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Glutathione Sepharose 4B, 4FF を用いた
GST 融合タンパク質のバッチ精製プロトコール
1、予め準備する試薬と装置
・ Glutathione Sepharose担体 製品名 包装単位 コード番号 Glutathione Sepharose 4B 10 ml 17-0756-01 Glutathione Sepharose 4B 3×10 ml 72-0239-03 Glutathione Sepharose 4B 5×10 ml 72-0239-05 Glutathione Sepharose 4B 100 ml 17-0756-05 Glutathione Sepharose 4B 300 ml 17-0756-04 Glutathione Sepharose 4 Fast Flow 25 ml 17-5132-01 Glutathione Sepharose 4 Fast Flow 100 ml 17-5132-02 Glutathione Sepharose 4 Fast Flow 500 ml 17-5132-03 必要な担体量は、下記の表を参考にして計算してください。 表1. GST 融合タンパク質の発現に必要となる培養液・試薬の量 精製したいGST 融合タンパク質量（mg） 50 10 1 培養量（L） 20 4 0.4 細胞破砕後の液量（ml） 1000 200 20 Glutathione Sepharose 担体量（ml）※1 10 2 0.2 1 回の洗浄に必要な結合バッファー（PBS）（ml）※2 100 20 2 1 回の溶出に必要な溶出バッファー（ml）※3 10 2 0.2 ※1 ： Glutathione Sepharoseは、50％懸濁液（スラリー）で用います。50%スラリーの液量は、担体量の2倍になりま すので、ご注意ください（50％スラリー1 mlには、担体が0.5 ml含まれます）。 ※2 ： 1回の洗浄に必要な量です。本プロトコールでは、1サンプルあたり3回の洗浄を行います。 ※3 ： 1回の溶出に必要な量です。本プロトコールでは、1サンプルあたり4～5回の溶出を行います。 ・ 結合バッファー: PBS (140 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4), pH 7.3 ・ 溶出バッファー: 50 mM Tris-HCl, 10 mM reduced glutathione, pH 8.0※結合バッファーおよび溶出バッファーに、1～10 mMのDTTを入れると、GST融合タンパク質とGlutathione Sepharoseとの結合性が改善されることがあります。
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2、担体の準備
Glutathione Sepharoseは約75％の懸濁液（スラリー）状態で出荷されます。精製を行う前に、下記 のプロトコールに従って、50％スラリーに調製します。 1、スラリーの均一化 Glutathione Sepharose の入った容器を振り、担体を再懸濁します。 2、担体量の計算 表1 を参照して、精製に必要な Glutathione Sepharose の量を計算し、広口 のピペットやメスシリンダーを使って必要量のスラリーを適切な容器に移し ます。 例） Glutathione Sepharose は 75 %懸濁液（スラリー）状態で出荷されるため、担体が 2 ml 必要な場合は、ボトルの中から 2.66 ml のスラリーを取ります。 3、エタノールの除去 500×gで5分間、遠心して担体を沈降させます。 上清を注意深く除去します。 4、洗浄 Glutathione Sepharose 担体 1 ml（ステップ2 で用いた 75 %スラリー1.33 ml に相当）に対して10 ml の PBS を加え、転倒混和してスラリーを均一にします。 例） 担体を 2 ml（スラリー2.66 ml 相当）用いた場合、20 ml の PBS を加えます。 500×g で 5 分間、遠心して担体を沈降させ、上清を注意深く除去します。 NOTE：エタノールが残っていると、タンパク質の精製に影響を与える恐れがあるため、エタノールが完全に 除去できるまで、この操作を繰り返します。 5、平衡化 Glutathione Sepharose 担体 1 ml（ステップ2 で用いた 75 %スラリー1.33 ml に相当）に対し1 ml の PBS を加え、転倒混和してスラリーを均一にします。 例） 担体を 2 ml 用いた場合、2 ml の PBS を加えます。 NOTE：この操作により、Glutathione Sepharose のスラリー濃度は 50%になります。 500×g 5 min 500×g 5 min3
3、 GST融合タンパク質のバッチ精製プロトコール
