパク質とは異なり、パポーバウイルス外殻タンパク質はタンパク質単位間の相補的な接触面間のボンドで構成されるというより、各タンパク質単位の C 末端のアームでしばられたものといえる。

HIV ウイルス

最近構造決定された HIV ウイルス外殻蛋白質（Nature, 2013）も疑似等価を満たしており、６回軸が広がる中に５回軸が点在している事が分かる。ただし、５回軸は均等に分布しておらず、かなりランダムに位置しているように見える。

北里大学理学部生体分子構造学 ( 物理学科 & 生物科学科 3 年生 ) 米田茂隆 北里大学理学部物理学科 神奈川県相模原市南区北里 生体分子の構造を決定 解析するための大規模研究施設 ( 左 )SPrin