1、担体とサンプルの混和 「2.担体の準備」で準備したGlutathione Sepharose の 50 %スラリー2 ml（担 体量1 ml）を、培養液から回収した菌体の抽出液 100 ml に加えます。 2、 GST 融合タンパク質 と担体の反応 室温で30分間、ローテーターなどで穏やかに転倒混和します。 NOTE：この時点で、洗浄や溶出のステップを簡略化するために、融合タンパク質が吸着した担体を適切 なサイズのカラム（PD-10 Empty Column17-0435-01など）に充填することもできます。 3、担体の添加 500×gで5分間遠心し、上清を除去します。 NOTE：上清は捨てずに取っておきます。 4、洗浄 担体の10倍量（50%スラリーの5倍量）のPBSを加え、転倒混和します。 500×gで5分間遠心し、上清（洗浄画分）を除去します。 この操作を2回繰り返します（計3回行います） NOTE：素通り画分や洗浄画分は、精製ステップが完了するまで保存しておきます。担体に対するタンパク 質の結合効率を測定するため、SDS-PAGEなどで分析を行ってください。 ＊ この時点で、プロテアーゼによりGST部分を切断し、目的タンパク質を溶出させることも出来ます（切り出 し精製）。切り出し精製を行う場合は、下記のステップを行わず、「4. プロテアーゼによるGST融合タンパク質 の切り出し精製」に進んでください。 5、溶出バッファーの添加 担体1 ml（50%スラリー2 ml）につき 1 ml の溶出バッファーを加えます。沈降し た担体に結合している融合タンパク質を溶出します。 室温で10分間、ローテーターなどで穏やかに転倒混和します。 6、GST 融合タンパク質 の溶出 500×g で 5 分間遠心し、担体を沈降させて、上清（溶出分画）を新しい遠心チ ューブに移します。 ステップ4～5を2回繰り返します（計3回）。3回の溶出で得られた溶出液をそれ ぞれチェックし、精製タンパク質が含まれている溶出液を保存します。 500×g 5 min 500×g 5 min 500×g 5 min4
4、プロテアーゼによるGST融合タンパク質切り出し精製
【PreScission Proteaseの場合】
「3. GST融合タンパク質のバッチ精製プロトコール」のステップ4までは同一です。ステップ5以降を、下
記の方法で行ってください。 必要な試薬・27-0843-01 PreScission Protease 500 units
・PreScission切断バッファー：50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM DTT、pH 7.5
PreScission Proteaseによるタグの切断および精製
※GST融合タンパク質8 mgが担体1 mlに結合すると仮定しています。 5、切断バッファーへの平 衡化 担体の10倍量のPreScission切断バッファーで、Glutathione Sepharose担体を 再懸濁します。 6、プロテアーゼ溶液の調 製Glutathione Sepharoseの担体量1 mlに対し80 μl（160ユニット）のPreScission Proteaseと、920 μlのPreScission切断バッファーの混合液を5℃で調製します。
7、担体の添加 500×gで5分間遠心し、上清を除いてから、「ステップ6.プロテアーゼ溶液の調 整」で用意したPreScission Protease溶液を、Glutathione Sepharoseに加えま す。 懸濁液を穏やかに振盪または転倒混和します。 8、プロテアーゼ反応 5℃で4時間反応させます。 9、溶出バッファーの添加 500×gで5分間遠心し、上清を注意深く別のチューブに移します。 NOTE：目的タンパク質は上清に含まれますが、融合タンパク質のGST部分とPreScission Proteaseは Glutathione Sepharose担体に結合した状態で沈降します。 500×g 5 min 500×g 5 min
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【Thrombinの場合】
「3. GST融合タンパク質のバッチ精製プロトコール」のステップ4までは同一です。ステップ5以降を、下
記の方法で行ってください。 必要な試薬 ・27-0846-01 Thrombin 500 unit ＊Thrombin溶液は、あらかじめ4℃に冷やしておいた0.5 mlのPBSに500ユニットのThrombinを溶 かし、穏やかに撹拌します。活性を保つために、溶液を分注し-80℃で保存します。・Thrombin切断バッファー：PBS（140 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、1.8 mM KH2PO4、pH 7.3）
Thrombinによるタグの切断および精製
※GST融合タンパク質8 mgが担体1 mlに結合すると仮定しています。 5、切断バッファーへの平 衡化 担体の10倍量のPBSで、Glutathione Sepharoseを再懸濁します。 6、プロテアーゼ溶液の調 製Glutathione Sepharose担体1 mlに対し80 μl（80ユニット）のThrombinと920 μl のPBSを混合します。 7、担体の添加 500×gで5分間懸濁液を遠心し、上清を除いてから、「ステップ6.プロテアーゼ 溶液の調整」で用意したThrombinを含む溶液を、Glutathione Sepharoseに加 えます。 懸濁液を穏やかに振盪または転倒混和します。 8、プロテアーゼ反応 室温（22～25℃）で2～16時間反応します。 9、溶出バッファーの添加 500×gで5分間遠心し、上清を注意深く他のチューブに移します。 NOTE：溶出液には目的タンパク質とThrombinが含まれていますが、融合タンパク質のGST部分は Glutathione Sepharose担体に結合した状態で沈殿します。
NOTE：Thrombinによる消化反応後に、HiTrap Benzamidine FF（high sub）を用い、ステップ9の上清から
Thrombinを除去することができます（「オプション：HiTrap Benzamidine FF（high sub）を用いた
ThrombinおよびFactor Xaの除去」参照）。
500×g 5 min
500×g 5 min
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【
Factor Xaの場合】
「3. GST融合タンパク質のバッチ精製プロトコール」のステップ4までは同一です。ステップ5以降を、下
記の方法で行ってください。 必要な試薬 ・27-0849-01 Factor Xa 400 unit＊Factor Xa溶液：超純水をあらかじめ4℃に氷冷しておき、400ユニットのFactor Xaを溶かして（終 濃度1ユニット/μl）、穏やかに撹拌します。活性を保つために、溶液を分注して-80℃で保存します。 ・Factor Xa切断バッファー：50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、1 mM CaCl2、pH 7.5
Factor Xaによるタグの切断および精製
※GST融合タンパク質8 mgが担体1 mlに結合すると仮定しています。
5、切断バッファーへの平
衡化
担体の10倍量のFactor Xa切断バッファーでGlutathione Sepharose担体を再 懸濁します。
6、プロテアーゼ溶液の調
製
Glutathione Sepharoseのベッド体積1 mlに対し80 μl（80ユニット）のFactor Xa と920 μlのFactor Xa切断バッファーを混合します。 7、担体の添加 500×gで5分間懸濁液を遠心し、上清を移してから、沈降したGlutathione SepharoseにFactor Xa溶液を加えます。懸濁液を穏やかに振盪または転倒混 和します。 8、プロテアーゼ反応 室温（22～25℃）で2～16時間反応します。 9、溶出バッファーの添加 500×gで5分間懸濁液を遠心して、上清を注意深く別のチューブに移します。 NOTE：溶出液には目的タンパク質とFactor Xaが含まれていますが、融合タンパク質のGST部分は Glutathione Sepharose担体に結合したまま沈降します。
NOTE：Factor Xaによる切断後に、HiTrap Benzamidine FF（high sub）を用い、溶出したタンパク質から
Factor Xaを除去することができます（「オプション：HiTrap Benzamidine FF（high sub）を用いた
ThrombinおよびFactor Xaの除去」参照）
500×g 5 min
500×g 5 min
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5、切り出し精製後の担体の再生
「4.
プロテアーゼによるGST融合タンパク質の切り出し精製」を行った後、担体に結合したGSTおよび
PreScission Proteaseを溶出することで、担体を再利用できます。 1、溶出バッファーの添加 担体1 ml（50 %スラリー2 ml）につき 1 ml の溶出バッファーを加えます。沈降し た担体に結合している融合タンパク質を溶出します。 室温で10分間、ローテーターなどで穏やかに転倒混和します。 2、GST の溶出 500×g で 5 分間遠心し、担体を沈降させて、上清（溶出分画）を新しい遠心チ ューブに移します。 ステップ1～2を2回繰り返します（計3回） 3〃再平衡化 （または保存） （ただちに次の精製に利用する場合） 結合バッファーで平衡化します。 手順： 「2〃担体の準備」の手順4～5を行います。 （担体を保存する場合） 超純水に置換後、さらに20％エタノールに置換して冷所保存します。 手順：「2〃担体の準備」の手順4～5 を、超純水を使用して行います。その後、 同じく手順4～5 を、20％エタノールを使用して行い、4～30℃にて保管してくだ さい。 注意！ 凍らせないようご注意ください。担体は凍結により構造が壊れ、使用 できなくなってしまいます。 500×g 5 min8
オプション：
HiTrap Benzamidine FF（high sub）を用いた
ThrombinおよびFactor Xaの除去
「4.
プロテアーゼによるGST融合タンパク質の切り出し精製」でThrombinまたはFactor Xaを用いた
場合、HiTrap Benzamidine FF (high sub)を用いてプロテアーゼを除去することができます。必要な試薬
・HiTrap Benzamidine FF (high sub)
製品名 包装単位 コード番号
HiTrap Benzamidine FF (high sub) 5×1 ml 17-5143-01 HiTrap Benzamidine FF (high sub) 2×1 ml 17-5143-02 HiTrap Benzamidine FF (high sub) 1×5 ml 17-5144-01 ・結合バッファー：0.05 M Tris-HCl、0.5 M NaCl、pH 7.4
・溶出バッファー：下記のいずれかを選択します。 (1) 0.05 M glycine-HCl、pH 3.0
(2) 10 mM HCl、0.5 M NaCl、pH 2.0
(3) 0.05 M Tris-HCl、0.5 M NaCl、pH 7.4、20 mM p-Aminobenzamidine (4) 8 M Ureaまたは6 M 塩酸グアニジン 下記はHiTrapをシリンジに接続して精製する場合のプロトコールです。 1、コネクターとシリンジの 準備 超純水で満たしたシリンジに下記のルアーコネクターを取り付けます。 ＜ルアーコネクター 1/16”male/Luer female 18-1112-51＞
※HiTrap Benzamidine FF (high sub)に1個付属しています。
シリンジを少し押し、ルアーコネクター先端から水滴が出た状態にして気泡 を押し出します。 2、HiTrap カラムとシリンジ の接続 HiTrapカラムのトップストッパーを外し、HiTrapカラムの入口部分に、シリンジ のルアーコネクター先端部から超純水を何滴か滴下します。 入口が溶液で満たされた状態になったら、ルアーコネクターとHiTrapを接 続します。
9 3、HiTrap カラムの準備 カラム下部のツイストオフエンドを折ります。 NOTE：ねじり切らないように注意してください。 これでHiTrapカラムの準備は完了です。 この後のステップは全て、ルアーコネクターに取り付けたシリンジを用いて平 衡化バッファーやサンプルを添加します。 4、保存バッファーの除去 5カラム体積の超純水をカラムに流し込みます。保存バッファー（0.05 M 酢 酸ナトリウム、pH 4を含む20%エタノール）を除去します。 5、平衡化 5カラム体積の結合バッファーで、カラムを平衡化します。 6、サンプルの添加 サンプルをカラムに添加します。サンプル添加時の推奨流速は、1 mlカラム の場合1 ml/min、5 mlカラムの場合5 ml/minです。 素通り画分を回収して保存します。 NOTE：素通り画分には目的タンパク質が含まれます。 7、洗浄 5～10カラム体積の結合バッファーでカラムを洗浄します。 280 nmの吸収を測定しながら、溶出液にタンパク質がなくなるまで1 mlカ ラムの場合は0.5～1 mlずつ、5 mlカラムの場合は1～3 mlずつ分取します。 NOTE：洗浄画分にもGST融合タンパク質が含まれている可能性があるため、保存しておきます。 8、カラムの再生 5～10カラム体積の溶出バッファーをカラムに流します。 9、平衡化または保存 結合バッファーでカラムを洗浄して、カラムを再使用できる状態にします。 NOTE：すぐに使用しない場合は、2～3カラム体積の超純水を流した後、2～3カラム体積の保存バッファ ー（0.05 M 酢酸ナトリウム、pH 4を含む20％エタノール）を流してから保存してください。
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